親和分離技術(shù)中親和配基的研究進(jìn)展

曾嶸靳步昆阮濤吳優(yōu)侯亞利龔志偉楊忠華

（1. 湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，武漢 430062；2. 武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，武漢 430081）

親和分離技術(shù)中親和配基的研究進(jìn)展

曾嶸1靳步昆2阮濤2吳優(yōu)2侯亞利2龔志偉2楊忠華2

（1. 湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，武漢 430062；2. 武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，武漢 430081）

親和分離技術(shù)在蛋白質(zhì)的分離純化過程中發(fā)揮著越來越重要的作用，開發(fā)合適的配基是親和分離的關(guān)鍵。按生物大分子親和配基、小分子親和配基、金屬親和配基三大類對(duì)親和配基的研究情況進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹其發(fā)展現(xiàn)狀、作用機(jī)理以及目前存在的主要問題，并對(duì)親和配基未來發(fā)展進(jìn)行展望，旨為將其更好地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

親和；純化；層析；配基；特異性吸附

伴隨著生命科學(xué)與生物工程等相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，特別是基因工程取得的巨大成就，人們對(duì)生物產(chǎn)品下游加工過程中蛋白質(zhì)的分離純化提出了更高的要求。親和分離是通過與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，達(dá)到從復(fù)雜的生物產(chǎn)品中一步純化得到目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)，它具有高效簡便的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于抗原、抗體、激素、糖蛋白、核酸、多糖及抑制劑等產(chǎn)品的分離純化［1］。

親和分離技術(shù)包括親和色譜、親和膜、親和過濾、親和萃取、親和電泳等多種分離技術(shù)［2］。其中親和色譜與親和膜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中。在親和分離技術(shù)中，親和分離介質(zhì)是親和分離的基礎(chǔ)。親和分離介質(zhì)主要由載體、間隔臂、親和配基三部分組成，在合適的載體上連上間隔臂，再在間隔臂的另一端連接能與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的親和配基。其中親和配基的選擇對(duì)整個(gè)親和分離過程起著決定性的作用。親和配基需與目標(biāo)蛋白高效、特異性、可逆結(jié)合，主要包括生物大分子類、小分子類、金屬類親和配基。其中生物大分子類親和配基與目標(biāo)蛋白特異性識(shí)別能力最強(qiáng)，小分子類與金屬類親和配基與目標(biāo)蛋白的識(shí)別能力相對(duì)較弱，但價(jià)格低廉、來源較廣，是目前研究較廣泛的領(lǐng)域。本文針對(duì)生物大分子、小分子、金屬三大類親和配基的發(fā)展，作用機(jī)理，在純化蛋白中的應(yīng)用以及存

在的問題，解決方案進(jìn)行闡述，并展望親和配基的改進(jìn)和發(fā)展趨勢(shì)，旨為將其更好地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

1 生物大分子親和配基

生物大分子親和配基是自然界中存在的具有生物特異性相互作用的物質(zhì)，具有較高的特異性，包括酶與相應(yīng)的底物和抑制劑、激素與受體。常見的有細(xì)菌蛋白質(zhì)、免疫、凝集素、多糖、多肽等親和配基。該類配基能與目標(biāo)蛋白高效性結(jié)合，可用于組織纖溶酶原激活劑、干擾素、抗體、抗原、胰蛋白酶、糖蛋白、脫氫酶及激酶等物質(zhì)的分離純化。

圖1 親和分離過程

1.1 細(xì)菌蛋白類親和配基

細(xì)菌蛋白類配基是一種由細(xì)菌體內(nèi)分離出來的蛋白，包括蛋白A、蛋白G，分別來源于金黃色葡萄球菌和G群鏈球菌。它們對(duì)具有Fc片段相似結(jié)構(gòu)的抗體有較強(qiáng)的親合作用，并且純化的抗體有較高的活性。常用于固定細(xì)菌蛋白類配基的載體有纖維素、聚醚砜、聚偏氟乙烯等。

