羥基化多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)在小鼠肝臟微粒體的體外代謝及對CYP450酶活性的影響

張易曦，張圣虎，吳永貴，劉濟寧，石利利

1. 貴州大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025 2. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

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羥基化多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)在小鼠肝臟微粒體的體外代謝及對CYP450酶活性的影響

張易曦1,2，張圣虎2,*，吳永貴1，劉濟寧2，石利利2

1. 貴州大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽 550025 2. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

羥基化多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)是一類具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的酚類化合物，生物毒性要高于母體多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)，研究OH-PBDEs的體外代謝行為對于理解其在生物體內(nèi)的富集轉(zhuǎn)化具有重要意義。以小鼠肝臟微粒體作為研究對象，考察了3-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、6-OH-BDE-47和2’-OH-BDE-68在小鼠肝臟中的體外代謝，并分別研究了濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 μmol·L-1條件下4種OH-PBDEs對細胞色素P450酶系中7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)、7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD)和苯胺4-羥基化酶(ANH)活性的影響。結(jié)果表明，4種OH-PBDEs在小鼠肝臟微粒體中均能夠快速代謝，代謝率分別為80% (3-OH-BDE-47)、42% (5-OH-BDE-47)、86% (6-OH-BDE-47)和63% (2’-OH-BDE-68)。實驗所設(shè)OH-PBDEs各濃度對微粒體的ECOD活性無顯著性抑制作用，但對EROD的活性均表現(xiàn)出相同的顯著抑制作用；4種OH-PBDEs表現(xiàn)出不同的ANH活性影響，即3-OH-BDE-47對ANH活性具有抑制作用，5-OH-BDE-47具有誘導(dǎo)作用，而6-OH-BDE-47和2’-OH-BDE-68對ANH活性無顯著性影響。

OH-PBDEs；肝微粒體；體外代謝；CYP450酶活

羥基化多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)是一類具有內(nèi)分泌干擾性質(zhì)的酚類化合物[1]，在環(huán)境介質(zhì)[1-4]與生物樣品[5-6]中普遍檢出。由于OH-PBDEs與甲狀腺激素(T4)具有相似的結(jié)構(gòu)，可以與T4競爭結(jié)合在甲狀腺轉(zhuǎn)移蛋白(TTR)上[7-8]，進而產(chǎn)生比母體多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)更大的生物毒性[9]。研究還發(fā)現(xiàn)OH-PBDEs同分異構(gòu)體間結(jié)構(gòu)的不同將導(dǎo)致毒性的差異，Canton等[10]研究表明，6-羥基-2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(6-OH-BDE-47)、4-OH-BDE-49和6-OH-BDE-99對CYP17的活性具有不同程度的抑制，進一步研究[11]發(fā)現(xiàn)羥基、溴原子和醚鍵三者之間的位置最終決定了對酶活性的影響。此外，OH-PBDEs對氧化磷酸化反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)都具有一定的干擾作用[3,7,12]。因此，考慮OH-PBDEs的生物毒性及一定的持久性，研究其在生物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化具有重要意義。

肝臟是外源性化合物在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化的重要器官，富含參與物質(zhì)代謝的重要酶系細胞色素P450混合功能氧化酶(CYPs)。CYPs可通過單加氧作用使脂溶性外源物質(zhì)失活，溶于水后排出細胞，再經(jīng)尿液排出體外[13]。目前，關(guān)于OH-PBDEs的肝臟代謝研究還相對較少，賴永權(quán)等[12]研究了OH-PBDEs在大鼠肝微粒體中的體外代謝，結(jié)果表明OH-PBDEs可以進一步轉(zhuǎn)化為溴酚和二羥基的多溴聯(lián)苯醚，且不同的溴取代數(shù)量表現(xiàn)出較大差異的代謝率。外源化合物在被CYP450酶代謝轉(zhuǎn)化的過程中，其本身也對某些CYP450酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用[14]，從而影響外源性化合物的代謝轉(zhuǎn)化。

