近海沉積物DlPCBs對(duì)斑馬魚胚胎EROD和cyp1a mRNA的影響

聶芳紅，蔡吉榛，王小寧，林紅英，Ravi Gooneratne，Anthony Hay，馬驛，巨向紅，鄭錦慶，陳進(jìn)軍,*

1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，湛江 524088 2. 廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江 524088 3. 林肯大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命學(xué)院，基督城 7647，新西蘭 4. 康奈爾大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)學(xué)院，伊薩卡 14853，美國(guó)

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近海沉積物DlPCBs對(duì)斑馬魚胚胎EROD和cyp1a mRNA的影響

聶芳紅1，蔡吉榛2，王小寧2，林紅英2，Ravi Gooneratne3，Anthony Hay4，馬驛2，巨向紅2，鄭錦慶2，陳進(jìn)軍2,*

1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，湛江 524088 2. 廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江 524088 3. 林肯大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命學(xué)院，基督城 7647，新西蘭 4. 康奈爾大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)學(xué)院，伊薩卡 14853，美國(guó)

為探究湛江近海域海洋沉積物中類二噁英多氯聯(lián)苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls, DlPCBs)的生物學(xué)毒性效應(yīng)，選取湛江近海域2個(gè)地點(diǎn)(近工業(yè)區(qū)TS和近生活區(qū)JSW)采集沉積物樣品，制備近海域沉積物DlPCBs提取物，將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的DlPCBs提取物，測(cè)定斑馬魚胚胎7-乙氧基異吩惡唑脫乙基酶(ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD)活性和cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JSW采樣點(diǎn)DlPCBs提取物染毒組EROD酶活性變化與TS采樣點(diǎn)DlPCBs提取物一致，在各染毒濃度下，斑馬魚仔魚EROD酶活性為對(duì)照組的1.1～1.8倍。TS和JSW采樣點(diǎn)不同濃度DlPCBs提取物暴露斑馬魚胚胎96 h后，使斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的3.36～19.45倍。說明一定濃度的近海沉積物DlPCBs能誘導(dǎo)斑馬魚仔魚EROD酶活性和cyp1a mRNA表達(dá)量升高，且呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系。

類二噁英多氯聯(lián)苯；斑馬魚胚胎；EROD酶；cyp1a mRNA；近海沉積物

類二噁英多氯聯(lián)苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls, DlPCBs)來源廣泛，具有強(qiáng)毒性、生物蓄積性、全球遷移性等特點(diǎn)，未來很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)將是動(dòng)物和人類健康安全的巨大隱患。海洋沉積物是DlPCBs的重要蓄積地，經(jīng)過生物富集而大量存在于魚類體內(nèi)，污染蛋白類飼料原料，最終通過食物鏈污染進(jìn)入動(dòng)物及人體內(nèi)[1-2]。斑馬魚(Danio rerio)是毒理學(xué)與藥理學(xué)的優(yōu)良模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[3-4]。本研究提取凈化近海域沉積物中DlPCBs，利用斑馬魚胚胎活體EROD酶活性測(cè)定法和熒光定量PCR技術(shù)，探索DlPCBs提取物對(duì)斑馬魚胚胎EROD酶活性和cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響，為利用斑馬魚胚胎CYP1A進(jìn)行DlPCBs污染的生物檢測(cè)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀(GC-ECD，6890N型，配有電子捕獲檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)，真空冷凍干燥機(jī)(LGJ-10B型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)，醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(KQ3200DE型，昆山超聲儀器有限公司)，玻璃層析柱(1997A型，上海子期實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，氮吹儀(LBM-1J型，北京萊伯曼公司)；PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)，核酸蛋白檢測(cè)儀(BioPhotometer plus型，德國(guó)Eppendorf公司)，ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

