多氯聯(lián)苯暴露對食蚊魚CYP19α和VTGα基因的表達及骨骼形態(tài)雄性化的影響

閆月明，方展強

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室，廣州 510631

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多氯聯(lián)苯暴露對食蚊魚CYP19α和VTGα基因的表達及骨骼形態(tài)雄性化的影響

閆月明，方展強*

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室，廣州 510631

應(yīng)用食蚊魚細胞色素P450芳香化酶基因(CYP19α)和卵黃蛋白原基因(VTGα)mRNA轉(zhuǎn)錄水平為指標，研究微量多氯聯(lián)苯(PCBs)長時間暴露對成年雌性食蚊魚CYP19α基因和VTG α基因表達的影響，并評價其對雌性食蚊魚產(chǎn)生的形態(tài)雄性化效應(yīng)。采用靜水暴露實驗?zāi)Ｊ剑謩e設(shè)置0.08、0.4、2和10 μg·L-1PCBs濃度，并設(shè)置對照組和平行組，定量測定14 d和28 d性腺CYP19α和肝臟VTGα mRNA表達水平的變化，以及對椎體脈棘發(fā)育的影響。暴露實驗結(jié)果顯示：①各PCBs濃度組(0.08、0.4、2和10 μg·L-1PCBs)暴露均能抑制食蚊魚CYP19α和VTG基因的表達，表明PCBs對食蚊魚VTGα基因的抑制遠大于對食蚊魚CYP19α基因的抑制；②0.4 μg·L-1PCBs暴露顯著地降低了食蚊魚第15椎體脈棘的長度并降低第15、16椎體脈棘的L/D值，顯示食蚊魚出現(xiàn)骨骼形態(tài)雄性化，表明一定濃度的PCBs暴露會表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)。

多氯聯(lián)苯(PCBs)；食蚊魚；CYP19α；VTGα；mRNA表達；椎體脈棘；形態(tài)雄性化

Received 24 November 2015 accepted 22 December 2015

由于工業(yè)的發(fā)展，大量的污染物被排放進入環(huán)境中，其中包含很多的環(huán)境激素類物質(zhì)。珠江三角洲地區(qū)，作為華南地區(qū)工業(yè)分布的重點區(qū)域，每年都有眾多的污水以及次級污水直接排放進入江河中，這些污染物中，多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)的含量明顯高于其他地區(qū)[1]。PCBs除了具有毒性外，還具有環(huán)境激素效應(yīng)。杜克久等[2]以人乳腺癌細胞系MCF27細胞為實驗材料，研究了2種國產(chǎn)PCBs的類雌激素效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在低濃度范圍內(nèi)，2種PCBs與典型的雌激素物質(zhì)17β-雌二醇(E2)一樣，表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)。楊麗麗等[3]以唐魚(Tanichthys albonubes)為研究材料，也發(fā)現(xiàn)PCBs與其他化合物的混合物也表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)。Armando Vega-López等[4]研究了PCBs混合物暴露對胎生吉鱂(Girardinichthys viviparus)的影響，結(jié)果表明胎生吉鱂的卵黃蛋白原含量發(fā)生了變化，說明PCBs具有激素效應(yīng)。Calò等[5]研究了2種不同類型的PCBs暴露(苯環(huán)共平面和不共平面)對金頭鯛(Sparus aurata)的影響，發(fā)現(xiàn)這2種不同類型的PCBs表現(xiàn)出不同的激素效應(yīng)，且在不同時間點表現(xiàn)出不同效果的激素效應(yīng)，結(jié)果顯示，無論是PCB-126、PCB-153單獨暴露，還是兩者混合暴露，在暴露12 h之后，金頭鯛體內(nèi)的VTG都會增加，PCBs表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)；在暴露24 h之后，PCB-126單獨暴露和與PCB-153聯(lián)合暴露，金頭鯛體內(nèi)的VTG含量減少，PCBs表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)，這可能是PCBs對生物體內(nèi)分泌有多個影響機制造成的。目前，關(guān)于PCBs毒性的研究較多，而關(guān)于其激素效應(yīng)的研究還處于起步階段。并且絕大多數(shù)的研究都集中在PCBs的急性激素效應(yīng)的研究上，而關(guān)于PCBs的慢性激素效應(yīng)的研究還不多。