吳璞強(qiáng)［3］通過重組菌構(gòu)建，對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基的分子進(jìn)行了改造。并制備了具有洗脫條件溫和、耐高濃度堿的重組蛋白A親和填料，將其應(yīng)用于牛初乳IgG的純化。唐思遠(yuǎn)［4］采用Protein A親和層析和DEAE陰離子交換層析兩步法制備了較高純度的Fab片段和Fc片段，考察了混合模式層析介質(zhì)對(duì)兩種片段的吸附差異，實(shí)現(xiàn)了混合模式層析分離抗體片段。研究結(jié)果有助于開發(fā)抗體片段制備的新工藝，以及探討混合模式層析分離抗體的機(jī)制研究和配基優(yōu)化設(shè)計(jì)。

細(xì)菌蛋白類親和配基特異性高，但配基與載體價(jià)格昂貴，不適用于醫(yī)療蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)，且在純化過程中配基容易泄露影響產(chǎn)品純度。為了降低成本，提高產(chǎn)物的純度，開發(fā)出廉價(jià)的親和載體、利用重組技術(shù)對(duì)細(xì)菌蛋白進(jìn)行改造、或模擬細(xì)菌蛋白類親和配基是有效的策略。黃波等［5］用分子動(dòng)力學(xué)模型與自由能分解的方法對(duì)蛋白A與人免疫球蛋白G1的結(jié)合機(jī)理進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)疏水作用在它們的結(jié)合中起了較大的作用，該研究有助于模擬蛋白A 配基的合成。EI Khoury 等［6］根據(jù)鏈狀球菌蛋白G的Fab區(qū)域人工合成了一種吸附劑A2C7I1，它含有與鏈狀球菌蛋白G相似的關(guān)鍵氨基酸殘基，對(duì)哺乳動(dòng)物、酵母的IgG和Fab碎片蛋白的純化純度均達(dá)到93%。

蛋白A親和層析是抗體分離的平臺(tái)技術(shù)，具有高度特異性，但是存在成本高、洗脫條件苛刻、蛋白配基易脫落等問題。尋求經(jīng)濟(jì)高效的抗體分離新方法，具有重要的意義?；旌夏Ｊ綄游龊投屉姆律鷮游鍪悄壳翱贵w分離的新技術(shù)，但對(duì)其的認(rèn)識(shí)還不夠深入。

1.2 免疫類親和配基

抗體與抗原之間能夠發(fā)生免疫反應(yīng)，以一方作為親和配基可以分離對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白。研究表明抗體與抗原之間具有互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)，是由靜電力、范德華力、疏水力等綜合作用結(jié)合，選擇性和結(jié)合力優(yōu)于一般的配基。Mei等［7］制備多克隆抗體免疫色譜柱可以從動(dòng)物肝臟中特異性結(jié)合苯基乙醇胺，達(dá)到分離提純的目的。

相較于多克隆抗體，單克隆抗體針對(duì)某一抗原決定簇，能產(chǎn)生唯一穩(wěn)定的產(chǎn)物并且與抗原之間具有獨(dú)特解離常數(shù)，得到更多的應(yīng)用。王明永等［8］聯(lián)合抗人MBL-CRD單克隆抗體與甘露聚糖-Sepharose層析柱，分離純化人血漿中的甘露聚糖結(jié)合凝集素，獲得了高純度、高活性的天然蛋白。Hu等［9］制備了單克隆抗體Mab 4B2免疫親和色譜，成功的純化了大豆中的大豆球蛋白。

免疫親和配基能夠高效的識(shí)別目標(biāo)蛋白，不但可用于分離純化多克隆抗體中微量的抗原，還可以用于微量物質(zhì)的檢測(cè)，特別是與膜技術(shù)現(xiàn)結(jié)合，經(jīng)一次簡單處理便得到高純度的活性物質(zhì)。但是獲得高純度的抗體或抗原增加了純化步驟與成本，在洗脫過程中容易失活。