正己烷(色譜純，美國(guó)Burdick & Jackon公司)，丙酮(色譜純，美國(guó)J.T. Baker公司)，佛羅里土(60～100目，美國(guó)Sigma公司)，無水硫酸鈉，PCB77、PCB81、PCB105、PCB114、PCB118、PCB123、PCB126、PCB156、PCB157、PCB167、PCB169、PCB170、PCB180、PCB189(美國(guó)o2si公司)；總RNA提取試劑盒(TRIZOL Reagent)、一般PCR試劑盒(TaqTM)、DL 2000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser)、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(Perfect Real Time)均為Takara公司產(chǎn)品。

1.2 近海沉積物DlPCBs提取物的制備

以Khim等[5]和Koh等[6]所述方法為依據(jù)，將采集于湛江調(diào)順島(TS)和金沙灣(JSW)的近海域沉積物樣品冷凍干燥，研碎，過80目篩。稱取30 g于500 mL三角燒瓶中，加入300 mL正己烷和丙酮1∶1(V∶V)，另加1 g銅粉脫硫，超聲波提取30 min，靜置后分離有機(jī)溶劑層，重復(fù)上述步驟一次，合并2次提取液。轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃濃縮至5 mL左右，加入10 mL正己烷繼續(xù)濃縮至2 mL，待凈化。凈化方法為：用正己烷潤(rùn)濕層析柱，在柱內(nèi)加入10 g已活化的佛羅里硅土，再加10 mm厚的無水硫酸鈉，排出過量正己烷至剛淹沒無水硫酸鈉層，關(guān)閉活塞。將樣品提取液移入柱內(nèi)，用100 mL正己烷進(jìn)行淋洗，將洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下濃縮至10 mL左右，轉(zhuǎn)移至濃縮管，用氮?dú)鉂饪s至2 mL，1 mL用于氣相色譜法儀器分析，另外1 mL用于后續(xù)斑馬魚胚胎試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚(Danio rerio)，購(gòu)自湛江花鳥魚市場(chǎng)，由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院進(jìn)行品種鑒定。在水族箱適應(yīng)性飼養(yǎng)1個(gè)月后用于繁殖試驗(yàn)，養(yǎng)殖用水為自然曝氣3 d的自來水，水溫控制在26～28 ℃。挑選體長(zhǎng)為3.5 cm左右的斑馬魚(雌∶雄=1∶2)置于繁殖用水族箱中，每天飼喂2次，光照與黑暗周期控制在14 h/10 h，試驗(yàn)當(dāng)天早上以光照刺激斑馬魚配對(duì)并產(chǎn)卵，0.5 h內(nèi)用胚胎收集器收集斑馬魚胚胎。

1.4 斑馬魚胚胎染毒

近海沉積物DlPCBs提取物的最終染毒濃度依據(jù)斑馬魚胚胎急性毒性試驗(yàn)96 h的LC50配制，分別以DlPCBs提取物對(duì)斑馬魚胚胎的LC50為最高濃度，二倍遞減進(jìn)行稀釋，配制5個(gè)濃度(TS采樣點(diǎn)DlPCBs提取物的染毒濃度為60、30、15、7.5、3.75 mg·mL-1；JSW采樣點(diǎn)DlPCBs提取物的染毒濃度為70、35、17.5、8.75、4.375 mg·mL-1)，設(shè)空白對(duì)照組和0.1% DMSO對(duì)照組。斑馬魚胚胎染毒試驗(yàn)按照OECD(2012)方法進(jìn)行[7]，試驗(yàn)期為96 h，每天定時(shí)更換一半染毒溶液。

1.5 斑馬魚胚胎EROD酶活性測(cè)定

采用胚胎活體EROD酶測(cè)定法測(cè)EROD酶活性，綜合Liu和Marit的方法[2,8]改良后進(jìn)行。最終的分析結(jié)果為5條仔魚熒光強(qiáng)度的平均值。