在水生環(huán)境中，多種環(huán)境激素被排放進水體中，生長在水環(huán)境中的魚類受到嚴重的影響。受環(huán)境污染影響的魚類無論從形態(tài)方面還是基因表達方面都發(fā)生異常變化。目前較為被科學(xué)界認可的魚類生物標志物有卵黃蛋白原(VTG)，VTG mRNA的表達等。但是對于環(huán)境的檢測，不能憑借單一的標志物或者手段來得到結(jié)論，必須尋找更多的生物標志物，發(fā)展不同的手段，通過多種方法從而得到較為合理的結(jié)論。硬骨魚類(Osteichthyes)的CYP19基因與生物的性別分化和激素調(diào)節(jié)相關(guān)，所以成為近年來研究較熱門的生物標志物。Sarah等[6]、Yukinori等[7]、Rodrigo等[8]的研究均表明：受到環(huán)境污染或毒害的生物體體內(nèi)的CYP19基因表達都會發(fā)生異常。已有文獻報道，雄性黑頭呆魚(Pimephales promelas)[9]、青鳉(Oryzias latipes)[10]和斑馬魚(Danio rerio)[11]等小型魚類的CYP19基因的表達被作為生物標志物來探究與環(huán)境污染，尤其是環(huán)境激素(environmental hormone)污染的關(guān)系。

食蚊魚(Gambusia affinis)隸屬鳉形目(Cypriondontiformes)，胎鳉科(Poeciliidae)，食蚊魚屬(Gambusia)，是一種原產(chǎn)自北美洲的熱帶性卵胎生小型魚類，1927年從馬尼拉引入我國，食蚊魚具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)性，生長迅速，卵胎生，高生殖率等特點，所以成為我國南方廣泛分布的淡水小魚。食蚊魚具有明顯的二態(tài)性，雌魚第14、15、16椎體脈棘(vertebral ribs)與雄魚不同，性成熟的雄性個體其變長并向前彎曲，這種結(jié)構(gòu)可以在雄魚交配時為生殖足擺動提供足夠的支撐[12]。利用食蚊魚第14、15、16椎體脈棘的骨骼形態(tài)變化可以檢測環(huán)境激素類物質(zhì)暴露致魚類的雌/雄激素效應(yīng)[13]。而利用食蚊魚目標基因mRNA表達水平變化可更敏捷地檢測到水體環(huán)境激素類物質(zhì)暴露致魚類的雌/雄激素效應(yīng)[14-16]。本實驗首先克隆食蚊魚CYP19α基因片段；設(shè)定不同濃度的PCBs暴露成年雌性食蚊魚，應(yīng)用RT-qPCR(實時熒光定量PCR)技術(shù)，定量檢測PCBs對食蚊魚CYP19α基因和VTGα基因表達的影響，并比較食蚊魚第14、15、16椎體脈棘的形態(tài)變化情況，以探究PCBs的激素效應(yīng)。本研究成果填補食蚊魚CYP19α基因研究的空白，為珠江三角洲地區(qū)環(huán)境保護提供有參考價值的數(shù)據(jù)和資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)試劑

暴露試劑：多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)(Aroclor 1248)(Supelco公司，美國)，使用純度99.8%的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, sigma, DMSO)將PCBs進行溶解，配成保存液。DMSO在本實驗中作為溶劑對照，在先前的預(yù)實驗中證明其對實驗結(jié)果沒有影響。

分子試劑：RNAiso Plus (TAKARA, Dalian, China), PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TAKARA, Dalian, China), SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus) (TAKARA, Dalian, China)。其他生化試劑均為符合實驗規(guī)格要求國產(chǎn)試劑。

