鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的實驗研究

崔 軍 莫憶南沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，遼寧沈陽 110024

鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的實驗研究

崔 軍 莫憶南
沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，遼寧沈陽 110024

目的 探究鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用價值。 方法 取4～6周齡雄性SD大鼠72只制備坐骨神經(jīng)損傷模型，隨機(jī)分為4組各18只，分別對神經(jīng)吻合口部位行鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜包繞（A組）、鹿茸多肽-PLGA復(fù)合膜包繞（B組）、FK506-PLGA復(fù)合膜包繞（C組）以及直接端端吻合（D組），比較各組大鼠術(shù)后2、4、6周小腿三頭肌誘發(fā)電位恢復(fù)率及其再生有髓纖維計數(shù)（n）、直徑（mm）及截面積恢復(fù)率（%）情況。 結(jié)果 術(shù)后各時點A組大鼠電位恢復(fù)率明顯優(yōu)于B、C、D組（P均＜0.05），且B、C組大鼠電位恢復(fù)率也較對照組D組具有明顯改善。術(shù)后2、4、6周時，A組大鼠再生有髓纖維數(shù)、直徑及截面積恢復(fù)率均明顯優(yōu)于B組、C組、D組（P均＜0.05），D組的再生有髓纖維數(shù)、直徑及截面積恢復(fù)率較B、C組均明顯偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜可有效促進(jìn)周圍神經(jīng)缺損的再生和修復(fù)，在保證外周神經(jīng)有效營養(yǎng)供給的同時提供良好的生物相容性。

鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜；周圍神經(jīng)損傷

周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見的功能性損傷分類之一，其修復(fù)往往需要較長的過程，如何有效靶控再生神經(jīng)對效應(yīng)器官的調(diào)節(jié)作用仍是創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點[1]。鹿茸多肽含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及鈣離子，可有效促進(jìn)軸漿蛋白質(zhì)和RNA的合成，幫助損傷神經(jīng)的修復(fù)[2]。 FK506作為一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，不但具有常規(guī)的強(qiáng)效抗菌作用，同時還具有強(qiáng)大的促神經(jīng)再生作用，使得其備受神經(jīng)損傷修復(fù)專家的關(guān)注和親睞[3]。本實驗主要針對鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中的效果進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物分組

雄性SD大鼠72只（4～6周齡），體重（250±50）g（中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）。所有動物隨機(jī)分成4組，各18只，A組VAP-FK506-PLGA復(fù)合膜修復(fù)組（4.55±0.22）周齡，體重（267.42±11.42）g；B組VAP-PLGA復(fù)合膜修復(fù)組（4.28±0.31）周齡，體重（264.32±12.01）g；C組：FK506-PLGA復(fù)合膜修復(fù)組（4.47±0.31）周齡，體重（273.41±11.83）g；D組（4.48±0.27）周齡，體重（272.13±12.81）g。

1.2復(fù)合膜制備

VAP-PLGA復(fù)合膜：將10mg的鹿茸多肽與1g的PLGA混合后，制成厚度50μm的復(fù)合膜，并應(yīng)用環(huán)氧乙烷消毒備用[4]。

VAP-PLGA-FK506復(fù)合膜：將10mg的鹿茸多肽、5mg FK506與1g的PLGA混合成厚度50μm復(fù)合膜，消毒同上。

FK506-PLGA復(fù)合膜：分別將5mg FK506與1g的PLGA混合成厚度50μm復(fù)合膜，消毒同上。

1.3動物模型制備

采用1%硫噴妥鈉以5mL/kg對SD大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，俯臥位固定，碘伏消毒左下肢術(shù)區(qū)[5]。于股后方做一長約30mm的弧形切口至皮下，鈍性分離顯露梨狀肌、股二頭肌及坐骨神經(jīng)[6]。充分顯露神經(jīng)后，游離分離出長約20mm神經(jīng)。A組剪下游離端3mm，待其自行收縮形成約5mm神經(jīng)缺損后，將VAP-FK506-PLGA 膜修剪成約 10mm×10mm大小的適應(yīng)形狀對神經(jīng)斷端進(jìn)行包裹，并縫合固位。最后對已縫合固位的復(fù)合膜進(jìn)行加固縫合，注意固定薄膜游離緣與外膜中間部分并形成閉合導(dǎo)管。B、C組造模同上。D 組在梨狀肌下緣 5mm 處切斷坐骨神經(jīng)后行端端直接吻合。

