鄰苯二甲酸二丁酯對海洋微藻生長的影響

黃博珠，何瑞，孫凱峰，段舜山，徐寧,*

1. 暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系 水生生物研究所，廣州510632 2. 珠江水利科學(xué)研究院，廣州510611 3. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣州510655

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鄰苯二甲酸二丁酯對海洋微藻生長的影響

黃博珠1，何瑞2，孫凱峰3，段舜山1，徐寧1,*

1. 暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系 水生生物研究所，廣州510632 2. 珠江水利科學(xué)研究院，廣州510611 3. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣州510655

近年來，內(nèi)陸和近海水體中的一種典型環(huán)境激素鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)含量顯著上升，但其對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響并不明確。本研究選取7種海洋微藻為實驗材料，包括1種甲藻(東海原甲藻Prorocentrum donghaiense)，2種定鞭藻(小普林藻Prymesium parvum和球形棕囊藻Phaeocystis globosa)，2種硅藻(中肋骨條藻Skeletonema costatum和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum)，以及1種隱藻(紅胞藻Rhodomonus salina)和1種綠藻(海洋小球藻Chlorella sp.)，設(shè)置5個DBP暴露濃度(5、10、20、50、100 μg·L-1)，研究其對海洋微藻生長的影響，并探索DBP暴露對微藻抗氧化系統(tǒng)和光合系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：在所有暴露組中，球形棕囊藻、小普林藻、東海原甲藻、紅胞藻、海洋小球藻生長速率顯著增加；5～20 μg·L-1的DBP暴露下中肋骨條藻不受影響，50、100 μg·L-1下受到抑制；所有DBP暴露組對三角褐指藻沒有顯著影響。在50 μg·L-1DBP暴露下，隨著時間的延長，球形棕囊藻的SOD、CAT、MDA均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，第7天藻的葉綠素a、葉綠素b，類胡蘿卜素含量較對照組分別增加了23%、10%、48%，球形棕囊藻光系統(tǒng)II(PSII)的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、PSII的潛在活性(Fv/F0)、光合性能指數(shù)PI分別增加了4.8%、16%、69%。研究發(fā)現(xiàn)DBP對海洋微藻的影響具有種間差異性，能夠顯著促進有害赤潮藻球形棕囊藻的生長，近岸水體DBP含量的增加可能改變浮游植物群落組成，進而增加有害藻華暴發(fā)的風(fēng)險。

鄰苯二甲酸二丁酯；海洋微藻；生長速率；超氧化物歧化酶(SOD)；過氧化氫酶(CAT)；丙二醛(MDA)；光合色素

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是塑料工業(yè)最重要的增塑劑之一。DBP通過氫鍵或范德華力連接到塑料的高分子碳鏈上，因此極易從塑料釋放到環(huán)境中，對水體、土壤和生物等造成影響[1]。DBP是公認(rèn)的一種能夠危及人體和生物環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的環(huán)境激素[2-4]，被列入我國環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單[5]，因此，其對環(huán)境的影響受到政府和學(xué)術(shù)界的關(guān)注。

隨著增塑劑使用量的增多，內(nèi)陸和近岸水體中的DBP也呈增加趨勢。有報道指出，福建省以九江為水源的2個自來水廠進水中均檢測出DBP，最高含量達(dá)到17.238 μg·L-1[6]，合肥市2個重點引用水的水源董鋪水庫和巢湖所有采樣點均檢出DBP，最高含量為7.25 μg·L-1[7]，北京東沙河檢測出70 μg·L-1以上的DBP含量[8]，福建泉州灣海水中DBP濃度達(dá)到82 μg·L-1[9]。近幾十年，珠江三角洲地區(qū)工業(yè)迅速發(fā)展，使得珠江河口的水體環(huán)境形勢愈加嚴(yán)重，珠江流域同沙水庫DBP含量大于8 μg·L-1[10]，珠江河口DBP濃度為0.042～14.8 μg·L-1，已屬于中等污染水平[11]。DBP在水體中易被沉積物和微粒吸附，珠江口沉積物中檢測出4.66 μg·g-1的DBP含量，但迄今為止有關(guān)DBP對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響并不清楚。

DBP很容易在水生生物中富集，研究顯示，水蚤的富集系數(shù)為403，在微藻中更大[5,12]。海洋微藻是海洋食物鏈的基礎(chǔ)，是初級生產(chǎn)力的重要組成，海洋微藻的群落組成和結(jié)構(gòu)對海洋初級生產(chǎn)力具有重要影響，DBP對海洋微藻種群的影響也引起越來越多的關(guān)注。目前，DBP對藻類的生態(tài)毒性亦有報道，胡芹芹[13]發(fā)現(xiàn)DBP(5～100 mg·L-1)暴露對斜生柵藻存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，DBP的暴露能降低斜生柵藻的種群生長力，對該藻有急性毒性，其96 h的半致死濃度(EC50)為2.21 mg·L-1[14-15]。高濃度DBP對三角褐指藻具有明顯的抑制作用，2.5～7.5 mg·L-1暴露下均抑制三角褐指藻生長，葉綠素a、c及類胡蘿卜素質(zhì)量濃度隨著DBP暴露濃度增大而逐漸降低[16]。另外有研究發(fā)現(xiàn)普通小球藻對DBP有明顯的富集作用，因此DBP也存在隨著食物鏈傳遞有生物累積和生物放大效應(yīng)，然而銅綠微囊藻能顯著降解DBP，降解速率常數(shù)為5.9×10-3·h-1[17-19]。