1.2 實驗動物

食蚊魚購自廣州市花鳥蟲魚市場。捕撈回實驗室后，放入魚缸進行飼養(yǎng)。在實驗室水族箱內(nèi)馴養(yǎng)2周，待死亡率小于2%后選取形態(tài)發(fā)育良好、反應(yīng)靈敏、大小均一健康的成年雌性個體用于暴露實驗。食蚊魚正常的雌雄個體鑒別及其性成熟的鑒定參照Leusch等[17]的描述。實驗魚的使用及實驗過程“參照實驗動物使用的3R原則進行”[18]。

1.3 染毒與制樣

將食蚊魚轉(zhuǎn)移到10 L的魚缸中進行暴露實驗，實驗所用水10 L，為曝氣24 h的自來水，硬度為2.4度(德國度)，pH(6.8 ～ 7.2)，水溫控制在(26 ± 1) ℃，光周期控制在約14 h : 10 h(light : dark)，采用靜水更新的實驗?zāi)Ｊ健嶒炘O(shè)置DMSO溶劑對照組，多氯聯(lián)苯(PCBs)設(shè)置0.08、0.4、2和10 μg·L-14個濃度組，每個濃度組投入食蚊魚數(shù)量為35條，并設(shè)置平行組。由于激素類物質(zhì)會降解，加之魚類的自身排泄物釋放到魚缸中會對魚類活動造成影響，每隔2天將魚缸中的水換掉，并清理魚缸，然后重新加激素。每天喂食紅蟲一次，并在相同的時間段(早上10點)進行。在第14天和28天進行實驗取樣，每個濃度每次至少取4條食蚊魚的性腺和肝組織，并迅速裝入離心管中，然后快速投入液氮中進行速凍，進行食蚊魚CYP19α基因和VTGα基因的實時熒光定量PCR檢測。

1.4 骨骼處理及形態(tài)參數(shù)計算

骨骼處理：冰浴將魚處死后拍照，然后將食蚊魚樣品浸泡在純水中1 d，以通過逆滲透的方式來水化組織，再用1%的KOH處理4 d ～ 5 d，每天換液，然后在體視顯微鏡下小心地剝?nèi)ヴ~皮及肉質(zhì)部，分使其只剩下骨骼，用1%的茜素紅S染色30 min左右，再放入KOH中浸泡10 min，小心去除剩余的肉和雜質(zhì)，清理好骨骼標本，在甘油中保存，待標本處理完全后在顯微鏡上用數(shù)碼相機(Canon EOS 500D)進行拍照。

骨骼形態(tài)參數(shù)計算：骨骼照片采用圖像處理軟件Adobe Photoshop CS4中的距離測量工具進行相關(guān)指標的測定。參照Rawson等[19]描述的測量方法，所測量的指標包括第14、15、16椎體脈棘總長，記錄為14L、15L、16L(圖1a)；第14、15、16椎體脈棘尾部尖端到脊柱的深度，記錄為14D、15D、16D(圖1b)。根據(jù)測量的指標分別計算第14、15、16椎體脈棘總長與椎體脈棘尾部尖端到脊柱深度之比值，即14L/D、15L/D、16L/D。

圖1 食蚊魚的骨骼測量注：a. 椎體脈棘的總長L(L = a + b + c)；b. D是指從椎體脈棘尾部尖端到脊柱的深度；14、15、16、17. 表示第14、15、16、17椎體脈棘。Fig.1 The skeletal morphology of mosquitofishNote: a. Total length of hemal spine L (L = a + b + c); b. Depth (D) measured from the distal tip of the hemal spine to the vertebral column; 14, 15, 16, 17. Show the 14th, 15th, 16th hemal spine.