1.3 凝集素類親和配基

凝集素是指從各種植物、無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的結(jié)合糖蛋白，含有一個(gè)或多個(gè)可與單糖或寡聚糖特異性可逆結(jié)合的結(jié)構(gòu)，可用于純化糖基化的分泌蛋白和膜蛋白，包含多糖、糖酯、糖蛋白、及含糖配基的生物大分子，也可用于蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)構(gòu)分析。

凝集素親和色譜與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合到一起常用于蛋白組學(xué)信息的研究，Ruiz-May 等［10］利用凝集素親和層析純化N-糖蛋白，進(jìn)一步利用質(zhì)譜對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。楊彥杰等［11］運(yùn)用ConA凝集素固相親和層析、雙向電泳與質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)大鼠的再生肝糖蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究，鑒定出了123種蛋白。

為了確定與目的糖蛋白特異性結(jié)合的凝集素，可以通過已有的研究進(jìn)行分析，如王志鳳［12］利用植物凝集素親和層析，分離純化了小黑楊雄花芽、雌花芽和葉芽3種組織糖基化蛋白，并對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)信息進(jìn)行了研究。路垚等［13］制備了兩種親和樹脂載體，連接蓖麻凝集素，分離純化了金花茶多糖。時(shí)照梅等［14］利用氧化石墨烯中固定凝集素，成功的用于糖蛋白與糖肽的富集，在蛋白質(zhì)組學(xué)中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。另外商業(yè)化的試劑盒中包含一系類固定化凝集素，可快速篩選能與目的蛋白結(jié)合的凝集素促進(jìn)凝集素技術(shù)的發(fā)展。

1.4 多糖類親和配基

多糖類材料包括瓊脂糖、葡聚糖、纖維素及殼聚糖等大分子物質(zhì)，它們具有親水多孔的結(jié)構(gòu)、比表面積大、物理化學(xué)穩(wěn)定性高、含有羥基及氨基等多種活性官能團(tuán)、能發(fā)生?；?、磺化、羥甲基化、羧甲基化等化學(xué)反應(yīng)、生物特性較好，并且來源廣泛、價(jià)格低廉、可循環(huán)利用等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的親和載體與配基，將其制備成親和膜已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。

多糖類材料多存在于農(nóng)作物秸稈中，童賢濤［15］等采用新型纖維素溶解體系NaOH/硫脲/尿素體系作為溶劑，對(duì)纖維素進(jìn)行溶解、過濾、脫泡，得到澄清的纖維素溶液，然后通過H2SO4、CH3COOH、H2SO4/Na2SO4等不同的凝固浴制備出了具有均勻致密的孔洞結(jié)構(gòu)纖維素膜，為纖維素膜的進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。為了提高造膜的穩(wěn)定性與識(shí)別能力，可以對(duì)親和膜表面進(jìn)行化學(xué)改造，王蕊［16］以紙纖維為基材，通過接枝改性獲得紙基疏水色譜分離膜，并考察所得分離膜對(duì)混合蛋白的分離性能。符瑞［17］采用超支化方法對(duì)纖維素膜進(jìn)行表面改性，通過在表面引入更多的功能基團(tuán)，增加吸附位點(diǎn)來提高蛋白的吸附量，制備了一種對(duì)于金屬離子和蛋白都有較高吸附量的超支化固定金屬離子親和膜。同時(shí)研究了該改性膜對(duì)蛋白的吸附性能，并將其用于含組氨酸標(biāo)簽蛋白的分離純化。

殼聚糖也是一種重要的多糖類親和材料，廣泛用于親和分離過程，Zeng等［18］利用乙二醇二縮水甘油醚對(duì)制備的大孔殼聚糖膜進(jìn)行交聯(lián)改性，可以用于吸附（等電點(diǎn)）pI＜6的蛋白。對(duì)卵白蛋白（pI=4.6）、人血清蛋白（pI=4.8）、大豆胰蛋白酶抑制劑（pI=4.5）的吸附量分別達(dá)到19 mg/mL、11.6 mg/mL、20.8 mg/mL。王蒼［19］利用點(diǎn)擊化學(xué)對(duì)親和膜表面的糖基化進(jìn)行構(gòu)建，制備了高密度的糖基化層，具有糖苷集簇效應(yīng)，提高了糖基對(duì)蛋白的結(jié)合與識(shí)別能力。

