腫瘤干細(xì)胞中受H3K9me2調(diào)控的干性基因的篩選

陶虹張紹平張琳娜張漫扈啟寬，

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，銀川 750004；2. 寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，銀川 750004）

腫瘤干細(xì)胞中受H3K9me2調(diào)控的干性基因的篩選

陶虹1張紹平2張琳娜1張漫1扈啟寬1，2

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，銀川 750004；2. 寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，銀川 750004）

為了分析比較甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和組蛋白H3K9me2修飾在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與非干細(xì)胞中存在的差異，篩選出維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞干性的相關(guān)基因。通過(guò)G9a抑制劑促進(jìn)U87細(xì)胞成球和過(guò)表達(dá)G9a促進(jìn)U87細(xì)胞分化的方法，培養(yǎng)了成球的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和貼壁的非干細(xì)胞，這兩種細(xì)胞的CD133表達(dá)差異明顯。再利用H3K9me2抗體通過(guò)ChIP-seq技術(shù)比較H3K9me2修飾在干細(xì)胞組與非干細(xì)胞組中的差異，在存在差異的基因中，對(duì)TSS±2 000 bp范圍內(nèi)的基因進(jìn)行了GO分析，并隨機(jī)選出10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行QPCR驗(yàn)證，結(jié)果與ChIP-seq實(shí)驗(yàn)基本一致。

ChIP-seq；G9a；H3K9me2；Bix01294；U87細(xì)胞株

自我復(fù)制是干細(xì)胞所特有的特性，在保持高度增殖能力的同時(shí)還能維持子代細(xì)胞處于不分化狀態(tài)，并保持其多向分化潛能。腫瘤干細(xì)胞廣泛存在于各種腫瘤中［1-6］，也具有自我復(fù)制和多向分化的特性，并表達(dá)多種干細(xì)胞的標(biāo)志分子，如CD34、CD133、ALDH1、CXCR4、Nestin、LRCs等。腫瘤干細(xì)胞一般處于休眠或者低增殖狀態(tài)，但受到內(nèi)、外因素刺激后，便可被活化進(jìn)入自我復(fù)制和增殖狀態(tài)，成為腫瘤發(fā)生的“種子 ”［7］。

組蛋白H3K9（dimethylated histone H3 lysine 9）甲基化修飾是發(fā)生在組蛋白H3的9位賴氨酸殘基上的甲基化，與基因沉默相關(guān)［8］。在胚胎干細(xì)胞中，H3K9甲基化修飾的基因僅占基因組4%；當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，分化的細(xì)胞會(huì)失去H3K4與H3K27的

雙價(jià)可塑性修飾，轉(zhuǎn)而以更為永久的DNA甲基化與H3K9甲基化為標(biāo)記［9］。Sox2、c-myc、Oct4、nanog等是維持腫瘤干細(xì)胞自我復(fù)制至關(guān)重要的核心轉(zhuǎn)錄因子，在干細(xì)胞走向分化之后，這些基因必須被抑制，而這種抑制機(jī)制最可能與組蛋白H3K9甲基化修飾和DNA甲基化有關(guān)［10］。G9a是一種組蛋白賴氨酸（H3K9）甲基轉(zhuǎn)移酶，催化常染色質(zhì)H3K9的單甲基（H3K9me）和雙甲基化（H3K9me2）［11，12］。Bix01294是一種G9a抑制劑，可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的“神經(jīng)球”克隆成球率，同時(shí)促進(jìn)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD133和Sox2等干性基因的表達(dá)；轉(zhuǎn)染G9a表達(dá)質(zhì)粒則可以使CD133和Sox2表達(dá)水平明顯下降［13］。