1.5 分子生物學(xué)測定方法

引物設(shè)計:登錄NCBI網(wǎng)站，找到西部食蚊魚(Gambusia affinis)的VTGα cDNA的序列，并克隆了食蚊魚性腺CYP19α cDNA部分序列，利用Primer 3軟件(http://frodo.-wit.Edu/)，由生物工程(上海)公司合成需要的引物。本研究相關(guān)基因擴增引物名稱及其序列見表1。

RNA制備：總RNA提取：分別將性腺和肝臟組織勻漿，分別加入1 mL的Isoplus RNA (RNAiso Plus)提取液(TakaRa)進行總RNA提取。RNA提取后進行基因組DNA的去除，并檢測RNA濃度及其完整性，保證A260/A280的比值在1.8 ～ 2.0(TakaRa)。

RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA：使用TakaRa Code：DRR037 PrimScriptTMRT reagents Kit (Perfect Real Tome)產(chǎn)品。RT反應(yīng)液配制如下：5PrimeScript Buffer (2 μL), PrimeScript PT Enzyme Mix I (0.5 μL), Random 6 mers (100 μmol·L-1, 0.5 μL), Oligo dT Primer (50 μmol·L-1, 0.5 μL), Total RNA (1 μL), Rnase Free dH2O (5.5 μL)，總共10 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37 °C 15 min (cDNA合成)，85 ℃ 5 s(酶失活)。

實時熒光定量：使用TakaRa Code：DRR081A SYBRPremix Ex TaqTMII (2) 10.0 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX References Dye I (50) or ROX References Dye II (50) 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，H2O(滅菌)6.0 μL，總共20.0 μL。按照兩步法PCR擴增標準程序進行RT-PCR反應(yīng)。兩步法PCR擴增標準程序：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火32 s共40個循環(huán)。

表1 相關(guān)基因擴增引物名稱及其序列

注：所有DNA序列為5'到3'端。

Note: All DNA sequences are presented in the 5’to 3’direction.

RT-PCR擴增結(jié)果數(shù)據(jù)的處理采用相對定量法，內(nèi)參基因選用β-actin。經(jīng)熒光定量PCR分析儀分析，得出精確的Ct值后，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。

校正值=目的基因定量結(jié)果/管家基因定量結(jié)果

相對值=待測樣品的校正值/對照樣品的校正值

即倍數(shù)(Folds)= 2-△△Ct= 2- ((Ct A-Ct A actin)-(Ct B-Ct B actin))

其中，A為對照組樣品；B為各實驗組樣品；Ct值為閾值循環(huán)數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析(One wey-ANOVA)法對數(shù)據(jù)進行差異性分析。用Excel 2013做柱形圖。設(shè)置P < 0.05時，表示差異顯著；當P < 0.01時，表示差異極其顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 食蚊魚CYP19α基因片段的克隆

本實驗克隆了食蚊魚性腺CYP19α基因片段，其測序工作由生工(上海)公司完成?？寺～@得的食蚊魚性腺芳香化酶基因CYP19α基因總長為1 080 bp，將此基因片段與其他硬骨魚類的性腺CYP19α基因做同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與底鳉(Fundulus heteroclitus)、青鳉(Oryzias latipes)、羅非魚(Tilapia nilotica)、鯽魚(Carassius auratus)、斑馬魚(Danio rerio)、鯉魚(Cyprinus carpio)基因內(nèi)片段的相似度分別達到了91.2%、83.8%、83%、70.3%、70.2%、69.3%，表明克隆得到的基因即為食蚊魚CYP19α基因。

2.2 PCBs暴露對食蚊魚CYP19α和VTGα mRNA的表達水平

如圖2所示，與對照組相比，各個實驗組(0.08、0.4、2和10 μg·L-1PCBs)連續(xù)暴露14 d，食蚊魚性腺CYP19α基因的表達均受到抑制，其差異顯著或十分顯著(分別P < 0.05或P < 0.01)，并且隨著PCBs暴露濃度的升高，對食蚊魚CYP19α基因的表達抑制越強烈。連續(xù)暴露至第28天，各濃度組食蚊魚CYP19α基因的表達仍然顯示受到持續(xù)地抑制，但與對照組相比，只有2個相對較高濃度組(2 μg·L-1和10 μg·L-1PCBs)食蚊魚CYP19α基因的表達呈顯著性地下降(分別P < 0.05)，但2個相對較低濃度組與對照組相比差異不明顯(分別P > 0.05)。結(jié)果顯示，PCBs能夠抑制CYP19α基因的表達，并且隨著濃度的增加抑制作用增強；但隨著時間增加，其抑制作用將逐漸減弱。