1.5 多肽類親和配基

多肽類配基一種較理想的親和配基，它由一些氨基酸組成，脫落后不會(huì)引起免疫反應(yīng)。多肽配基比抗體配基更穩(wěn)定，它們能進(jìn)行大規(guī)模無菌生產(chǎn)，降低了成本。與金屬和染料類配基相比，多肽配基特異性更高且具有無毒的特點(diǎn)。多肽與蛋白質(zhì)相互作用條件溫和，具有分離條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，能避免蛋白質(zhì)的變性。

朱俐燕［20］通過納米球表面氨基的引入，成功地將肽配基 HWRGWV偶聯(lián)于納米球表面，合成了具有抗體定向固定功能化的納米球?？疾炝斯δ芑{米球?qū)ωiIgG的吸附行為，進(jìn)而利用ITC研究了功能化納米球與IgG的相互作用。王榮柱［21］采用

混合模式層析分離方法高效分離抗體，通過抗體選擇性比較引出短肽配基，探討配基-抗體相互作用，設(shè)計(jì)和篩選高親和力的四肽配基，評(píng)價(jià)吸附性能，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜料液中高效分離抗體。研究結(jié)果有助于深入了解混合模式層析和短肽仿生層析的抗體分離模式，為新型配基設(shè)計(jì)和分離過程優(yōu)化提供指導(dǎo)。

自然界中存在能與生物大分子特異性結(jié)合的多肽種類有限，因此需要人工模擬合成多肽類似物。通常確定了目標(biāo)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，利用計(jì)算機(jī)模擬與組合化學(xué)的方法可以合成多肽類配基。趙勇山等［22］利用同源膜建和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法構(gòu)建了人類絲氨酸消旋酶的三維結(jié)構(gòu)，運(yùn)用分子對(duì)接程序?qū)⒍嚯念愐种苿┡c人類絲氨酸消旋酶進(jìn)行對(duì)接，研究了它們之間具體結(jié)合方式，確定了關(guān)鍵的氨基酸殘基，有利于人工模擬多肽的合成。盧慧麗［23］通過模擬天然配基結(jié)構(gòu)，基于目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)多肽配基進(jìn)行理性設(shè)計(jì)。利用組合化學(xué)技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)，計(jì)算機(jī)輔助篩選技術(shù)對(duì)仿生配基的篩選。此方法可方便、簡單、有效的篩選多肽類親和配基。董曉燕等［24］在前人的基礎(chǔ)上利用Fmoc固相合成法，從噬菌體展示肽庫中篩選出了能與胰島素特異性結(jié)合的七肽片段。Tong等［25］利用分子模擬方法研究了與IgG中Fc片段特異性結(jié)和的親和配基，分析發(fā)現(xiàn)它們之間的結(jié)合主要為疏水性相互作用。隨著人們對(duì)大分子親和配基研究的不斷深入，特別是對(duì)其機(jī)理的探索，有利于開發(fā)出更多新型廉價(jià)的多肽類配基。

2 小分子親和配基

相對(duì)于大分子親和配基，小分子親和配基穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉、具有廣泛的應(yīng)用前景。常用的小分子類親和配基包括染料類、氨基酸類配基等。

2.1 染料配基

染料配基與酶蛋白之間存在著特異性親和作用，是一種理想的親和配基。常用的染料配基為Cibacron Blue F3GA、Procion Red HE-3B、Procion Blue MX-R、Reactive Red 120 和 Reactive Brown 10。其中Cibacron Blue 3GA最常見，它含有氯化的三嗪活性官能團(tuán)可以在堿性條件下與含羥基的物質(zhì)發(fā)生親和取代反應(yīng)，從而固定在載體上分離蛋白。染料配基具有價(jià)格廉價(jià)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、結(jié)合蛋白容量大、容易再生等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诜蛛x純化血清蛋白、血清脂蛋白、凝塊因子、鐵傳遞蛋白等血液中的蛋白，核酸酶、干擾素、磷酸二酯酶、溶菌酶、聚合酶、脫氫酶和糖解酶等蛋白。