綜合現(xiàn)有研究，DBP對藻類的影響主要集中于微藻對DBP的富集和降解，多使用淡水微藻類為實驗材料，且關(guān)注DBP高濃度暴露下的毒性效應(yīng)。海洋環(huán)境DBP污染與浮游植物群落變化間的相關(guān)關(guān)系鮮有報道。本文選取珠江口海域典型海洋微藻球形棕囊藻、小普林藻、中肋骨條藻、海洋小球藻等，研究和模擬近岸水體的DBP濃度對典型海洋微藻的影響，探索DBP污染加重對典型海洋微藻干擾效應(yīng)的規(guī)律。重點探討典型藻華原因種類球形棕囊藻[20]在DBP暴露下的生理生化相應(yīng)特征，進而分析DBP污染與球形棕囊藻藻華在南海區(qū)域頻頻發(fā)生之間的相關(guān)關(guān)系[21]，為進一步認(rèn)識典型環(huán)境激素DBP對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供參考資料。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1實驗材料

本實驗用藻以分離自廣東省惠州市大亞灣海域的定鞭藻球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)、小普林藻(Prymesium parvum)，硅藻中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，綠藻海洋小球藻(Chlorella sp.)為材料，另選取實驗室長期保種的甲藻東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)，隱藻紅胞藻(Rhodomonus salina)作對比研究。本研究均采用f/2液體培養(yǎng)基，溫度(23±1) ℃，鹽度為30，光照強度100 (μmol·m-2·s-1)，光暗周期為12L: 12D。培養(yǎng)期間每天定時搖動3次，并隨機變換位置。

實驗用鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)購自上海阿拉丁試劑公司，純度>99.5%(GC)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DBP對海洋微藻生長的影響

DBP濃度設(shè)置參考近岸水體濃度范圍，以低于20 μg·L-1為自然水體狀況，并模擬污染加劇情況下的濃度50、100 μg·L-1，以不加入DBP組為對照。由于實驗用藻的大小及密度有所差異，經(jīng)過預(yù)實驗后確定每種微藻的接種密度(見表1)。通過預(yù)實驗和方差分析得到丙酮的無可觀察效應(yīng)劑量(no observed effect level, NOEL)為0.5%，因此本研究中采用體積濃度為0.5%丙酮為DBP助溶劑。

實驗采用50 mL玻璃試管(藻液體積為35 mL)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，每組設(shè)置3個平行。利用TD-700葉綠素?zé)晒鈨x每天測定各實驗組葉綠素?zé)晒庵担⒂嬎阒笖?shù)生長期的生長速率，公式如下：

生長速率=ln(Nt/N0)/T

公式中：Nt為第t天藻的葉綠素?zé)晒庵担琋0為初始的葉綠素?zé)晒庵?，T為培養(yǎng)時間

1.2.2 DBP對球形棕囊藻抗氧化酶和MDA的影響

選取指數(shù)生長期的球形棕囊藻為受試藻，接種至1 L三角瓶中，每瓶600 mL藻液，接種密度為2×105cells·mL-1，DBP暴露濃度為50 μg·L-1，以不加入DBP作為對照組，每組設(shè)置3個平行。在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、168 h時分別取60 mL藻液分裝至6個10 mL離心管，4℃、7 000 r·min-1離心15 min，去上清收集藻細(xì)胞，每個離心管加入2 mL預(yù)冷處理后的粗酶提取緩沖液，重新懸浮后冰浴下超聲破碎10 min，鏡檢無完整細(xì)胞，再次于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，上清即為待測酶粗提取液。實驗采用蛋白測定試劑盒(A-045)、總過氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(A001)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(A007)、丙二醛(MDA)試劑盒(A003)測定藻的SOD、CAT、MDA含量，試劑盒均購自南京建成公司，實驗過程嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

表1 7種海洋微藻的初始密度

1.2.3 DBP對球形棕囊藻光合色素及光合系統(tǒng)II(PSII)的影響

實驗采用250 mL的三角瓶，加入200 mL藻液，接種密度為2×105cells·mL-1，DBP終濃度為50 μg·L-1，未加DBP為對照，每組設(shè)置3個平行。在第7天時取5 mL藻液，室溫下以5 000 r·min-1離心15 min，棄上清，加入90%丙酮5 mL，震蕩混勻后于黑暗處4 ℃靜置抽提24 h，以5 000 r·min-1離心15 min，取上清液于470 nm、644.8 nm、661.6 nm波長下測定吸光值，以空白抽提液為對照，色素含量(mg·L-1)計算公式如下：