1.6 斑馬魚胚胎cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

將20個(gè)染毒96 h后的斑馬魚仔魚收集于離心管后，馬上放入-80 ℃保存至提取RNA。用Trizol總RNA提取試劑盒提取斑馬魚仔魚總RNA。用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃下保存。cyp1a基因和內(nèi)參基因β-actin序列從Genebank獲得，其序列號(hào)分別為AF210727和AF057040，利用軟件Prime 5.0 設(shè)計(jì)引物。cyp1a基因上游引物為：AGGACAACATCAGAGACATCACCG，下游引物為：CACTAGATAGACAACCGCCCAGG，產(chǎn)物片段大小179 bp；β-actin上游引物為：GATGCGGAAACTGGCAAAGG，下游引物為：GAGGAGGGCAAAGTGGTAAACG，產(chǎn)物片段大小為116 bp。熒光定量PCR反應(yīng)按設(shè)定條件進(jìn)行，0.5 ℃增值進(jìn)行熔解曲線分析，以檢驗(yàn)產(chǎn)物的特異性。最終利用Fold = 2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[9]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 斑馬魚胚胎EROD酶活性

熒光生物顯微鏡可觀察到各DlPCBs提取物染毒組斑馬魚仔魚的腸道、眼睛、卵黃囊積累了熒光產(chǎn)物(resorufin)，其熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于對(duì)照組，而0.1% DMSO對(duì)照組仔魚熒光強(qiáng)度很低(圖1F1)。TS采樣點(diǎn)DlPCBs提取物最高濃度組(60 mg·mL-1)仔魚可觀察到心包水腫，在熒光顯微鏡下可觀察到腸道和卵黃囊明顯的熒光產(chǎn)物積累(圖1A1)。

利用光密度分析軟件對(duì)腸道和卵黃囊熒光產(chǎn)物進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，與對(duì)照組比較，可得不同染毒濃度的仔魚EROD活性相對(duì)大小(圖2)。7.5 mg·mL-1染毒組的斑馬魚EROD活性為對(duì)照組的1.1倍(P<0.05)，15 mg·mL-1、30 mg·mL-1、60 mg·mL-1染毒組EROD活性分別為對(duì)照組的1.2、1.8和1.5倍(P<0.01)。JSW采樣點(diǎn)DlPCBs提取物染毒組EROD酶活性變化與TS采樣點(diǎn)DlPCBs提取物類似，染毒濃度達(dá)17.5 mg·mL-1時(shí)，斑馬魚仔魚EROD酶活性為對(duì)照組的1.26倍(P<0.05)，35 mg·mL-1和70 mg·mL-1的DlPCBs提取物染毒組EROD活性分別為對(duì)照組的1.38和1.42倍(P<0.01)。

圖1 TS采樣點(diǎn)DlPCBs提取物染毒斑馬魚胚胎96 h后的熒光圖和普通顯微鏡圖(100×) 注：A1～F1為熒光圖，A2～F2為普通顯微鏡圖；A、B、C、D、E分別為60 mg·mL-1、30 mg·mL-1、15 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1、3.75 mg·mL-1 DlPCBs提取物組，F(xiàn)為0.1% DMSO對(duì)照組。Fig. 1 Fluorescent and digital images of zebrafish larvae exposed to different concentrations of TS sediment DlPCBs extracts for 96 h (100×)Note:A1-F1 indicate fluorescent microscopic images of the zebrafish larvae; A2-B2 indicate light microscopic images of the zebrafish larvae. A, B, C, D, E were zebrafish larvae treated with 60 mg·mL-1, 30 mg·mL-1, 15 mg·mL-1, 7.5 mg·mL-1, 3.75 mg·mL-1 of DlPCBs extract, F were zebrafish larvae in the control.