尼龍膜具有較好的機(jī)械性能可作為染料配基的載體。Chen等［26］在尼龍膜上連接Reactive Red 120、Reactive Brown 10染料配基，對(duì)木瓜蛋白的吸附量分別為143.6 mg/g、107.3 mg/g。Nie 等［27，28］用甲醛活化尼龍膜，殼聚糖修飾，偶聯(lián)Cibacron Blue F3GA，對(duì)木瓜蛋白的吸附能力達(dá)到235.3 mg/g?；厥章蔬_(dá)到94.3%，且不會(huì)使木瓜蛋白變性。對(duì)其吸附過程進(jìn)行熱力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)吸附為自發(fā)吸熱反應(yīng)。殼聚糖具有很好的生物相容性與豐富的官能團(tuán)，對(duì)染料配基的固定能力更好。Li等［29］在改性后的磁性殼聚糖微球上連接了Reactive Red 120，提高了對(duì)溶菌酶的吸附能力。染料配基擁有良好的應(yīng)用前景，但自身也存在著與目標(biāo)蛋白特異性低，有一定的毒性等缺點(diǎn)?？赏ㄟ^應(yīng)用生物信息學(xué)和分子模擬技術(shù)，人工設(shè)計(jì)出結(jié)合能力更高的生物模擬色素加以解決。

2.2 氨基酸類配基

氨基酸是含有氨基和羥基的一類化合物通稱，也是組成蛋白質(zhì)的基本單位。常用的氨基酸類配基包括組氨酸、精氨酸、色氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、絲氨酸?？捎糜趦?nèi)毒素去除與球蛋白的純化。

白金山［30］以瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B作為基質(zhì)，分別利用環(huán)氧氯丙烷和1，4-丁二醇-二縮水甘油醚對(duì)其進(jìn)行活化，得到不同間隔臂長度和活化密度的環(huán)氧基團(tuán)，進(jìn)一步進(jìn)行精氨酸配基的固定化，研究了不同間隔臂長度和配基密度對(duì)質(zhì)粒DNA動(dòng)態(tài)吸附容量的影響。鞠佳［31］以醋酸纖維素/聚乙烯基亞胺共混親和膜為基質(zhì)，通過戊二醛活化引入間隔臂，固載具有一定特異性吸附的5種有機(jī)胺和8種氨基酸配基強(qiáng)化了血清膽紅素的去除效果。徐堃［32］分別以L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸作為親和配基，以1，6-己二胺為間隔臂，連接到聚偏氟乙烯載體上，制備的親和膜可用于去除人血漿中的內(nèi)毒素。并將親和膜對(duì)動(dòng)物血漿中內(nèi)毒素的去除進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)，取得了很好的效果。

3 金屬類配基

3.1 金屬配基的作用原理

固定化金屬離子親和層析是Porath等于1975年首次提出的一種親和分離技術(shù)。由金屬離子、載體、間隔臂三部分組成。它利用金屬離子與暴露在目標(biāo)蛋白表面的氨基酸殘基如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基相結(jié)合的原理達(dá)到特異性結(jié)合的目的。不同的金屬離子與蛋白結(jié)合能力與其所帶電荷、離子半徑和電子層結(jié)構(gòu)有關(guān)，半徑越小與蛋白形成的配合物越穩(wěn)定。固定金屬離子的載體包括無機(jī)載體與有機(jī)載體，常見的無機(jī)載體為硅膠，有機(jī)載體為交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、大孔纖維素等。不同載體的物理、化學(xué)性質(zhì)的差異會(huì)直接影響與組氨酸的結(jié)合效率。用間隔臂連接金屬離子，可以減少空間位阻，并且有利于選擇性的結(jié)合蛋白，常用的間隔臂包括齒狀螯合劑亞氨基二乙酸、N-羥乙基乙二胺三乙酸與染料螯合劑Cibacron blue 3GA、Cibacron red 3BA。

