高粱抗絲黑穗病SCAR標(biāo)記的建立

李玥瑩, 李春陽(yáng), 邢慧清, 張馨月, 逄洪波, 晏銘謠

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

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高粱抗絲黑穗病SCAR標(biāo)記的建立

李玥瑩, 李春陽(yáng), 邢慧清, 張馨月, 逄洪波, 晏銘謠

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

選用高粱絲黑穗病感病恢復(fù)系矮四、抗病恢復(fù)系2381R以及二者F2代抗感個(gè)體為試驗(yàn)試材,采用CTAB法提取高粱基因組DNA, 并應(yīng)用RAPD篩選技術(shù)對(duì)高粱基因進(jìn)行分子標(biāo)記,選取了100對(duì)RAPD隨機(jī)引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,有88對(duì)引物擴(kuò)增出條帶。分析結(jié)果表明:88對(duì)引物中S405在抗感品種間擴(kuò)增出差異譜帶。進(jìn)一步對(duì)抗感群體進(jìn)行分離分析,得出抗絲黑穗病基因重組率為11.7%。將S405擴(kuò)增出的差異片段進(jìn)行克隆測(cè)序,差異譜帶的片段長(zhǎng)度為320 bp。根據(jù)差異譜帶的堿基排列順序,設(shè)計(jì)特異性引物,然后進(jìn)行序列擴(kuò)增,將RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR分子標(biāo)記,并將該標(biāo)記命名為S405-320,為高粱優(yōu)良品種的篩選和培育奠定一定的基礎(chǔ)。

高粱; 絲黑穗病; RAPD; SCAR

0 引 言

高粱[Sorghumbicolor(L) Moench]屬禾谷類作物,產(chǎn)量高,抗逆性強(qiáng),具有抗旱、耐澇、耐鹽堿的特性[1],高粱植株各個(gè)部分都有潛在的利用價(jià)值,是重要的糧食作物、飼料作物以及生物燃料作物[2-3]。高粱絲黑穗病是影響高粱生產(chǎn)發(fā)展的重要病害之一[4-5],在各高粱產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生, 給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大損失,嚴(yán)重制約高粱產(chǎn)業(yè)發(fā)展,實(shí)踐證明,選育抗病品種是防治絲黑穗病最為有效的途徑[6]。選育抗病品種是一項(xiàng)非常復(fù)雜的工作,傳統(tǒng)的方法育種效率不高[7],隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,利用SSR(Simple Sequence Repeat)、RAPD(Random Amplified Polymorphism DNAs)及SCAR(Sequence characterized Amplified Region)等分子標(biāo)記技術(shù),找到感絲黑穗病品種和抗絲黑穗病品種之間的區(qū)別, 定位抗病基因,從本質(zhì)上防治高粱絲黑穗病[8]。RAPD因具有樣品用量少,檢測(cè)速度快,靈敏度好,成本較低等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物的抗病品種的鑒定[9-11]。本研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)高粱抗、感絲黑穗病品種經(jīng)行RAPD-PCR擴(kuò)增,根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物,將RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR分子標(biāo)記,提高RAPD的穩(wěn)定性,這對(duì)抗絲黑穗病品種的選育具有較大的實(shí)用價(jià)值,為高粱優(yōu)良品種的篩選和培育提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高粱絲黑穗病感病恢復(fù)系矮四,抗病恢復(fù)系2381R,以及其二者經(jīng)去雄雜交、自交的后代2381R/矮四群體(感病20株,抗病40株),均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī),PCR擴(kuò)增儀,電泳槽,微量移液槍,紫外凝膠成像,電子分析天平,微波爐,水浴鍋,制冰機(jī)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

TBE電極緩沖液,CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)緩沖液,EB(溴化乙錠),氯仿/異戊醇,溴酚藍(lán)溶液,異丙醇,瓊脂糖,75%乙醇,10 mmol/L dNTPs,5 U/μL Taq酶,100條隨機(jī)引物(S401-S500)購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試材培養(yǎng)

將高粱種子浸泡8 h,然后將其種植于花盆中,在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),溫度設(shè)為28 ℃,濕度設(shè)為75%,光照培養(yǎng)13 h,黑暗培養(yǎng)11 h。培養(yǎng)一周后采摘高粱苗期葉片,進(jìn)行DNA的提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 高粱DNA的提取

采用CTAB法[12-14]提取高粱苗期葉片的總DNA。

1.2.3 DNA純度檢測(cè)

取7 μL提取的DNA于1%含0.5 μg/mL EB的瓊脂糖凝膠中電泳,電壓設(shè)為100 V,電泳30 min,在紫外凝膠成像儀中觀察并拍照,檢測(cè)DNA的譜帶情況。