本文用小鼠肝微粒體對普遍檢出的4種OH-PBDEs進行體外代謝研究。通過探討4種OH-PBDEs對CYP450酶系的ECOD(7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶)、EROD(7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶)和ANH(胺4-羥基化酶)活性的影響，有助于為評價OH-PBDEs在生物體內(nèi)的代謝行為提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分(Experimental section)

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國)；AG-285電子天平(瑞士Mettle公司)；2-16PK臺式離心機(Sigma公司)；Avanti J-26XPI系列高效離心機(美國Beckman Coulter公司)；UVmini-1240紫外分光光度計(日本Kyoto公司)；Tecan Infinite 200酶標儀(Tecan公司)；振蕩培養(yǎng)箱(INNOVA 43R，NBS公司)。

3-羥基-2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(3-OH-BDE-47)、5-羥基-2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(5-OH-BDE-47)、6-羥基-2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(6-OH-BDE-47)、2’-羥基-2,3’,4,5’-四溴聯(lián)苯醚(2’-OH-BDE-68)、三(羥甲基)氨基甲烷、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(Na2EDTA)、牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍G250、7-乙氧基試鹵靈、試鹵靈、甘氨酸、7-乙氧基香豆素、7-羥基香豆素、鹽酸苯胺、4-氨基苯酚均購自百靈威公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)購自美國Sigma Aldrich公司；甲醇和乙腈(色譜純，德國Merck公司)；氨水(色譜純，國藥集團藥業(yè)股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，藥檢專用，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；氯化鉀、苯酚(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

勻漿緩沖液：20%甘油、0.15 mol·L-1KCl、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1DTT，以0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制。

重懸緩沖液：20%甘油、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1DTT，以0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制。

1.2 肝微粒體的制備

SPF級ICR小白鼠(體重18～22 g，6周)購買自上海杰思捷實驗動物有限公司，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出肝臟，在冰浴中用冰冷的0.9%生理鹽水沖洗肝臟，用濾紙拭干后稱重，將肝臟剪成小塊，加入3倍重量的勻漿緩沖液(20%甘油、0.15 mol·L-1KCl、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1DTT，以0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制)在冰浴中進行勻漿；勻漿后的肝臟組織在4 ℃和9 000 g的條件下離心20 min，取上清液加入CaCl2，使最終濃度為8 mmol·L-1，混勻后在4 ℃和25 000 g的條件下離心15 min，棄去上清液，加入勻漿緩沖液再懸浮，于4 ℃和25 000 g的條件下離心15 min，棄去上清液，淡紅色沉淀物即為肝臟微粒體[15-16]。每克肝臟加入0.5 mL重懸緩沖液(20%甘油、1 mmol·L-1Na2EDTA、0.1 mmol·L-1DTT，以0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)配制)制成勻漿，置于液氮中保存。用Bradford法測定微粒體的蛋白質(zhì)含量[17]，在595 nm下測定吸光值以確定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白作為標準蛋白；蛋白濃度為7.069 mg·mL-1。

1.3 體外代謝實驗

代謝反應(yīng)總體積為2 mL，包含0.1 mol·L-1Tris-HCl、0.2 μmol·L-1OH-PBDE、0.3 mg·mL-1蛋白質(zhì)，OH-PBDEs用DMSO助溶(反應(yīng)體系中DMSO比例不大于1%)，加入NADPH啟動反應(yīng)，37 ℃下分別振蕩培養(yǎng)2 h，對照組為不含NADPH。

為優(yōu)化反應(yīng)條件，實驗選用不同的NADPH使用量考察4種OH-PBDEs的代謝效率，代謝反應(yīng)結(jié)束時加入2 mL冰乙腈，放入-20 ℃冰箱10 min后，取上清液過膜檢測OH-PBDEs的含量，并根據(jù)代謝反應(yīng)結(jié)束時OH-PBDEs的含量與初始含量比值計算代謝率。