我們?cè)谇捌诠ぷ鳎?3］中發(fā)現(xiàn)，將U87細(xì)胞用加Bix01294的成球培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7 d，可以得到質(zhì)量較好的成球細(xì)胞，其CD133表達(dá)量明顯升高，將此作為干細(xì)胞的模型；與此相對(duì)應(yīng)，我們用貼壁培養(yǎng)的U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染G9a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后2 d，這些細(xì)胞的CD133表達(dá)量有所下降，以此作為非干細(xì)胞的對(duì)照模型。在此兩種干細(xì)胞和非干細(xì)胞的模型中，我們擬采用ChIP-seq（Chromatin immunoprecipitationsequencing）技術(shù)對(duì)全基因組范圍內(nèi)H3K9me2修飾的基因進(jìn)行分析比較，試圖篩選出受H3K9me2修飾調(diào)控的“干性”相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1 材料

U87細(xì)胞株（北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、OPTI-MEM（HyClone公司）；RNA提取試劑盒、脂質(zhì)體試劑Lipofectamine 2000（INVITROGEN）；B27添 加 劑（GIBCO）；BFGF、EGF（INVITROGEN）；Bix01294（Sigma公司）；Q-PCR Mix（北京全式金）；抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87貼壁細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。U87成球細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Bix01294（每1 mL培養(yǎng)基中加濃度為1 mmol/L的Bix 1 μL），5-7 d成球。無(wú)血清培養(yǎng)基（100 mL）配制：DMEM/F12：96 mL；B27 supplement（50×）：2 mL；EGF（20 ng/ mL）：4 μL；Basic-FGF（20 ng/ mL）：40 μL；雙抗：1 mL；谷氨酰氨：1 mL。

1.2.2 G9a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 以人全基因組為模板，G9a引物進(jìn)行PCR（引物由上海杰瑞生物公司代理合成）。用PCR產(chǎn)物、表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1構(gòu)建G9a表達(dá)質(zhì)粒，鑒定完全正確后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，U87細(xì)胞接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，無(wú)抗生素培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，第2天細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%，將21.2 μL的G9a表達(dá)質(zhì)粒和20 μL Lipofectamine 2000混合液均勻滴入培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱6 h后換正常培養(yǎng)基。同樣方法轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。

1.2.3 Western blot檢測(cè)G9a、H3K9me2和CD133蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒、G9a表達(dá)質(zhì)粒3 d的貼壁細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)的成球細(xì)胞分別提取總蛋白，BAC法測(cè)蛋白濃度，每泳道上樣40 μg，10%SDSPAGE膠電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶封閉，一抗G9a（1∶1 000）、H3K9me2（1∶1 000）4℃冰箱孵育過(guò)夜，洗膜，二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，洗膜，滴加HRP發(fā)光液，曝光，顯影。

1.2.4 ChIP-seq樣本制備 將貼壁和懸浮細(xì)胞分別離心，室溫PBS重懸后加入終濃度為1%的甲醛輕微混勻，室溫放置固定10 min；加入終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸輕微混勻后置于冰上5 min，終止交聯(lián)；1 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，用等體積的冷PBS洗滌細(xì)胞兩次；1 500 r/min 4℃收集細(xì)胞，-80℃凍存。處理好的樣本交于上?？党缮锕こ逃邢薰咀鯟hIP-seq實(shí)驗(yàn)，公司做染色質(zhì)免疫沉淀使用的抗體是H3K9me2抗體。樣本在上機(jī)前進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，ChIP-seq樣品要求DNA總量大于10 ng，片段主峰分布在100-500 bp之間。本實(shí)驗(yàn)樣品：非干細(xì)胞片段主峰大小為234 bp，濃度為27.7 nmol/L；干細(xì)胞片段主峰大小為227 bp，濃度為15.3 nmol/L，符合上機(jī)測(cè)序要求，結(jié)果如圖1。

1.2.5 QPCR實(shí)驗(yàn) Trizol法分別提取干細(xì)胞和非干細(xì)胞的總RNA。以符合試驗(yàn)要求的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以SYBR Green為熒光標(biāo)記物，GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5