圖2 多氯聯(lián)苯暴露食蚊魚CYP19α基因表達的水平注：Control. 對照組；0.08 μg·L-1. 0.08 μg·L-1 PCBs暴露組；0.4 μg·L-1. 0.4 μg·L-1 PCBs暴露組；2 μg·L-1. 2 μg·L-1 PCBs暴露組；10 μg·L-1. 10 μg·L-1 PCBs暴露組；誤差線表示的是標準偏差；星號用來表示染毒組與對照組之間的統(tǒng)計學(xué)差異；其中，*表示P < 0.05；**表示P < 0.01。下同。Fig. 2 CYP19α gene expressive levels in mosquitofish after exposure to PCBsNote: Control. control group; 0.08 μg·L-1. 0.08 μg·L-1 PCBs exposure group; 0.4 μg·L-1. 0.4 μg·L-1 PCBs exposure group; 2 μg·L-1. 2 μg·L-1 PCBs exposure group; 10 μg·L-1. 10 μg·L-1 PCBs exposure group. The error bars indicate the standard deviations; * P < 0.05 and ** P < 0.01 indicate significant differences between the controls and corresponding exposure groups. The same below.

圖3 多氯聯(lián)苯暴露食蚊魚VTGα基因表達的水平Fig. 3 VTGα gene expressive levels in mosquitofish after exposure to PCBs

如圖3所示，各個實驗組(0.08、0.4、2和10 μg·L-1PCBs)連續(xù)暴露14 d，食蚊魚肝臟VTGα基因的表達均受到極其強烈地抑制，各實驗組食蚊魚肝臟VTGα基因的表達分別僅為對照組的0.1、0.2、0.3和0.4倍，差異十分顯著(分別P < 0.01)；連續(xù)暴露至第28天，各個實驗組食蚊魚肝臟VTGα基因的表達水平仍然被十分顯著地抑制(分別P < 0.01)。結(jié)果顯示，PCBs暴露對VTGα基因表達的抑制十分強烈，并遠大于對CYP19α的抑制作用。

2.3 PCBs暴露對雌性食蚊魚第14、15、16椎體脈棘發(fā)育的影響

如圖4所示，經(jīng)過28 d PCBs暴露，各實驗濃度組(0.08、0.4、2和10 μg·L-1PCBs)食蚊魚第14椎體脈棘L值的變化與對照組相比均沒有明顯差異(分別P > 0.05)；各濃度組食蚊魚第15椎體脈棘的L值則都明顯增加，與對照組相比差異顯著(分別P < 0.05)，尤其較高濃度組(2 μg·L-1和10 μg·L-1PCBs)L值提升幅度較高；較低濃度組(0.08 μg·L-1和0.4 μg·L-1PCBs)食蚊魚第16椎體脈棘的L值與對照組相比均沒有明顯差異(分別P > 0.05)，但是較高濃度組(2 μg·L-1和10 μg·L-1PCBs)L值增幅更高，與對照組相比差異顯著或十分顯著(分別P < 0.05和P < 0.01)。結(jié)果顯示，椎體脈棘發(fā)育對外界環(huán)境激素物質(zhì)影響的敏感度為：第15椎體脈棘 > 第16椎體脈棘 > 第14椎體脈棘。

圖4 多氯聯(lián)苯暴露雌性食蚊魚第14、15、16椎體脈棘的長度(L)Fig. 4 The length (L) of 14th, 15th, 16th hemal spine in adult female mosquitofish exposed to PCBs

如圖5所示，經(jīng)過28 d PCBs暴露，各實驗濃度組食蚊魚第14椎體脈棘的D值的變化與對照組相比均沒有明顯差異(分別P > 0.05)；但是相對較高濃度組(2 μg·L-1和10 μg·L-1PCBs)食蚊魚的第15和第16椎體脈棘的D值都明顯增加，與對照組相比差異顯著或十分顯著(分別P < 0.05或P < 0.01)。結(jié)果顯示，較高濃度的PCBs(2 μg·L-1和10 μg·L-1)暴露致使雌性食蚊魚的第15和第16椎體脈棘的L和D值都同時顯著性地增加。