1.2.4 近等基因池的建立

采用分離群體分組分析法(BSA法)對(duì)高粱抗感絲黑穗病群體進(jìn)行分析[15]。感池由20株感絲黑穗病株葉片,抗池由40株抗絲黑穗病株葉片所提取的DNA,各取1 μL混勻而成。

1.2.5 RAPD-PCR反應(yīng)條件

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL):ddH2O 17.0 μL,MgCl22.5 μL(25 mmol/L),10×Buffer 2.5 μL,DNA模版(25 ng/μL)1.0 μL ,dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL,Taq酶(5 U/μL)0.5 μL,引物(10 μmol/μL)1.0 μL。

反應(yīng)條件:

94 ℃預(yù)變性 3 min

72 ℃延伸 10 min

1.2.6 產(chǎn)物檢測(cè)

取RAPD-PCR產(chǎn)物5 μL于1.5%含0.5 μg/mL EB的瓊脂糖凝膠中電泳,電壓100 V,電泳60 min,在紫外凝膠成像儀中觀察并拍照,檢測(cè)PCR產(chǎn)物有無(wú)降解情況。

1.2.7 多態(tài)性片段的回收及克隆測(cè)序

回收引物擴(kuò)增的條帶,PCR擴(kuò)增,送大連寶生物公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.2.8 SCAR標(biāo)記的建立

根據(jù)測(cè)序結(jié)果,在序列的兩端設(shè)計(jì)特異性SCAR引物。

SCAR-PCR反應(yīng)體系(25 μL):ddH2O 17 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.0 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,引物引物Ⅰ(10 μmol/μL)0.5 μL,引物Ⅱ(10 μmol/μL)0.5 μL,DNA模版(100 ng/μL)1.0 μL。

反應(yīng)條件:

95 ℃預(yù)變性 3 min

72 ℃延伸 10 min

1.2.9 共分離分析

重組率(r)=交換個(gè)體數(shù)/(抗絲黑穗病群體數(shù)+感絲黑穗病群體數(shù))×100%

遺傳距離(cM)=[1/4*ln(1+2r)/(1-2r)]*100

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度檢測(cè)

圖1 DNA的提取檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The detection result of DNA extraction

采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明提取出的DNA沒(méi)有降解,純度符合實(shí)驗(yàn)要求,結(jié)果如圖1所示,可用于接下來(lái)的RAPD-PCR實(shí)驗(yàn)。

2.2 高粱抗絲黑穗病基因的RAPD分析

選取100條(S401-S500)RAPD隨機(jī)引物,對(duì)親本、感池、抗池和后代群體的DNA模板進(jìn)行RAPD分析。結(jié)果表明:12條引物沒(méi)有擴(kuò)增出條帶,88條引物擴(kuò)增出條帶,擴(kuò)增率為88%。擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示,從左至右,分別是Marker,引物S401、S403、S405、S421、S422、S442的擴(kuò)增結(jié)果。每條引物擴(kuò)增的4個(gè)條帶從左至右分依次是抗絲黑穗病親本、感絲黑穗病親本、抗絲黑穗病基因池和感絲黑穗病基因池的擴(kuò)增條帶。其中引物S405擴(kuò)增條帶具有多態(tài)性,在抗親、抗池比感親、感池多擴(kuò)增出一條譜帶,在320 bp左右。其他引物并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性。

圖2 引物 S401、S403、S405、S421、S422、S442的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 高粱抗絲黑穗病基因RAPD多態(tài)性差異的共分離分析

對(duì)引物S405進(jìn)行共分離分析, 分析了F2代分離群體60株(感病20株,抗病40株)。 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表1,在感絲黑穗病群體中,有5株擴(kuò)增出了多態(tài)性片段。在抗絲黑穗病群體中,有2株沒(méi)有擴(kuò)增出多態(tài)性片段,得出重組率為11.7%,遺傳距離為11.9 cM,該片段與抗病基因緊密連鎖。

表1 S405擴(kuò)增片段多態(tài)性在F2代中的共分離分析Tab.1 Co-segregation analysis of amplified polymorphism fragment in F2 using primer S405

S405引物在抗病和感病群體的單株部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 引物S405的PCR部分?jǐn)U增結(jié)果

2.4 多態(tài)性片段的回收及克隆測(cè)序

圖4 S405回收的片段Fig.4 The recycling polymorphism fragment of S405

將引物S405擴(kuò)增的多態(tài)性片段回收純化,電泳結(jié)果如圖4所示?；厥盏钠伍L(zhǎng)度為320 bp與目標(biāo)片段的大小相同,并進(jìn)行了克隆測(cè)序。