3.2 金屬離子配基的應(yīng)用

組氨酸殘基對(duì)固定在IDA載體上的Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的親和力依次下降，如果目標(biāo)蛋白中部含組氨酸或連接不同的間隔臂，就需要選擇合適金屬離子。李瓊等［33］利用環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠，連接亞氨基二乙酸和羥甲基天冬氨酸間隔臂，螯合鎳離子與鈷離子，用于分離純化六聚組氨酸融合蛋白，純化效果優(yōu)于商業(yè)化的Ni-NTA介質(zhì)。制備的Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+可用于商業(yè)化中分離組氨酸標(biāo)記的蛋白。另外親和膜技術(shù)與金屬配基的結(jié)合用有助于提高分離純化目標(biāo)蛋白效率。Ke等和Eldin［34，35］利用環(huán)氧氯丙烷活化纖維素膜，連接IDA間隔臂，螯合銅離子，分離純化青霉素?；赴l(fā)現(xiàn)，氫氧化鈉濃度影響環(huán)氧氯丙烷活化效果，并確定了反應(yīng)的最佳條件。同時(shí)研究了不同金屬離子對(duì)D-海因酶酶活的影響發(fā)現(xiàn)，Mn2+、Co2+、Ni2+、Fe3+對(duì)D-海銀酶酶活具有促進(jìn)作用，Cu2+對(duì)酶活有抑制作用?？赡苁墙饘匐x子插入到D-海因酶

中，改變了酶的構(gòu)造。載體上連接不同的金屬離子純化D-海因酶，所得蛋白量與酶活均不同，提出利用不同金屬的協(xié)同作用分離純化目標(biāo)蛋白的方法。有時(shí)間隔臂的選擇會(huì)影響金屬配基的利用率，Wu等［36］在纖維素膜上連接了不同的螯合劑，齒狀螯合劑亞氨基二乙酸、N-羥乙基乙二胺三乙酸與染料螯合劑Cibacron blue 3GA、Cibacron red 3BA，分別偶聯(lián)Cu2+。比較了不同螯合劑的利用率及對(duì)蛋白質(zhì)吸附能力的影響，發(fā)現(xiàn)染料類螯合劑利用率較低但對(duì)蛋白的吸附能力優(yōu)于齒狀螯合劑。它們對(duì)溶菌酶、BSA、γ-球蛋白的吸附能力逐漸減小，可能是由于分子大小及可利用組氨酸數(shù)目不同引起的。本課題組用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的殼聚糖聚乙烯醇連接IDA做間隔臂，螯合銅離子做親和配基，研究這一系列膜對(duì)組氨酸標(biāo)記蛋白絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的分離純化，效果良好。

圖2 親和膜分離蛋白機(jī)理

3.3 金屬配基的優(yōu)缺點(diǎn)

金屬離子類配基具有價(jià)格低廉，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可再生等優(yōu)點(diǎn)在蛋白質(zhì)純化分離中已成為最有效的親和配基之一。但也存在著不足，如洗脫過程中會(huì)伴隨著金屬離子的問題，影響了目標(biāo)蛋白的純度及安全。目前可以通過選擇合適的洗脫液，或者在純化過程中增加吸附金屬離子的環(huán)節(jié)解決。

4 展望

隨著蛋白質(zhì)分離技術(shù)的發(fā)展，尋找合適的配基成為分離的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的生物大分子類配基特異性高但價(jià)格昂貴，小分子類、金屬類配基成為目前發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛的親和材料。隨著對(duì)親和配基識(shí)別機(jī)理的深入研究，制備性能更優(yōu)的配基成為了可能［37］。近年來反義肽的組合化學(xué)與分子模擬技術(shù)的發(fā)展為配基的篩選與設(shè)計(jì)提供了新的思路。分子印跡也為人工合成親和配體提供了新方法。另外親和載體的開發(fā)與制備，有利于高效的利用親和配基，提高純化效率。特別是親和膜技術(shù)的發(fā)展有利于其工業(yè)化的應(yīng)用。

［1］胡永紅, 李鳳珠, 韓曜平. 生物分離工程［M］. 武漢：華中科技大學(xué)出版社, 2015.