樣品測定采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)：質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ESI-)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)，負離子模式，離子源溫度400 ℃，離子噴霧電壓5 500 V，氣簾氣壓力206 851.8 Pa，噴霧氣壓力241 327.1 Pa，輔助加熱氣壓力275 802.4 Pa；色譜條件為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，流動相0.02%(V/V)氨水(A)和乙腈(B)，A與B的比例為3:7，柱溫40 ℃，進樣體積5 μL，外標法定量。具體參數(shù)見表1。

1.4 OH-PBDEs對微粒體活性影響

分別考察不同濃度的OH-PBDEs對小鼠肝臟微粒體CYP450相關(guān)亞系活性的影響。設(shè)定OH-PBDEs在代謝體系中濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 μmol·L-1，于37 ℃條件下代謝30 min，終止反應(yīng)后，測定ECOD、EROD和ANH的活性，對照組不添加OH-PBDEs。

1.5 酶活性測定

ECOD(7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶)活性測定方法[18]：反應(yīng)體系包括0.1 mol·L-1Tris-HCl (pH 7.4)、1 mg·mL-1BSA、1 mmol·L-17-乙氧基香豆素、樣品液，加入NADPH啟動反應(yīng)，37 ℃下反應(yīng)10、20、40、60、120 min后，加入15%三氯乙酸終止反應(yīng)，用2 mL三氯甲烷萃取產(chǎn)物，渦旋2 min后3 000 g離心5 min，取出1 mL下層有機相，加入5 mL 0.6 mol·L-1NaOH-甘氨酸緩沖液(pH 10.4)，渦旋2 min后3 000 g離心5 min，上層水相用熒光酶標儀檢測反應(yīng)產(chǎn)物7-羥基香豆素的吸光度值，激發(fā)波長為370 nm，發(fā)射波長為450 nm，結(jié)果由產(chǎn)物7-羥基香豆素的生成量表示。

EROD (7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶)活性測定方法[19]：反應(yīng)體系包括0.1 mol·L-1Tris-HCl (pH 7.4)、1 mg·mL-1BSA、2 μmol·L-1乙氧基試鹵靈、樣品液，加入NADPH啟動反應(yīng)，37 ℃下分別10、20、30、40、60、120 min后，分別加入1 mL甲醇終止反應(yīng)，5 000 r·min-1下離心15 min，離心后的上清液用熒光酶標儀檢測反應(yīng)產(chǎn)物試鹵靈的吸光度值，激發(fā)波長為535 nm，發(fā)射波長為585 nm，結(jié)果由產(chǎn)物試鹵靈的生成量表示。

表1 4種OH-PBDEs的質(zhì)譜條件

圖1 不同NADPH濃度下小鼠肝微粒體代謝OH-PBDEsFig. 1 In vitro metabolism of OH-PBDEs by mice liver microsomes with different NADPH concentrations

圖2 不同濃度的OH-PBDEs與小鼠肝微粒體孵育30 min后對ECOD活性的影響 注：“CK30min”表示未添加OH-PBDEs時，孵育30 min后小鼠微粒體ECOD的活性；“*”表示處理組與對照組(CK30min)比較有顯著性差異，P<0.05。Fig. 2 Effect of OH-PBDEs at different concentrations on the ECOD activity after incubation with mice liver microsomes for 30 min Note:“CK30min” indicate the ECOD activity in mice microsome after incubation for 30 minutes without the addition of OH-PBDEs. “*”indicate the significant difference between the treatment groups and the control group (CK30min), P<0.05.

ANH(苯胺4-羥基化酶)活性測定方法[20]：反應(yīng)體系包括0.1 mol·L-1Tris-HCl (pH 7.4)、1 mg·mL-1BSA、1 mmol·L-1鹽酸苯胺、樣品液，加入NADPH啟動反應(yīng)，37 ℃下反應(yīng)30 min。加入20%三氯乙酸終止反應(yīng)，離心后取上清液加入1%苯酚(0.05 mol·L-1NaOH)和1 mol·L-1Na2CO3，混勻后室溫放置30 min，用紫外可見分光光度計在630 nm處檢測反應(yīng)產(chǎn)物4-氨基苯酚的吸光度值，結(jié)果由產(chǎn)物4-氨基苯酚的生成量表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理