μL，2×Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR 擴(kuò)增循環(huán)：95℃ 5 min，然后94℃ 5 s、60℃ 15 s、72℃ 10 s，經(jīng)40次循環(huán)后72℃ 7 min。2-△△Ct法測(cè)定干細(xì)胞和非干細(xì)胞mRNA的相對(duì)表達(dá)量。QPCR引物由Premier Primer 5. 0 software設(shè)計(jì)。

圖1 CHIP-seq樣品質(zhì)量分析

表1 QPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)干細(xì)胞和非干細(xì)胞G9a、CD133、Sox2蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果（圖2）顯示，U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染G9a表達(dá)質(zhì)粒后，G9a和H3K9me2蛋白的表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明G9a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，同時(shí)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD133和干性相關(guān)基因Sox2的表達(dá)量顯著下降。加Bix01294的成球U87細(xì)胞，其G9a和H3K9me2蛋白的表達(dá)量顯著下降，但CD133和Sox2的表達(dá)量卻明顯增加。

圖2 Western blot檢測(cè)干細(xì)胞和非干細(xì)胞G9a、CD133、Sox2蛋白的表達(dá)情況

2.2 全基因組和第6號(hào)染色體上H3K9me2修飾差異的結(jié)果

2.2.1 全基因組H3K9me2修飾差異的結(jié)果 為了比較干細(xì)胞和非干細(xì)胞全基因組 H3K9me2修飾的差異，分別統(tǒng)計(jì)了干細(xì)胞和非干細(xì)胞全基因組H3K9me2的富集情況（即peaks數(shù)）及全基因組上的啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)共4個(gè)區(qū)域上H3K9me2的富集情況（即peaks數(shù)）。結(jié)果（表2）顯示，在干細(xì)胞和非干細(xì)胞的全基因組上，H3K9me2修飾差異不明顯，而且大多數(shù) H3K9me2 peaks分布在基因間區(qū)。

表2 干細(xì)胞和非干細(xì)胞H3K9me2修飾水平在全基因組上的分布情況

2.2.2 第6號(hào)染色體上H3K9me2修飾差異的結(jié)果 使用UCSC基因組瀏覽器，對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和

非干細(xì)胞的第6號(hào)染色體的H3K9me2分布情況進(jìn)行可視化展示，結(jié)果如圖3所示，第6號(hào)染色體上干細(xì)胞中H3K9me2的富集情況稍小于非干細(xì)胞中H3K9me2的富集情況。

圖3 干細(xì)胞和非干細(xì)胞中H3K9me2修飾水平在6號(hào)染色體上的分布情況

2.3 ChIP-seq實(shí)驗(yàn)篩選差異基因的結(jié)果

ChIP-seq分別篩選干細(xì)胞和非干細(xì)胞中受H3K-9me2調(diào)控的基因，結(jié)果（圖4）顯示在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（Transcription Start Site，TSS）±2 000 bp范圍內(nèi)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中受H3K9me2調(diào)控的基因有1 006個(gè)，非干細(xì)胞中受H3K9me2調(diào)控的基因有976個(gè)，其中有355個(gè)同時(shí)存在于干細(xì)胞和非干細(xì)胞中。受H3K9me2調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中254個(gè)，非干細(xì)胞中238個(gè)，同時(shí)存在于干細(xì)胞和非干細(xì)胞中的95個(gè)。從轉(zhuǎn)錄因子中隨機(jī)選取10個(gè)做QPCR檢測(cè)，其中6個(gè)選自干細(xì)胞，4個(gè)選自非干細(xì)胞。所選取轉(zhuǎn)錄因子的名稱及峰值位置見(jiàn)表3。

圖4 干細(xì)胞與非干細(xì)胞進(jìn)行ChIP-seq實(shí)驗(yàn)篩選得到的相關(guān)基因

表3 隨機(jī)選取10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的名稱及峰值位置

2.4 隨機(jī)選取的轉(zhuǎn)錄因子的QPCR結(jié)果及干細(xì)胞和非干細(xì)胞KLHL4、HOXC9、CHD2的H3K9me2修飾差異