［2］李楊, 韓梅. 親和層析技術(shù)在生物科學(xué)中的應(yīng)用及發(fā)展［J］.生命科學(xué)研究, 2006, 10（1）：13-17.

［3］ 吳璞強(qiáng). 金黃色葡萄球菌蛋白A親和配基的分子改造與應(yīng)用［D］. 無錫：江南大學(xué), 2013.

［4］ 唐思遠(yuǎn). 人免疫球蛋白G的Fab和Fc片段制備及層析分離研究［D］. 杭州：浙江大學(xué), 2013.

［5］黃波. 抗體親和肽配基的理性設(shè)計(jì)和色譜表征［D］. 天津：天津大學(xué), 2011.

［6］ EI Khoury G, Lowe CR. A biomimetic Protein G affinity adsorbent：an Ugi ligand for immunoglobulins and Fab fragments based on the third IgG-binding domain of Protein G［J］. Journal of Molecular Recognition, 2013, 26（4）：190-200.

［7］ Mei L, Cao B, Yang H, et al. Development of an immunoaffinity chromatography column for selective extraction of a new agonist phenylethylamine A from feed, meat and liver samples［J］. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2014, 945-946：178-84.

［8］ 王明永, 張麗蕓, 張雅妮, 等. 聯(lián)合應(yīng)用配體和單克隆抗體親和層析純化人血漿天然MBL蛋白［J］. 免疫學(xué)雜志, 2008（2）：119-122.

［9］Hu SD, Liu H, Qiao SY, et al. Development of immunoaffinity chromatographic method for isolating glycinin（11S）from soybean proteins［J］. J Agric Food Chem, 2013, 61 （18）：4406-4410.

［10］Ruiz-May E, Catalá C, Rose JK, Rose K. N-glycoprotein enrichment by lectin affinity chromatography［J］. Methods Mol Biol, 2014, 1072：633-643.

［11］楊彥杰, 楊軍英, 張亞磊, 等. Con A型差異糖蛋白在大鼠肝再生中的作用研究［J］. 西北師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2013（4）：76-82.

［12］王志鳳. 小黑楊花芽和葉芽糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué), 2014.

［13］路垚, 林華娟, 楊基住. 凝集素親和層析技術(shù)分離金花茶多糖的研究［J］. 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用, 2014（4）：1-8.

［14］時(shí)照梅, 范超, 黃俊杰. 氧化石墨烯固定化凝集素的制備及在糖蛋白/糖肽富集中的應(yīng)用［J］. 色譜, 2015（33）：116-122.

［15］童賢濤, 鐘璇, 何小云, 等. 纖維素膜的制備及性能研究［J］.高分子通報(bào), 2013（10）：36-49.

［16］王蕊. 疏水色譜膜對(duì)混合蛋白的分離性能研究［D］. 北京：北京化工大學(xué), 2015.

［17］符瑞. 超支化固定金屬離子親和膜的制備及其吸附性能研

究［D］. 西安：西北大學(xué), 2015.

［18］Zeng XF, Ruckenstein E. Cross-linked macroporous chitosan anion-exchange membranes for protein separations［J］. Journal of Membrane Science, 1998（148）：195-205.

［19］ 王蒼. 高密度糖基化聚丙烯微孔親和膜的點(diǎn)擊化學(xué)制備及其蛋白質(zhì)分分離研究［D］. 杭州：浙江大學(xué), 2011.

［20］ 朱俐燕. 多肽配基定向化固定抗體的研究［D］. 天津：天津大學(xué), 2013.

［21］王榮柱. 以四肽為配基的仿生層析和抗體的分離純化［D］.杭州：浙江大學(xué), 2015.

［22］趙勇山, 鄭清川, 張紅星, 等. 人類絲氨酸消旋酶的同源模建及其與多肽抑制劑的分子對(duì)接［J］. 物理化學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 25（3）：417-422.