圖5 S405的SCAR標(biāo)記對(duì)部分單株的檢測(cè)結(jié)果抗親(1),感親(2),F2抗單株(6～10),F2感單株(41～45)Fig.5 The PCR detection for some individuals with the specific S405 SCAR primers Marker Resistant parent(1), Susceptible parent(2), F2 resistant-segregation individuals(6～10),F2 susceptible segregation individuals(41～45)

2.5 SCAR標(biāo)記的建立

2.5.1 SCAR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)測(cè)序結(jié)果,合成了SCAR的引物,序列如下:

S405F:5′-TCGCTAACACGCACACCTAA-3′

S405R:5′-GAACGTGTTGGGGAACAAGG-3′

2.5.2 SCAR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

用2.5.1的一對(duì)引物對(duì)父母本及F2代抗感個(gè)體單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明SCAR標(biāo)記與高粱抗絲黑穗病基因的RAPD標(biāo)記的連鎖性相比無(wú)變化,結(jié)果如圖5所示,1為抗絲黑穗病親本、2為感絲黑穗病親本、6～10為F2抗絲黑穗病單株、41～45為F2感絲黑穗病單株,其中抗絲黑穗病親本和抗絲黑穗病單株都擴(kuò)增出了譜帶,長(zhǎng)度約為320 bp;感絲黑穗病親本和感絲黑穗病單株都沒(méi)有擴(kuò)增出任何普帶。PCR產(chǎn)物都只為一條320 bp的譜帶,說(shuō)明了SCAR標(biāo)記的特異性強(qiáng),并且F2單株擴(kuò)增結(jié)果表明遺傳距離和RAPD擴(kuò)增結(jié)果一致,這證明成功的把RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為了重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的SCAR標(biāo)記。

3 結(jié) 論

3.1 抗絲黑穗病基因的RAPD分析

本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取了100個(gè)RAPD引物對(duì)高粱絲黑穗病感病恢復(fù)系矮四、抗病恢復(fù)系2381R和感病群體、抗病群體進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。結(jié)果顯示:在100個(gè)隨機(jī)引物中,有88個(gè)引物能對(duì)DNA擴(kuò)增出條帶,擴(kuò)增率為88%。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得出S405在感絲黑穗病親本與抗絲黑穗病親本、感絲黑穗病基因池與抗絲黑穗病基因池之間的多態(tài)性條帶一致;對(duì)其進(jìn)行RAPD多態(tài)性差異的共分離分析,得出S405與抗絲黑穗病基因的重組率為11.7%,遺傳距離為11.9 cM。

3.2 將RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記的分析

將引物S405擴(kuò)增的多態(tài)性片段進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明片段長(zhǎng)度約為320 bp。進(jìn)一步設(shè)計(jì)了SCAR引物,應(yīng)用SCAR引物對(duì)抗、感病群體的單株進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果表明其連鎖性與RAPD分子標(biāo)記一致,證明RAPD標(biāo)記已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

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Research on establishment of head smut of sorghum by using SCAR marker

LIYueying,LIChunyang,XINGHuiqing,ZHANGXinyue,PANGHongbo,YANMingyao

(College of Life Science, Shenyang Nomal University, Shenyang 110034, China)

The DNA of the sorghum Head Smut disease-resistant restorer lines and susceptible-resistant restorer lines dwarf four, Head Smut resistance and susceptibility was extracted by CTAB method and marked with molecular marker to sorghm gene by RAPD in this paper. In the optimal RAPD reaction system, 100 random primers were used to screen the markers linked to the resistance gene, 88 pairs amplified products. The results show that S405of 88 pairs of primers between disease-resistant and susceptible-resistant cultivars are amplified differences bands, further segregation analysis the resistance gene to Head Smut was 11.7 %. S405amplified polymorphic bands were cloned and sequenced with the length of 320 bp. According to the nucleotide sequences of differences bands to design specific primer was designed for perform PCR, the RAPD markers were succeeded conversing to SCAR marker, the marker named S405-320, to lay a foundation for the selection and cultivation of improved varieties of sorghum.

sorghum; head smut; RAPD; SCAR

2016-01-09。

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2012387); 沈陽(yáng)市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(F15-1991--22).

李玥瑩(1966-),女,遼寧沈陽(yáng)人,沈陽(yáng)師范大學(xué)教授,博士。

1673-5862(2016)04-0468-05

S432

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.04.019