圖5 多氯聯(lián)苯暴露雌性食蚊魚第14、15、16椎體脈棘的深度(D)Fig. 5 The depth (D) of 14th, 15th, 16th hemal spine in female mosquitofish exposed to PCBs

圖6 多氯聯(lián)苯暴露雌性食蚊魚第14、15、16椎體脈棘長度與深度的比例(L/D)Fig. 6 The L/D ratio of 14th, 15th, 16th hemal spine in female mosquitofish exposed to PCBs

如圖6所示，經(jīng)過28 d PCBs暴露，0.4 μg·L-1實驗組PCBs暴露分別致使雌性食蚊魚的第15和第16椎體脈棘的L/D值降低，與對照組相比其變化分別具有顯著性差異(分別P < 0.05)，其他各PCBs濃度組變化不明顯(分別P > 0.05)。結(jié)果顯示，0.4 μg·L-1PCBs暴露顯著地降低了雌性食蚊魚第15和第16椎體脈棘的L/D值。

3 討論(Discussion)

3.1 PCBs暴露對食蚊魚CYP19α基因和VTGα基因表達的影響

PCBs是多種類似化合物的總稱，有多種同分異構(gòu)體，總共達209種，其中分為兩大類，一大類是不共平面的，而另一種則是共平面的。這兩大類PCBs所表現(xiàn)出的化學(xué)活性有較大區(qū)別。本次實驗所使用的PCB 1248為不共平面的多氯聯(lián)苯類型，在實驗的2次取樣中，雌性食蚊魚的CYP19α和VTGα mRNA表達均受到抑制，PCBs對VTGα基因的抑制比對CYP19α基因的抑制更為明顯。

Li等[20]以鼠睪丸間質(zhì)細胞I-10和人的腎上腺皮質(zhì)細胞H295R為實驗對象，研究了多種PCBs對細胞內(nèi)CYP19基因的表達情況，結(jié)果表明，PCB-126能夠增加CYP19基因的表達，而不共平面的PCB-39則起抑制作用。對豬的卵細胞研究也表明，PCB-126能夠增加雌二醇(E2)含量、芳香化酶活性，而PCB-153則起相反的作用[21-22]。共平面的PCBs，如PCB-126是生物體芳香烴受體(AhR)的激動劑[23]。它能夠激活A(yù)hR的活性，使AhR與核芳香烴受體轉(zhuǎn)位因子(Arnt)形成AhR-Arnt復(fù)合物，此復(fù)合物能夠與某些基因上游的DNA轉(zhuǎn)錄元件相結(jié)合，從而影響基因的表達，如P450家族的一些基因[24]。而不共面PCBs雖然不是AnR的激動劑，但是可以和天然結(jié)合到核受體上的激動劑發(fā)生競爭作用，從而影響基因的表達[25]。本實驗所使用PCB 1248含不共平面的PCBs。Li等[20]的研究表明，不共平面的PCBs，如PCB-39、PCB-153能夠抑制細胞內(nèi)CYP19基因的表達，與本實驗的結(jié)果相一致，說明不共平面的PCBs能影響P450家族基因的轉(zhuǎn)錄水平。相反地，對P450家族其他基因的研究表明，似乎不共面的PCB對其影響可能不發(fā)生在轉(zhuǎn)錄期內(nèi)。王偉等[26]以PCB 1211為材料，研究了其對小鼠肝微粒體CYP1A1酶活力的影響，未發(fā)現(xiàn)CYP1A1基因的mRNA表達。造成這種現(xiàn)象的原因可能是P450家族基因成員受影響的機制差異較大，也可能是由于PCBs結(jié)構(gòu)的不同造成的。本實驗表明，不共平面的多氯聯(lián)苯能夠抑制CYP19α基因的表達，并且隨著時間和濃度的增加抑制作用增強。而本實驗所采用的非共平面的PCBs對CYP19α基因的影響機制還有待繼續(xù)深入地研究。