［23］盧慧麗, 林東強(qiáng), 姚善涇. 親和仿生層析及在抗體純化中的應(yīng)用［J］. 化工學(xué)報(bào), 2016, 67（9）：3523-3535.

［24］董曉燕, 曹俊, 俞海青, 等. 多肽親和配基的固相合成及其親和作用［J］. 天津大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 39（1）：29-33.

［25］Tong HF, Zhang QL, Lin DQ, et al. Molecular recognition of Fcspecific ligands binding onto the consensus binding site of IgG：insights from molecular simulation［J］. Journal of Molecular Recognition, 2014（27）：501-509.

［26］Chen TX, Nie HL, Shu B. Comparison：Adsorption of papain using immobilized dye ligands on affinity membranes［J］. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2009（72）：25-31.

［27］Nie HL, Zhu LM. Adsorption of papain with Cibcron Blue F3GA carrying chitosan-coated nylon affinity membranes［J］. International Journal of Biological Macromolecule, 2007（40）：261-267.

［28］Nie HL, Chen TX, Zhu LM. Adsorption of papain on dye affinity membranes：Isotherm, kinetic, and thermodynamic analysis［J］. Separation and Purification Technology, 2007（57）：121-125.

［29］Li ZH. Affinity adsorption of lysozyme with reactive red 120 modified magnetic chitosan microspheres［J］. Food Chemistry, 2014（145）：749-755.

［30］ 白金山. 精氨酸親和色譜分離純化超螺旋質(zhì)粒DNA［D］. 天津：天津大學(xué), 2013.

［31］ 鞠佳. 親和膜配基的結(jié)構(gòu)和密度對(duì)膽紅素吸附的影響［J］. 2013（64）：303-310.

［32］ 徐堃. 聚偏氟乙烯接枝氨基酸親和膜機(jī)器內(nèi)毒素脫出研究［D］. 杭州：浙江大學(xué), 2010.

［33］ 李瓊. 固定化金屬離子螯合瓊脂糖凝膠的制備及其純化組氨酸標(biāo)簽蛋白的研究［D］. 南京：南京理工大學(xué), 2012.

［34］ Ke YM, Chen CI, Chen H, et al. Exploring the complex effects of metal ions on D-hydantoinase purification with an immobilized metal affinity membrane［J］. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2011（42）：735-740.

［35］Eldin MSM. Novel immobilized Cu2+ion grafted cellophane membranes for affinity separation of His-Tag Chitinase［J］. Arabian Journal of Chemistry, 2014（45）：500-506.

［36］Wu CY, Suen SY, Chen SC, et al. Analysis of protein adsorption on regenerated cellulose-based immobilized copper ion affinity membranes［J］. Journal of Chromatography A, 2003（996）：53-70.

［37］Pina AS. Challenges and opportunities in the purification of recombinant tagged proteins［J］. Biotechnology Advances, 2014（32）：366-381.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Progress of Affinity Ligand in Affinity Separation Technology

ZENG Rong1JIN Bu-Kun2RUAN Tao2WU You2HOU Ya-Li2GONG Zhi-Wei2YANG Zhong-Hua2
（1. College of Chemistry and Chemical Engineering，Hubei University，Wuhan 430062；2. College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430062）

Affinity separation technology plays an increasingly important role in the proteins separation and purification field. Development of an appropriate ligand is the critical factor for affinity separation technology. In this work，the current research progress of the affinity ligand is reviewed according to three categories i.e. biological macromolecules affinity ligands，small molecule affinity ligands and metal iron affinity ligand. The current progress of each kind of ligand，its action mechanism and its deficiency are highlighted. Also，the prospect for development of affinity ligands is also given.

Specific adsorption；affinity；purification；chromatography；ligand

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.008

2016-03-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21376184）

曾嶸，女，講師，研究方向：膜分離技術(shù)；E-mail：rongZengco@163.com；靳步昆同為本文第一作者

楊忠華，男，教授，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化；E-mail：yangzh@wust.edu.cn