酶活性測定的實驗結(jié)果，用平均值±標準偏差(mean ± SD)表示。采用Windows SPSS 17.0和獨立樣本T檢驗，對各處理組與對照組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P< 0.05為差異顯著(*)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 體外代謝NADPH量的優(yōu)化

肝臟微粒體中富含豐富的CYPs同工酶，CYP450酶是異生物質(zhì)代謝與解毒的重要酶系[21]，需要NADPH提供電子啟動代謝反應(yīng)。為了保證代謝反應(yīng)的進行，有必要優(yōu)化NADPH的使用量。不同NADPH添加量下4種OH-PBDEs代謝率如圖1所示。隨著反應(yīng)體系中NADPH添加量的增加，4種OH-PBDEs的代謝率隨之增加，而當(dāng)NADPH加入量大于0.3 mg·mL-1時，OH-PBDEs的代謝量基本保持不變，代謝率均能達到60%以上，因此選用0.3 mg·mL-1作為輔酶的添加量。

2.2 OH-PBDEs對CYP450酶系相關(guān)亞系酶活的影響

CYP450酶系中不同亞系對外源性化合物具有明顯的特異性代謝，外源化合物在被CYP450酶代謝轉(zhuǎn)化的過程中，其本身也對某些CYP450酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用[14]。ECOD、EROD、ANH是表征CYP450酶系主要代謝亞系活性的常用敏感酶學(xué)指標，其中，ECOD的活性常用于表征CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B1、CYP2B6和CYP2E1等亞系的活性[22]，EROD可以用于表征CYP1A亞系的活性[23]，ANH可以用來表征CYP2E1的活性[24]。

2.2.1 不同濃度OH-PBDEs對ECOD活性的影響

在未添加OH-PBDEs時，微粒體孵育10 min后ECOD活性為(378.109±24.082) pmol·min-1·mg protein-1，孵育30 min后ECOD活性為(350.533±14.692) pmol·min-1·mg protein-1，ECOD活性無顯著性變化(P>0.05)，結(jié)果表明30 min孵育時間內(nèi)微粒體ECOD活性基本保持穩(wěn)定。不同OH-PBDEs濃度下ECOD活性結(jié)果如圖2所示，隨著反應(yīng)體系中OH-PBDEs濃度的增加，各濃度組微粒體的ECOD活性均逐漸降低，但是與對照組相比不存在顯著性差異(P>0.05)。由此可見，4種OH-PBDEs對于微粒體的ECOD活性影響不明顯，不存在顯著的抑制作用。

2.2.2 不同濃度OH-PBDEs對EROD活性的影響

在未添加OH-PBDEs時，微粒體孵育10 min后EROD的活性為(32.149±7.660) pmol·min-1·mg protein-1，孵育30 min后EROD活性為(27.435±2.830) pmol·min-1·mg protein-1，EROD活性無顯著性變化(P>0.05)，結(jié)果表明30 min孵育時間內(nèi)微粒體EROD活性基本保持穩(wěn)定。不同OH-PBDEs濃度下EROD活性結(jié)果如圖3所示，各濃度組微粒體的ECOD活性與對照組相比具有顯著的抑制作用(P<0.05)，且隨著反應(yīng)體系中OH-PBDEs濃度的增加，各濃度組微粒體的EROD活性均逐漸降低，但是僅在添加濃度為0.1 μmol·L-1與1.0 μmol·L-1時具有顯著性差異(P<0.05)。此外，在反應(yīng)體系中添加相同濃度時，4種OH-PBDEs均表現(xiàn)出相同的抑制能力，即5-OH-BDE-47>3-OH-BDE-47>2’-OH-BDE-68>6-OH-BDE-47。