2.4.1 隨機(jī)選取的轉(zhuǎn)錄因子的QPCR結(jié)果 對(duì)隨機(jī)選取的10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子做QPCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖5）顯示干細(xì)胞中隨機(jī)選取的FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9在干細(xì)胞中mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于非干細(xì)胞，其中PRDM13、KLHL4的表達(dá)量增加顯著，而從非干細(xì)胞中隨機(jī)選取的HOXA4、HOXC4、RNF13、CHD2在干細(xì)胞中mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于非干細(xì)胞，尤以CHD2表達(dá)量的降低最為明顯。

2.4.2 干細(xì)胞和非干細(xì)胞KLHL4、HOXC9、CHD2的H3K9me2修飾差異 ChIP-seq結(jié)果（圖6）顯示，

HOXC9在干細(xì)胞中H3K9me2修飾水平低于非干細(xì)胞，而CHD2在干細(xì)胞中H3K9me2修飾水平高于非干細(xì)胞，KLHL4變化不明顯。與QPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。

圖5 干細(xì)胞和非干細(xì)胞中H3K9me2修飾的轉(zhuǎn)錄因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖6 KLHL4、HOXC9、CHD2在干細(xì)胞和非干細(xì)胞中H3K9me2的修飾水平

2.5 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞基因的GO分析

GO結(jié)果（圖7）顯示，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程有乳腺腺泡和腺管的發(fā)育、肢體的形成、參與重力反應(yīng)、肌細(xì)胞融合、胚胎消化道的發(fā)生、環(huán)核苷酸分解代謝過(guò)程、光的傳入、聯(lián)會(huì)復(fù)合體的組裝及合胞體的形成；主要參與的細(xì)胞組分有軸突的形成、神經(jīng)肌肉接頭的傳遞及肌肉的收縮、遞質(zhì)貯存釋放、G蛋白等介導(dǎo)的細(xì)胞膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激、鉀通道；參與的分子功能主要有腺苷酸環(huán)化酶、MAP激酶、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶、二肽酶、環(huán)GMP磷酸二酯酶、鉀通道和作用于碳-氮鍵水解酶的活性，以及腎上腺素受體、翻譯起始因子、TBP類蛋白的結(jié)合。

3 討論

不論是在腫瘤細(xì)胞還是普通細(xì)胞中，干性都不是一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)［14，15］。被普遍認(rèn)為的腫瘤干細(xì)胞從靜態(tài)變?yōu)閯?dòng)態(tài)的說(shuō)法得到不斷的證實(shí)，這種轉(zhuǎn)變與腫瘤干細(xì)胞干性的得失密切相關(guān)［16］。在動(dòng)態(tài)腫瘤干細(xì)胞理論中，已分化的腫瘤細(xì)胞通過(guò)去分化的方式，可重新獲得干細(xì)胞特性［17］。腫瘤干細(xì)胞的特性主要依賴于特定基因的表達(dá)開(kāi)放與關(guān)閉［18］。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和表觀遺傳學(xué)迅速的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者意識(shí)到，表觀遺傳學(xué)在腫瘤的調(diào)控中也占有一席之地［19］。表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和RNA編輯等，它們?cè)诨虻暮塑账嵝蛄胁话l(fā)生改變的情況下調(diào)控基因的表達(dá)及細(xì)胞表型。如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2催化組蛋白形成H3K9me和H3K27me。研究表明，在T細(xì)胞淋巴瘤［20］、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中，上調(diào)EZH2的表達(dá)水平，腫瘤干細(xì)胞數(shù)量增多［21-25］，而藥物阻斷或下調(diào)EZH2，則導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞的自我增殖能力減弱，致瘤能力抑制［26，27］。