2.2 DlPCBs提取物對(duì)斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

不同濃度的DlPCBs提取物暴露斑馬魚胚胎96 h后，使斑馬魚仔魚cyp1a mRNA表達(dá)發(fā)生變化(圖3)。TS采樣點(diǎn)3.75 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的3.36、3.37倍(P<0.05)，15 mg·mL-1、30 mg·mL-1、60 mg·mL-1濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組4.87、7.11和7.59倍(P<0.01)；JSW采樣點(diǎn)4.375 mg·mL-1的DlPCBs提取物對(duì)仔魚cyp1a mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，8.75 mg·mL-1濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，17.5 mg·mL-1、35 mg·mL-1和70 mg·mL-1的JSW采樣點(diǎn)DlPCBs提取物濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的8.39、18.82和19.45倍(P<0.01)。DlPCBs提取物與斑馬魚仔魚cyp1a mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系。

圖2 TS和JSW采樣點(diǎn)的DlPCBs提取物染毒斑馬魚胚胎96 h后活體EROD酶相對(duì)活性變化 注：n=5；*與對(duì)照組比，P<0.05，**與對(duì)照組比較，P<0.01。Fig. 2 In vivo EROD activity in zebrafish larvae exposed to DlPCBs extracts from TS and JSW for 96hNote: Mean±SEM, n=5. * P<0.05, **P<0.01, compared with control.

圖3 TS和JSW采樣點(diǎn)DlPCBs提取物染毒96 h對(duì)供試斑馬魚胚胎cyp1a基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 注：n=3；與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig. 3 Fold-change in cyp1a mRNA expression in zebrafish embryos exposed to different concentrations of TS and JSW sediment DlPCBs extracts for 96 h Note: Mean±SEM (n=3). *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

3 討論(Discussion)

3.1 DlPCBs提取物使斑馬魚仔魚EROD酶活性增加

哺乳動(dòng)物的EROD酶是由CYP1A1介導(dǎo)的，是二噁英類污染物的生物標(biāo)志物[10]。Tsang等[11-12]利用EROD法檢測(cè)了水體、沉積物、魚肉和雞蛋的二噁英類化合物污染水平。斑馬魚胚胎EROD酶活性的檢測(cè)方法有2種。一種是基于熒光分光光度計(jì)或多功能酶標(biāo)儀的檢測(cè)方法；另外一種方法稱為胚胎活EROD酶檢測(cè)法，利用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡測(cè)定resorufin的熒光強(qiáng)度，反映EROD酶活性大小[12]。Liu等[2]和Tsang等[12]利用斑馬魚胚胎活體EROD酶檢測(cè)法研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的DlPCBs、TCDD或PAHs能誘導(dǎo)斑馬魚胚胎EROD酶活性升高。本研究結(jié)果表明，DlPCBs提取物能誘導(dǎo)胚胎EROD酶活性升高，通過熒光顯微鏡可觀測(cè)到resorufin主要分布于斑馬魚胚胎的腸道、眼睛、卵黃囊和血管，這與Otte利用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)到的結(jié)果基本一致[13]。

Khim等[5]和Koh等[6]用正己烷和丙酮1:1(V/V)進(jìn)行浸提，再用佛羅里硅土柱層析法凈化，將沉積物中的PCBs與PAHs、OCPs和PCDD/Fs分離，有效提高了儀器和生物學(xué)分析的特異性。本研究將沉積物用正己烷和丙酮1:1(V/V)結(jié)合超聲波進(jìn)行提取和佛羅里土柱層析凈化得到DlPCBs提取物，染毒斑馬魚胚胎96 h后發(fā)現(xiàn)一定濃度的DlPCBs提取物能使胚胎EROD酶活性增加，呈現(xiàn)明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，這與PCB126對(duì)斑馬魚胚胎EROD酶活性的影響相類似[2]。由此說明，斑馬魚仔魚EROD活性對(duì)DlPCBs敏感，能有效指示沉積物DlPCBs污染，胚胎活體EROD酶測(cè)定方法簡(jiǎn)單方便，具有一定的應(yīng)用前景。