2.2.3 不同濃度OH-PBDEs對ANH活性的影響

在未添加OH-PBDEs時，微粒體孵育10 min后ANH的活性為(89.544±19.021) pmol·min-1·mg protein-1，孵育30 min后ANH活性為(27.422±3.511) pmol·min-1·mg protein-1，活性降低了60%以上(P<0.05)。不同OH-PBDEs濃度下ANH活性結(jié)果如圖4所示，隨著反應(yīng)體系中OH-PBDEs濃度的增加，4種OH-PBDEs表現(xiàn)出不同的活性影響。3-OH-BDE-47在實驗設(shè)置低濃度時具有顯著抑制作用(P<0.05)，但是隨著添加濃度的不斷增加，對微粒體中ANH活性的抑制作用逐漸降低；5-OH-BDE-47在實驗設(shè)置濃度下具有誘導(dǎo)作用，且隨著添加濃度的不斷增加，對微粒體中ANH活性的誘導(dǎo)作用逐漸增加，在實驗設(shè)置高濃度時具有顯著抑制作用(P<0.05)；6-OH-BDE-47和2’-OH-BDE-68對ANH活性影響不大。

圖3 不同濃度的OH-PBDEs與小鼠肝微粒體孵育30 min后對EROD活性的影響注：“CK30min”表示未添加OH-PBDEs時，孵育30 min后小鼠微粒體EROD的活性；“*”表示處理組與對照組(CK30min)比較有顯著性差異，P<0.05。 Fig. 3 Effect of OH-PBDEs at different concentrations on the EROD activity after incubation with mice liver microsome for 30 min Note: “CK30min” indicate the EROD activity in mice microsome after incubation for 30 minutes without the addition of OH-PBDEs. “*”indicate the significant difference between the treatment groups and the control group (CK30min), P<0.05.

圖4 不同濃度的OH-PBDEs與小鼠肝微粒體孵育30 min后對ANH活性的影響 注：“CK30min”表示未添加OH-PBDEs時，孵育30 min后小鼠微粒體ANH的活性；“*”表示處理組與對照組(CK30min)比較有顯著性差異，P<0.05。Fig. 4 Effect of OH-PBDEs at different concentrations on the ANH activity after incubation with mice liver microsome for 30 min Note: “CK30min” indicate the ANH activity in mice microsome after incubation for 30 minutes without the addition of OH-PBDEs. “*”indicate the significant difference between the treatment groups and the control group (CK30min), P<0.05.

3 討論 (Discussion)

研究表明，肝臟不僅是外源性化合物發(fā)揮毒性作用的主要靶器官，同時也是生物機體進行代謝轉(zhuǎn)化作用的主要器官[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于母體PBDEs而言[26]，4種OH-PBDEs更容易被肝臟微粒體所代謝，2 h后的代謝率分別為80% (3-OH-BDE-47)、42% (5-OH-BDE-47)、86% (6-OH-BDE-47)和63% (2’-OH-BDE-68)。Lai等[27]使用了大鼠肝臟微粒體代謝OH-PBDEs，孵育20 min后3’-OH-BDE-7、6’-OH-BDE-17、4’-OH-BDE-17和2’-OH-BDE-28代謝率就可達80%以上，6-OH-BDE-47、4’-OH-BDE-49、2’-OH-BDE-66和2’-OH-BDE-68孵育80 min后代謝率也可達到80%左右。這在一定程度上說明羥基官能團的引入提高了母體PBDEs的生物可用性，另一方面羥基、溴原子和醚鍵三者之間的位置也影響到OH-PBDEs的生物代謝，這與其對CYP450酶亞系酶活性的影響一致[18]。

微粒體氧化酶系存在于細胞的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其中細胞色素P450(CYPs)是重要的一族氧化酶系。一些CYP亞型會在特定的外源物質(zhì)存在時誘導(dǎo)后才會表達[28]，根據(jù)CYPs基因編碼的蛋白質(zhì)可分為構(gòu)成型CYP亞型和誘導(dǎo)型CYP亞型[29]，一般認為誘導(dǎo)型CYP亞型參與了外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化[30]。同時外源性化合物的代謝作用也影響CYPs的表達水平及誘導(dǎo)或抑制酶的活性。

