阿奇霉素膠囊新版藥典微生物限度檢查方法的建立

劉緒平肖欽欽陳 希張春華李景蓮.江西省藥品檢驗檢測研究院 江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，江西南昌 330029；2.南京軍區(qū)南昌藥品器材供應站，江西南昌 330029

阿奇霉素膠囊新版藥典微生物限度檢查方法的建立

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1.江西省藥品檢驗檢測研究院 江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，江西南昌 330029；2.南京軍區(qū)南昌藥品器材供應站，江西南昌 330029

目的 建立阿奇霉素膠囊微生物限度檢查法并進行方法學驗證。 方法 按《中國藥典》2015年版四部制劑通則1105、1106、1107項下要求進行試驗。霉菌和酵母菌檢查采用平皿法，需氧菌總數檢查采用薄膜過濾法，大腸埃希菌檢查采用薄膜過濾法，采用上述方法對阿奇霉素膠囊各試驗菌進行回收試驗測試及對控制菌檢查方法進行驗證。 結果 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數驗證試驗中各菌的回收比值均符合《中國藥典》2015年版規(guī)定，控制菌檢查方法可行。結論 該方法適用于阿奇霉素膠囊的微生物限度檢查。

阿奇霉素膠囊；微生物限度；平皿法；薄膜過濾法；方法學驗證

阿奇霉素為十五元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素[1]，抗菌譜廣，對流感桿菌、淋球菌、化膿性鏈球菌等細菌具有顯著的抗菌效果[2]，因此對多種常見細菌感染疾病具有良好的抗菌作用[3]。如用于治療敏感細菌引起的鼻竇炎、中耳炎、咽喉炎、肺炎等，用于旅行者腹瀉和其他腸道感染[4]，用于沙眼衣原體及非多種耐藥淋病奈瑟菌所致的尿道炎和宮頸炎，也可與其他藥物一起用于治療瘧疾[5-7]。隨著阿奇霉素在臨床上的應用越來越廣泛，為使臨床用藥更加安全有效，實施微生物限度檢查是確保藥品衛(wèi)生質量的重要途徑[8-9]。

《中國藥典》2015年版的微生物限度檢查法與2010 年版相比其在培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、檢驗方法、微生物限度標準等上都有較大改變。如在進行非無菌產品微生物限度檢查時，需采用適當的方法來消除或抑制藥物的抗菌活性，以保證方法的適用性，2010年版收載方法有稀釋法、薄膜過濾法、中和法、離心沉淀法或幾種方法聯合使用，而《中國藥典》2015年版四部[10]中刪除了離心沉淀法。本研究參考《中國藥典》2015年版四部方法，建立了阿奇霉素膠囊的微生物限度檢查方法，該方法可為其他大環(huán)內酯類抗生素藥物微生物限度檢查法的建立提供參考，同時為藥品檢驗機構及生產企業(yè)建立品種2015年版藥典微生物限度檢查法提供借鑒。

1　儀器與材料

1.1儀器

MLS-3780高壓消毒滅菌柜（日本三洋公司）；1384 4'BSC 生物安全柜（美國賽默飛世爾科技有限公司）；PYX-DHS 細菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；KB400 霉菌培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）。

1.2供試品

阿奇霉素膠囊（批號：151101、160101、160102），由江西保利制藥有限公司提供。

1.3菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]、黑曲霉[CMCC（F） 98003]，以上菌種均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號160119；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號160128；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號160119；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號151222；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號151124；麥康凱瓊液體培養(yǎng)基，批號151102；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。（以上培養(yǎng)基均來源于北京陸橋技術有限責任公司。）

2　驗證方法

2.1試驗菌株菌液制備

取經35℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-2～10-6； 取經25℃培養(yǎng)48h的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-2～10-3；取經25℃培養(yǎng)7d的黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，加5mL 含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1mL，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量稀釋，取1mL稀釋后的孢子懸液，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至10-2～10-3，做活菌計數備用[9]。

2.2供試液制備

稱取本品10g，置無菌錐形瓶中，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，于45℃水浴保溫振蕩15min，混勻，作為1∶10供試液；取10mL，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，作為1∶100供試液，備用。

2.3微生物計數方法適用性試驗

需氧菌總數計數：取1∶100供試液1mL，采用薄膜過濾法進行過濾，每筒用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500mL沖洗，在最后100mL沖洗液中加入不大于100cfu的相應試驗菌，沖洗后取出貼膜于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結果。

霉菌和酵母菌總數計數：取1∶10供試液9.9mL，加入適宜濃度的試驗菌液0.1mL，混勻，使每1毫升供試液中含菌量不大于100cfu。取1mL注入平皿，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度下培養(yǎng)24～120h，逐日觀察結果。