VTGα基因主要控制動物卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)的合成，與生物的生殖相關(guān)，已被廣泛運用于外源激素對生物干擾的生物標志物。Hou等[27]、Xie等[28]的研究表明，野外受環(huán)境激素影響的食蚊魚VTG α基因表達均受到影響。Calò等[5]研究了2種典型的PCBs短期暴露對金頭鯛(Spaurus aurata)體內(nèi)VTGα的影響，發(fā)現(xiàn)12 h的暴露，無論是PCB-126、PCB-153還是兩者混合物的暴露，都能顯著地增加肝臟VTGα的表達，而暴露24 h，VTGα的表達量卻出現(xiàn)減少的現(xiàn)象，將暴露物移除48 h，VTGα的表達量又會顯著地減少。結(jié)果顯示暴露初期，PCBs表現(xiàn)出一定的雌激素效應(yīng)，而隨著暴露時間的增長，PCBs卻表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)。本實驗研究了長時間(28 d)PCBs暴露對食蚊魚VTGα基因表達的影響，暴露14 d，實驗設(shè)置的4個濃度PCBs均顯著地抑制VTGα的表達，而暴露28 d，4個濃度PCBs亦均顯著抑制VTG α基因的表達。這表明短時間的PCBs暴露和長時間的PCBs暴露對魚類VTGα基因的影響是完全不相同的。這是由于隨著暴露時間的增加，PCBs表現(xiàn)的不但是激素效應(yīng)，更表現(xiàn)出PCBs的毒性效應(yīng)，PCBs能通過代謝進入肝臟，對肝臟造成損傷，影響肝臟細胞的正常代謝[29]，因此可能由于該暴露大大降低了肝臟合成VTG的能力，從而影響魚類的正常代謝。然而PCBs對VTGα基因的作用機制，例如是直接作用于VTGα基因，還是與激素受體相結(jié)合，或是其他途徑影響VTGα表達，還有待于作進一步深入地研究。

3.2 PCBs暴露對雌性食蚊魚椎體脈棘骨骼發(fā)育的影響

食蚊魚雌魚和雄魚從外形上容易分辨，因而被學(xué)者們用來指示河流中的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[30-31]。正常情況下，食蚊魚雌魚的椎體脈棘比雄魚的要長，椎體脈棘至脊柱的距離也比雄魚的要深，雌魚的L/D值比雄魚的也要大。當食蚊魚受到外源激素的影響后，食蚊魚的椎體脈棘長度L值和椎體脈棘到脊柱的深度D值均會發(fā)生變化，雄魚第14、15、16椎體脈棘受激素影響的變化較大。范俊杰[32]的研究表明，雌性食蚊魚暴露于含有雄性活性物質(zhì)后，第14、15、16椎體脈棘骨骼的發(fā)育會發(fā)生變化，致使L值和D值也發(fā)生變化。本實驗發(fā)現(xiàn)，雌性食蚊魚的第15和16椎體脈棘發(fā)育受外界環(huán)境激素物質(zhì)影響較為敏感，尤其是雌性食蚊魚的第15椎體脈棘最為敏感。已有學(xué)者對食蚊魚的近緣種Gambusia holbrooki其骨骼發(fā)育的過程進行了十分詳細地觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性G. holbrooki的第16椎體脈棘最先發(fā)育，緊隨其后的是第14和第15椎體脈棘；將雄魚暴露于雌激素化合物中，則這種發(fā)育將會變得緩慢[33-34]。但是最近張曉嬋等[35]對捕自廣州市海珠涌和黃埔涌各采樣點食蚊魚(G. affinis)樣本觀察的結(jié)果表明，成體雌性食蚊魚的第15椎體脈棘對污染物(雄激素或類雄激素化合物)最敏感，其次為第16椎體脈棘，最后為第14椎體脈棘。對成體雄性食蚊魚樣本觀察的結(jié)果也表明，水體的污染物對第15椎體脈棘的發(fā)育最為敏感，相對第14和第16椎體脈棘來說，第15椎體脈棘最先出現(xiàn)變化，并向后增生鉤狀骨質(zhì)樣組織。而本實驗的結(jié)果也與以上報道的結(jié)果相一致。相對低濃度的PCBs(0.08 μg·L-1)暴露使雌性食蚊魚的第15椎體脈棘的長度(L值)增長(圖4)，而對其D值無明顯影響(圖5)；相對高濃度的PCBs(2 μg·L-1和10 μg·L-1)暴露致使雌性食蚊魚的第15和第16椎體脈棘的L值和D值都顯著性地增加(圖4和圖5)，但L/D值則無明顯變化(圖6)；0.4 μg·L-1PCBs暴露也顯著地減低了雌性食蚊魚的第15椎體脈棘的L值(圖4)，并且明顯降低了第15和第16椎體脈棘的L/D比值(圖6)。出現(xiàn)上述情況的原因可能是：①雌性食蚊魚第15椎體脈棘比較敏感，受外界物質(zhì)影響變化大；②長時間的PCBs暴露，其毒性可能會影響食蚊魚椎體脈棘的發(fā)育，這可以解釋高濃度的PCB暴露能影響雌性食蚊魚椎體脈棘的L值和D值；③0.4 μg·L-1PCBs顯著地降低了雌性食蚊魚第15和第16椎體脈棘的L/D值，使雌魚椎體脈棘出現(xiàn)形態(tài)雄性化的轉(zhuǎn)化趨勢，可能是長時間暴露，PCBs表現(xiàn)出的抗雌激素效應(yīng)。