3.2 DlPCBs提取物上調(diào)斑馬魚仔魚cyp1a mRNA表達(dá)量

生物體cyp1a mRNA的基底表達(dá)量很低，一定濃度的DlPCBs可通過AhR途徑使cyp1a mRNA表達(dá)量呈濃度依賴升高。因此cyp1a基因的表達(dá)量常用于指示DlPCBs等二噁英類化合物污染的生物標(biāo)志物[14-15]。本研究將斑馬魚胚胎暴露于DlPCBs提取物中96 h，發(fā)現(xiàn)TS采樣點(diǎn)不同濃度的DlPCBs提取物均能顯著誘導(dǎo)cyp1a mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)，JSW采樣點(diǎn)除最低濃度(4.375 mg·mL-1)外，其他濃度的DlPCBs提取物均能顯著誘導(dǎo)cyp1a mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)，cyp1a mRNA表達(dá)量的變化與EROD酶活性的變化一致，呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系?？梢娡ㄟ^測(cè)定斑馬魚胚胎cyp1a mRNA表達(dá)量能反映沉積物DlPCBs的污染水平[16]。

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EROD Activity andcyp1amRNA Expression in Zebrafish Embryo Exposed to Marine Sediment DlPCBs Extract

Nie Fanghong1, Cai Jizhen2, Wang Xiaoning2, Lin Hongying2, Gooneratne Ravi3, Hay Anthony4, Ma Yi2, Ju Xianghong2, Zheng Jinqing2, Chen Jinjun2,*

1. Food Sci-Tech College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 2. Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 3. Faculty of Agriculture & Life Sciences, Lincoln University, Christchurch 7647, New Zealand 4. College of Agriculture and Life Sciences, Cornell University, Ithaca 14853, USA

Received 9 July 2015 accepted 31 August 2015

To study the bio-toxicity of dioxin-like polychlorinated biphenyls (DlPCBs) in marine sediment, the sediments from Zhanjiang industrial and living area (TS and JSW) were collected and extracted focusing on DlPCBs, respectively. Then a range of zebrafish embryos were exposed to different concentrations of the sediment DlPCBs extracts to examine the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity and the expression of cyp1a mRNA. The results showed that the DlPCBs extract from TS and JSW sediments had similarity to cause marked induction of EROD in the zebrafish embryos.The EROD activities in zebrafish embryos induced by different concentrations of the DlPCBs extract were 1.1 to 1.8 times higher than that in the control embryos, respectively, and after the zebrafish embryos were exposed to different concentrations of the DlPCBs for 96 h, the juvenile cyp1a mRNA relative expressions were significantly enhanced by 3.36 to 19.45 times of that in the control group, respectively. It is indicated that certain concentrations of the DlPCBs extract increased EROD activity and cyp1a mRNA in zebrafish larvae, with a concentration-effect relationship.

dioxin-like polychlorinated biphenyls; zebrafish embryo; EROD; cyp1a mRNA; marine sediment

10.7524/AJE.1673-5897.20150709001

廣東省科技計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目(2010B050600004，2016A050502062)

聶芳紅(1969-)，女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槭称范纠韺W(xué)，E-mail：15913577717@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jjchen777@aliyun.com

2015-07-09 錄用日期：2015-08-31

1673-5897(2016)2-364-05

X171.5

A

簡(jiǎn)介：陳進(jìn)軍( 1967-)，男，動(dòng)物毒理學(xué)博士，三級(jí)教授，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物毒理學(xué)和環(huán)境健康，發(fā)表學(xué)術(shù)論文80 余篇。

聶芳紅, 蔡吉榛, 王小寧, 等. 近海沉積物DlPCBs對(duì)斑馬魚胚胎EROD和cyp1a mRNA的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(2): 364-368

Nie F H, Cai J Z, Wang X N, et al. EROD activity and cyp1a mRNA expression in zebrafish embryo exposed to marine sediment DlPCBs extract [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 364-368 (in Chinese)