圖7 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞基因的GO分析

本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)ChIP-Seq方法篩選得到了一批峰值在TSS±2 000 bp范圍內(nèi)，而且在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中高表達(dá)而在非干細(xì)胞中低表達(dá)的干性基因，例如FEZF2、KLHL4、PRDM13、HOXC9等；QPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示干細(xì)胞中隨機(jī)選取的FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9在干細(xì)胞中mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于非干細(xì)胞，尤其KLHL4、PRDM13的表達(dá)量升高明顯，提示在干細(xì)胞中

FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9的H3K9me2修飾水平低，被抑制的程度弱，因此在干細(xì)胞中的表達(dá)量增加。而非干細(xì)胞中隨機(jī)選取的HOXA4、HOXC4、RNF13、CHD2在干細(xì)胞中的mRNA的相對(duì)表達(dá)量卻低于非干細(xì)胞，提示在非干細(xì)胞中HOXA4、HOXC4、RNF13、CHD2的H3K9me2修飾水平高，被抑制的程度強(qiáng)，因此在干細(xì)胞中的表達(dá)量降低。此外，GO分析結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程有乳腺腺泡和腺管的發(fā)育、肢體的形成、參與重力反應(yīng)、肌細(xì)胞融合、胚胎消化道的發(fā)生、環(huán)核苷酸分解代謝過(guò)程、光的傳入、聯(lián)會(huì)復(fù)合體的組裝及合胞體的形成；主要參與的細(xì)胞組分有軸突的形成、神經(jīng)肌肉接頭的傳遞及肌肉的收縮、遞質(zhì)貯存釋放、G蛋白等介導(dǎo)的細(xì)胞膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激、鉀通道；參與的分子功能主要有腺苷酸環(huán)化酶、MAP激酶、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶、二肽酶、環(huán)-GMP磷酸二酯酶、鉀通道和作用于碳-氮鍵水解酶的活性，以及腎上腺素受體、翻譯起始因子、TBP-類蛋白的結(jié)合。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)ChIP-seq技術(shù)比較了H3K9me2修飾在干細(xì)胞與非干細(xì)胞中的差異，篩選得到了一批H3K9me2修飾調(diào)控的“干性”相關(guān)基因：FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9等，并對(duì)TSS±2 000 bp范圍內(nèi)的基因進(jìn)行了GO分析。此外，對(duì)隨機(jī)選取10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行QPCR驗(yàn)證，結(jié)果與ChIP-seq基本相符。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening of Stem Genes Regulated by H3K9me2 in Tumor Stem Cells

TAO Hong1ZHANG Shao-ping2ZHANG Lin-na1ZHANG Man1HU Qi-kuan1，2
（1.The Department of Physiology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004；2. Ningxia Key Lab of Cerebrocranial Diseases，the National Key Laboratory Incubation Base，Yinchuan 750004）

In order to analyze and compare the modification differences of the methyltransferase G9a and histone（H3K9me2）between in glioma stem cells and non-stem cells，the related genes maintaining the stem of glioma stem cells were screened. By using G9a inhibitor to facilitate U87 cells into spheres，and G9a overexpression to promote the cell differentiation，the sphered glioma stem cells and monolayer nonstem cells were cultured，and there were significant differences in CD133 expression between the two cell models. Then we used H3K9me2 antibody to compare the differences of H3K9me2 modification between glioma stem cells and non-stem cells via ChIP-seq assay. Genes in the range of TSS ± 2 000 bp among the genes with differences were selected for GO analysis. Moreover，10 transcription factors were randomly selected to confirm the expression level by QPCR，and the result of which was almost consistent with that by ChIP-seq assay.

ChIP-seq；G9a；H3K9me2；Bix01294；U87 cell line

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.030

2016-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260246，31460300），寧夏醫(yī)科大學(xué)校級(jí)項(xiàng)目（XY201406）

陶虹，女，碩士，副教授，研究方向：神經(jīng)生理；E-mail：kellywar2003@163.com

扈啟寬，男，博士，教授，研究方向：神經(jīng)生理、干細(xì)胞；E-mail：huqikuan@163.com