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◆

Effects of PCBs Exposure onCYP19α,VTGα Gene Expression and Morphological Masculinizing of Bone Morphogenesis in Mosquitofish (Gambusiaaffinis)

Yan Yueming, Fang Zhanqiang*

Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China

The cytochrome P450 aromatase (CYP19α) and vitellogenin (VTGα) genes mRNA transcriptional levels in mosquitofish (Gambusia affinis) were detected in order to investigate the effects of trace PCBs on the CYP19α and VTGα expression in the adult female G. affinis for long time exposure, and evaluate its effect on the morphological masculinization in female G. affinis. G. affinis were randomly divided into five groups, with one control group and four experimental groups (0.08, 0.4, 2 and 10 μg·L-1PCBs). Parallel experimental groups were also established. The CYP19α and VTGα mRNA expression levels in fish gonad and liver tissues were determined after 14 and 28 d exposure, respectively. The effect of PCBs on the development of hemal spine was also detected. The exposure experiment results showed that: ① different concentrations of PCBs group (0.08, 0.4, 2 and 10 μg·L-1PCBs) exposure could inhibit the G. affinis CYP19αand VTGα gene expression, which suggested that the inhibition of PCBs on G. affinis VTGα gene was far greater than the inhibition of G. affinis CYP19α gene; ② 0.4 μg·L-1PCBs exposure significantly reduced the length (L) of 15th haemal spine, and reduced the L/D ratio of 15th and 16th haemal spine in G. affinis, which appeared masculinization of skeletal morphology. These showed that a certain concentration of PCBs exposure would show anti estrogen effect.

polychlorinated biphenyl (PCBs); Gambusia affinis; CYP19α; VTGα; mRNA expression; hemal spine; morphological masculinization

10.7524/AJE.1673-5897.20151109002

廣東高校城市水環(huán)境生態(tài)治理與修復(fù)工程技術(shù)研究中心建設(shè)項目(No. 2012gezxA004)

閆月明(1986-)，男，碩士，研究方向為水生動物生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: Yanyueming198615@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: fangzhq@scnu.edu.cn

2015-11-24 錄用日期：2015-12-22

1673-5897(2016)2-257-09

Q785; S917; X171.5

A

簡介：方展強(1953-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向水生動物生態(tài)毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文170余篇。

閆月明, 方展強. 多氯聯(lián)苯暴露對食蚊魚CYP19α和VTGα基因的表達及骨骼形態(tài)雄性化的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(2): 257-265

Yan Y M, Fang Z Q. Effects of PCBs exposure on CYP19α,VTGα gene expression and morphological masculinizing of bone morphogenetic in mosquitofish (Gambusia affinis) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 257-265 (in Chinese)