1.4觀察指標(biāo)

（1）電生理檢測：肌電儀測定實驗側(cè)肢體坐骨神經(jīng)支配的小腿三頭肌最大誘發(fā)電位，比較其與對側(cè)恢復(fù)率。（2）組織學(xué)檢查：取坐骨神經(jīng)縫合口近端神經(jīng)組織制備常規(guī)切片觀察HE染色下實驗側(cè)肢體做有髓神經(jīng)纖維計數(shù)、神經(jīng)直徑、神經(jīng)截面積與正常側(cè)的恢復(fù)率情況。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1各組大鼠術(shù)后小腿三頭肌誘發(fā)電位恢復(fù)率情況

術(shù)后各時點，A組電位恢復(fù)率均明顯高于其他各組（P均＜0.05），且B、C兩組的大鼠電位恢復(fù)率也較D組明顯偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1　各組大鼠術(shù)后小腿三頭肌誘發(fā)電位恢復(fù)率

表1　各組大鼠術(shù)后小腿三頭肌誘發(fā)電位恢復(fù)率

組別　n　　術(shù)后2周　　術(shù)后4周　　術(shù)后6周　F　P A組　6　9.32±1.31　17.42±4.31　52.31±6.53 5.0324＜0.05 B組　6　5.41±1.34　14.31±3.81　40.53±5.21 4.9373＜0.05 C組　6　5.21±1.53　14.29±3.90　41.36±5.36 4.7783＜0.05 D組　6　1.32±0.42　7.53±3.15　31.42±3.05 4.3743＜0.05 F 5.4243　5.4113　5.2436 P＜0.05　?。?.05　?。?.05

2.2各組大鼠神經(jīng)再生情況比較

術(shù)后2周、4周、6周時，A組評價再生有髓纖維數(shù)、再生有髓纖維直徑以及其截面積恢復(fù)率均明顯優(yōu)于B、C、D組（P均＜0.05），且各組術(shù)后4周、6周的再生有髓纖維數(shù)、直徑及截面積恢復(fù)率較術(shù)后2周均具有明顯差異（P均＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠神經(jīng)再生情況比較

表2　各組大鼠神經(jīng)再生情況比較

組別　n再生有髓纖維數(shù)　　再生有髓纖維直徑（mm）　　再生有髓纖維截面積恢復(fù)率（%）術(shù)后2周　　術(shù)后4周　　術(shù)后6周　F　P　　術(shù)后2周　　術(shù)后4周　　術(shù)后6周　F　P　　術(shù)后2周　　術(shù)后4周　　術(shù)后6周　F　P A組　6　20.32±4.54 54.56±5.31　80.22±5.14　5.8243＜0.05　36.43±5.64　60.01±3.45　78.31±4.32　5.4732　＜0.05　21.31±4.62 60.03±6.37 80.12±3.45　5.0245?。?.05 B組　6　15.21±4.21 41.24±5.12　72.66±5.31　5.4372　＜0.05　20.83±4.29　47.74±3.45　73.45±2.56　4.2553?。?.05　15.32±5.10 54.12±2.35 64.06±5.10　4.3252?。?.05 C組　6　15.38±3.21 40.32±4.83　72.31±5.24　5.3252＜0.05　20.34±4.53　47.03±4.19　73.53±3.42　4.3824　＜0.05　15.32±2.01 53.33±3.01 63.53±4.64　5.2110?。?.05 D組　6　9.56±l.97　24.96±3.67　58.98±1.58　4.7535?。?.05　8.32±10.65 41.32±2.45　51.22±2.54　4.8732　＜0.05　4.64±1.36 39.54±3.81 56.14±3.78　4.3753?。?.05 F 4.5353　5.8435　5.3392　4.9985　5.0332　5.4855　4.3357　4.2845　5.0332 P＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　?。?.05　?。?.05　?。?.05　　＜0.05　?。?.05　?。?.05

3　討論

周圍神經(jīng)損傷主要指神經(jīng)細(xì)胞的軸突損傷，當(dāng)正常神經(jīng)細(xì)胞軸突雙向傳遞過程受到抑制時，神經(jīng)干的連續(xù)性就會受到影響，隨著病程的進(jìn)展，神經(jīng)元細(xì)胞還可出現(xiàn)不可逆的損傷并最終趨于死亡。周圍神經(jīng)損傷修復(fù)一直是臨床上的難點問題，自20世紀(jì)末生物工程手段在周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)中成功應(yīng)用以來，近年來不斷有基于生物工程材料的治療方案提出[7]。