在哺乳動物體內(nèi)，ECOD可以被CYP1A、2A、3A等多種CYP450亞型酶系催化[31]，因此ECOD活性一般可以作為表征CYP450總活性的指標。圖2結(jié)果表明，隨著4種OH-PBDEs濃度的增加，微粒體的ECOD活性呈降低趨勢，但是數(shù)理統(tǒng)計結(jié)果不存在顯著性差異。目前，對于OH-PBDEs對CYP450酶中各亞系的活性影響的研究報道較少，有文獻報道了與OH-PBDEs相似的物質(zhì)(2,4,4’-三氯-2’-羥基聯(lián)苯醚)能在生物體內(nèi)誘導(dǎo)ECOD的活性。Hanioka等[32]通過給大鼠喂食不同劑量的2,4,4’-三氯-2’-羥基聯(lián)苯醚，發(fā)現(xiàn)其可顯著誘導(dǎo)肝臟微粒體ECOD活性。雖然本實驗中4種OH-PBDEs在體外對微粒體ECOD活性的抑制作用不大，且與2,4,4’-三氯-2’-羥基聯(lián)苯醚在生物體內(nèi)對ECOD活性的誘導(dǎo)作用不同，但在一定程度上仍然可以說明CYP1A、CYP2A等幾種CYP450亞型很有可能參與到了4種OH-PBDEs的代謝過程，但具體參與亞型仍然需要進一步研究。

EROD酶屬于細胞色素P4501A族(CYP1A)，可以代謝許多具有共平面結(jié)構(gòu)的芳香性外源化合物(如多環(huán)芳烴PAHs、多氯聯(lián)苯PCBs)，這些特異性底物可以明顯誘導(dǎo)EROD活性，因此，常被作為指示環(huán)境污染狀況的敏感生物標志物[33]。圖3結(jié)果表明，4種OH-PBDEs不能誘導(dǎo)EROD活性，反而顯著抑制微粒體EROD的活性。這在母體BDE-47對EROD活性影響的研究中也得到類似結(jié)果，Olsvik等[34]研究表明BDE-47暴露可以顯著降低大西洋鱈幼魚肝臟CYP1A基因的表達水平[32]；周科等[33]研究發(fā)現(xiàn)BDE-47不能誘導(dǎo)銅銹環(huán)棱螺肝臟EROD活性，且高劑量還能導(dǎo)致EROD活性顯著降低。吳若函等[26]和沈夢楠[16]發(fā)現(xiàn)母體BDE-47對EROD活性的抑制作用可能是通過抑制CYP1A亞系的催化活性產(chǎn)生的，并已經(jīng)通過抑制劑實驗證明了CYP1A是微粒體代謝BDE-47的關(guān)鍵酶系。本研究所顯示的EROD活性顯著降低也很大可能是4種OH-PBDEs與EROD的反應(yīng)產(chǎn)物(乙氧基試鹵靈)產(chǎn)生了競爭性結(jié)合，抑制了CYP1A亞系對酶活底物的代謝，從而表現(xiàn)出EROD活性降低。據(jù)此可以認為，4種OH-PBDEs可能并不通過激活芳香烴受體來誘導(dǎo)EROD活性，這種競爭性抑制作用也說明4種OH-PBDEs可能也是CYP1A亞系的反應(yīng)產(chǎn)物。

ANH可以用來表征CYP2E1的活性，而肝臟是其主要表達器官[25]，目前研究發(fā)現(xiàn)CYP2E1參與脂類物質(zhì)氧化，它在肝臟中的過度表達可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷[35]，可能對CYP2E1酶蛋白有直接的抑制作用，進而造成CYP2E1酶活性的下調(diào)，這可能也是本實驗中微粒體ANH活性在孵育30 min后降低60%以上的原因之一，吳若函等[26]研究中也出現(xiàn)類似結(jié)果。圖4結(jié)果表明，隨著反應(yīng)體系中OH-PBDEs濃度的增加，4種OH-PBDEs表現(xiàn)出不同的ANH活性影響，由于CYP2E1的活性主要是由轉(zhuǎn)錄后蛋白的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)[24,36]，CYP2E1與底物結(jié)合后會出現(xiàn)構(gòu)象改變[37]，4種OH-PBDEs結(jié)構(gòu)的差異將導(dǎo)致CYP2E1酶蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的不同，這可能就是4種OH-PBDEs表現(xiàn)出不同活性的原因之一。