供試品對照組：取1∶10供試液9.9mL，以稀釋液代替菌液，同法操作。

菌液對照組：取稀釋液代替供試液，同法操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

結果：5株需氧菌、2株真菌的回收比值均在0.5～2之間，符合藥典規(guī)定，因此可照此方法進行阿奇霉素膠囊的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。見表1。

表1　需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法學驗證結果

2.4控制菌檢查方法的驗證[11]

根據《中國藥典》2015年版要求，控制菌檢查只需檢查大腸埃希菌。

試驗組：取1∶10的供試液10mL，采用薄膜過濾法，每筒用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500mL沖洗，在最后100mL沖洗液中加入不大于100cfu的大腸埃希菌1mL，加至100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)18～24h，取上述培養(yǎng)物1mL接種至100mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24～48h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～72h。取麥康凱瓊脂平板上經純化后的培養(yǎng)物，接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。陰性對照組：取稀釋液1mL照大腸埃希菌檢查法操作。結果：試驗組檢出大腸埃希菌，陰性對照試驗組無菌生長。

3　討論

阿奇霉素作為第二代大環(huán)內酯類抗生素，抗菌譜更廣泛，尤其對需氧菌和厭氧菌的抗菌能力更加顯著。在建立阿奇霉素的2010年版微生物限度檢查法時，多篇文獻[12-13]報道方法均采用了低速離心和薄膜過濾相結合的方法來消除其抑菌作用。相比之下，本研究參照《中國藥典》2015年版所建立的阿奇霉素膠囊微生物限度檢查法操作更簡單，且薄膜過濾時所用緩沖液的沖洗量相對減少，有利于節(jié)約成本，同時能有效消除供試品殺菌和抑菌作用，保證試驗結果的準確性和科學性。

本研究在進行需氧菌總數計數方法學驗證時，先選取敏感菌株枯草芽孢桿菌進行試驗，取1∶10供試液采用薄膜過濾法進行過濾，每筒分別用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1000mL沖洗，回收比值均為0；當取1∶100供試液1mL，照上述方法進行薄膜過濾，每筒沖洗量500mL時，枯草芽孢桿菌的回收比值為1.0，后者的回收比值符合藥典規(guī)定。經方法適用性驗證結果表明，阿奇霉素膠囊需氧菌總數檢查可采用薄膜過濾法[14]（取1∶100的供試液1mL，每膜沖洗500mL，100mL/次）。

大腸埃希菌作為糞便污染的指示菌，它是腸桿菌科各族細菌中檢出率最高的菌種[15]，如果檢出大腸埃希菌，表明樣品存在被糞便污染的可能性，有可能污染腸道疾病菌，人們食用了這樣的藥品則可能引起消化道傳染病。經過驗證，大腸埃希菌檢查采用薄膜過濾法（每膜沖洗500mL，100mL/次），有效消除供試品自身殺菌和抑菌作用，大腸埃希菌試驗結果更為準確。

藥品污染微生物直接影響藥品的有效性，且污染微生物還可能產生毒素[16]，可能危及用藥患者的生命安全。藥品微生物限度是控制藥品質量的重要指標之一，《中國藥典》從2005年版開始要求進行藥品微生物限度方法學驗證，規(guī)定采用適當的方法來消除或抑制藥物的抗菌活性，以保證方法的適用性，保證了藥品微生物限度試驗結果的準確性和科學性，從而保證了藥品質量的安全性和有效性。

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Establishment of microbial limit test method for Azithromcin Capsule Chinese Pharmacopoeia 2015

LIU Xuping1XIAO Qinqin1CHEN Xi1ZHANG Chunhua1LI Jinglian2
1.Jiangxi Institute For Drug Control, Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality, Nanchang 330029, China; 2.Nanchang Pharmaceutical Equipment Supply Station of Nanjing Military Region, Nanchang 330029, China

Objective To establish a method of microbial limit test for Azithromcin Capsule. Methods According to 1105, 1106, 1107 of Chinese Pharmacopoeia 2015 method, total combined yeasts and molds count were checked by plate count (1∶10 solution), total aerobic microbial count was checked by membrane filtration method, and escherichia coli was checked by membrane filtration method. Results Recovery ratio of each test bacteria was in line with Chinese Pharmacopoeia 2015. Escherichia coli could be detected in the positive control. Conclusion This method can be used for microbial limit test for Azithromcin Capsules.

Azithromcin capsule; Microbial limit test; Pour plate method; Membrane filtration Method; Method validation

R927.11

A

2095-0616（2016）17-37-03

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（2016-07-07）