鹿茸多肽（Velvet Antler Peptide，VAP）是一種來自于天然鹿茸，且富含氨基酸的多肽類生物活性物質(zhì)，含有神經(jīng)生長和修復(fù)所需的多種生長因子，能在一定程度上模擬神經(jīng)干細(xì)胞分化的外環(huán)境，并明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元進(jìn)行高效分化[12]。有研究指出，鹿茸多肽可有效促進(jìn)軸漿蛋白質(zhì)和RNA的合成，同時還可有效促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的活性，提高患者免疫功能，有效清除變性神經(jīng)和壞死神經(jīng)中的有害物質(zhì)[8]。FK506（他克莫司）是一種從鏈霉菌中分離出的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，最初主要應(yīng)用于器官移植術(shù)的抗感染治療，近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)FK506還具有一定的促神經(jīng)再生作用，可通過作用于神經(jīng)再生相應(yīng)的營養(yǎng)因子和誘導(dǎo)因子，有效恢復(fù)神經(jīng)干的信號傳導(dǎo)連續(xù)性[9]。筆者在動物坐骨神經(jīng)損傷的模型研究中，分別予以VAP -PLGA-FK506聯(lián)合復(fù)合膜、VAP-PLGA復(fù)合膜、FK506-PLGA復(fù)合膜以及空白對照予以修復(fù)治療，比較其術(shù)后2周、4周、6周時的三頭肌誘發(fā)電位恢復(fù)率和再生有髓纖維情況發(fā)現(xiàn)，A組大鼠上述各項指標(biāo)均明顯優(yōu)于其他各組，且B、C組大鼠的神經(jīng)再生情況，也較空白對照組大鼠明顯偏優(yōu)，提示鹿茸多肽以及FK506均可在一定程度上促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)，且二者聯(lián)合使用具有更高的再生神經(jīng)修復(fù)優(yōu)勢，可互補(bǔ)不足，在為外周神經(jīng)再生提供穩(wěn)定而有效的應(yīng)用成分的同時，明顯促進(jìn)軸突的再生活性，并有效保障損傷神經(jīng)的修復(fù)和再生[10]。

綜上所述，鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜對于損傷神經(jīng)的修復(fù)具有積極意義，鹿茸多肽和FK506均可在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，聯(lián)合使用具有更高的有效率和更廣的安全窗。

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[6] 李振華，趙文海，周秋麗.鹿茸多肽對抗骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞氧化損傷作用的實驗研究[J].中國骨傷，2011，24（3）：245-248.

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The research of pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane in the repair of peripheral nerve injury

CUI Jun MO Yinan
Center Hospital Affiliated to Shenyang Medical School, Shenyang 110024, China

Objective To explore the application value of pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane in the repair of peripheral nerve injury. Methods 72 male SD rats (4-6 weeks) were selected to build sciatic nerve injury model, and they were divide into 4 groups, with 18 cases in each. Rats in group A were treated with nerve anastomosis with pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane, rats in group B were treated with deer antler polypeptide - PLGA composite film bag, rats in group C were treated with FK506 around -PLGA composite membrane, and rats in group D were treated with end to end anastomosis. The leg triceps evoked potential recovery rate, regenerative myelinated fibers count (n), diameter (mm) and cross-sectional area recovery rate (%) after 2, 4, 6 weeks in different groups were compared. Results The potential recovery rate in group A in different points were significantly better than that in group B, C and D(P＜0.05)， and the potential recovery rate in group B and C were better than that in group D. At 2, 4, 6 weeks postoperatively, the regenerative myelinated fibers count, diameter and cross-sectional area recovery rate in group A were significantly better than those in group B, C and D (P＜ 0.05), and the regenerative myelinated fibers count, diameter and cross-sectional area recovery rate in group D were significantly lower than those in group B and C. Conclusion Pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane can effectively promote the regeneration of the peripheral nerve defect effectively, and support a good biocompatibility as well as effective nutrient supply.

Pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane; Peripheral nerve injury

R285.5

A

2095-0616（2016）17-30-03

（2016-07-06）