綜上所述，本文通過研究4種OH-PBDEs在小鼠肝微粒體中的代謝及其對表征微粒體中細胞色素P450酶主要亞系酶活的影響，結(jié)果表明4種OH-PBDEs均能夠在小鼠肝微粒體中快速代謝，代謝率分別為80% (3-OH-BDE-47)、42% (5-OH-BDE-47)、86% (6-OH-BDE-47)和63% (2’-OH-BDE-68)；實驗中各個濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、1 μmol·L-1)對ECOD的活性影響不大，但是均能顯著抑制EROD活性，此外，4種OH-PBDEs表現(xiàn)出不同的ANH活性影響，即3-OH-BDE-47對ANH活性具有抑制作用，5-OH-BDE-47具有誘導(dǎo)作用，而6-OH-BDE-47和2’-OH-BDE-68對ANH活性無顯著性影響。因此，對于確定哪種CYP450酶系的亞型在4種OH-PBDEs的代謝中起作用，還需要進一步研究。

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InvitroMetabolism and Effects of Hydroxylation Polybrominated Diphenyl Ether (OH-PBDEs) within Mice Hepatic CYP450 Enzymes

Zhang Yixi1,2, Zhang Shenghu2,*, Wu Yonggui1, Liu Jining2, Shi Lili2

1. College of Resources and Environmental Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China 2. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China

Received 14 December 2015 accepted 4 March 2016

Hydroxylation polybrominateddiphenyl ethers (OH-PBDEs) are a class of phenolic compounds that have been found to be endocrine disruption, and their biological toxicity is higher than the polybrominateddiphenyl ethers (PBDEs). It is of great significance to investigate metabolic behavior of OH-PBDEs in vitro for a better understanding of their enrichment and transformation in vivo. The in vitro metabolism of 3-OH-BDE-47, 5-OH-BDE-47, 6-OH-BDE-47 and 2’-OH-BDE-68 was investigated using mouse liver microsome. In addation，the effects of four OH-PBDEs (0.1, 0.2, 0.4, 0.6 and 1 μmol·L-1) on activities of 7-ethoxycoumarin O-deethylase (ECOD), 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) and aniline phydroxylase (ANH) were also evaluated. The results showed that four OH-PBDEs can be metabolized rapidly with the rate of 80% (3-OH-BDE-47)、42% (5-OH-BDE-47)、86% (6-OH-BDE-47) and 63% (2’-OH-BDE-68), respectively. Under these experimental conditions, four OH-PBDEs had no significant effect on ECOD activity, but all OH-PBDEs had inhibitory effect on EROD activity. In addition, four OH-PBDEs showed different effect on ANH activity. Specifically, 3-OH-BDE-47 had inhibitory effect on ANH activity, 5-OH-BDE-47 had induced effect on ANH activity, and 6-OH-BDE-47 and 2’-OH-BDE-68 had no significant effect, respectively.

OH-PBDEs; liver microsome; in vitro metabolism; CYP450 enzyme activity

10.7524/AJE.1673-5897.20151125004

國家自然科學(xué)基金(21407055)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140115)

張易曦(1989)，女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境毒理，E-mail: zhangyixi1021@icloud.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zsh@nies.org

2015-12-14 錄用日期：2016-03-04

1673-5897(2016)2-693-09

X171.5

A

簡介：張圣虎(1984-)，男，博士，助理研究員，主要從事環(huán)境污染物暴露評估和風(fēng)險評價研究。

張易曦, 張圣虎, 吳永貴, 等. 羥基化多溴聯(lián)苯醚(OH-PBDEs)在小鼠肝臟微粒體的體外代謝及對CYP450酶活性的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(2): 693-701

Zhang Y X, Zhang S H, Wu Y G, et al. In vitro metabolism and effects of hydroxylation polybrominated diphenyl ether (OH-PBDEs) within mice hepatic CYP450 enzymes [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 693-701 (in Chinese)