葉綠素a =11.24A661.6-204A644.8

葉綠素b =20.13A644.8-4.19A661.8

類胡蘿卜素=(1000A470-1.90葉綠素a-63.14葉綠素b)/214

取一定量體積的藻液，測量前將樣品先暗適應(yīng)30 min，然后暴露在飽和脈沖光(3 000 μmol·m-2·s-1)下2 s，用Handy-PEA連續(xù)激發(fā)式熒光儀測量O-J-I-P熒光誘導(dǎo)曲線及分析得到光合參數(shù)最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、PSII的潛在活性(Fv/F0)、光合性能指數(shù)PI[22]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0和Origin8.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 DBP對海洋微藻生長的影響

不同質(zhì)量濃度DBP作用下7種海洋微藻的生長速率如圖1所示。實驗結(jié)果顯示，在5～20 μg·L-1DBP暴露下，定鞭藻球形棕囊藻(Fig. 1A)、小普林藻(Fig. 1B)，甲藻東海原甲藻(Fig. 1C)，隱藻紅胞藻(Fig. 1D)，綠藻海洋小球藻(Fig. 1E)生長速率顯著增加，增長率分別為64%、71%、67%、214%、5.0%。中肋骨條藻和非赤潮藻三角褐指藻生長與對照沒有顯著性差別。

當(dāng)DBP污染加重，50 μg·L-1DBP暴露下球形棕囊藻生長率仍有65%的增加，東海原甲藻生長率增加了133%，紅胞藻生長率增加了243%，海洋小球藻生長率增加了4.9%，而小普林藻生長率增加相對減少，僅增加25%。中肋骨條藻則表現(xiàn)出生長抑制，生長率較對照組下降了2.1%，非赤潮藻三角褐指藻沒有顯著影響。

當(dāng)DBP污染繼續(xù)加重，100 μg·L-1DBP暴露下球形棕囊藻生長率增長了56%，東海原甲藻生長率增加了99%，紅胞藻生長率增加了262%，海洋小球藻生長率增加了4.9%，小普林藻生長率增加了29%，中肋骨條藻持續(xù)抑制，生長率下降了59%，非赤潮藻三角褐指藻仍無顯著影響。

圖1 不同DBP濃度對7種海洋微藻生長速率的影響(**：與對照組比較，P<0.01)Fig. 1 Effects of different concentrations of DBP on the growth rate of seven marine algae (**: compared with the control group, P <0.01)

圖2 DBP(50 μg·L-1)暴露下，球形棕囊藻SOD、CAT、MDA含量的時間變化(*：與對照組比較，P<0.05; **：與對照組比較，P<0.01)Fig. 2 Content of SOD, CAT, MDA of Phaeocystis globosa exposed to DBP (50 μg·L-1) at different culture time(*: compared with the control group, P <0.05; **: compared with the control group, P <0.01)

2.2 DBP對球形棕囊藻抗氧化酶和MDA的影響

在50 μg·L-1的DBP暴露下，球形棕囊藻的SOD、CAT、MDA含量如圖2所示。球形棕囊藻SOD在12 h較對照上升了78%，48 h后下降，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。球形棕囊藻的CAT活性在12 h迅速上升，達(dá)到7.7 U·mg-1prot，較對照上升了107%，隨后逐漸下降，呈現(xiàn)先升高后下降趨勢；球形棕囊藻的MDA在48 h MDA含量較對照增加了19%，隨后下降，呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。

2.3 DBP對球形棕囊藻光合色素及光合系統(tǒng)II的影響

在50 μg·L-1的DBP暴露下，球形棕囊藻第7天光合色素含量如圖3所示，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素較對照組均有所升高，分別增加了23%、10%、48%。球形棕囊藻快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線如圖4所示，第7天熒光值高于對照組。通過對OJIP快速熒光誘導(dǎo)曲線分析得到球形棕囊藻第7天光合參數(shù)如表2所示，最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)較對照增加了4.8%，PSII的潛在活性(Fv/F0)較對照增加了16%，光合性能指數(shù)PI較對照增加了69%。

圖3 DBP(50 μg·L-1)暴露7天后，球形棕囊藻光合色素含量的變化Fig. 3 Effects of DBP (50 μg·L-1) on the content of pigments of Phaeocystis globosa after cultured for 7 days

表2 DBP(50 μg·L-1)暴露7天后，球形棕囊藻的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)參數(shù)

圖4 DBP(50 μg·L-1)暴露7天后，球形棕囊藻的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線Fig. 4 Effects of DBP (50 μg·L-1) on chlorophyll a fluorescence transients of Phaeocystis globosa

3 討論(Discussion)

3.1 DBP對海洋微藻生長的影響因種而異

DBP對不同受試藻的影響具有種間差異性，在低濃度(5～20 μg·L-1)下，受試微藻的生長率增加范圍在5%～214%之間，DBP能夠顯著增加定鞭藻球形棕囊藻和小普林藻、甲藻東海原甲藻、隱藻紅胞藻、綠藻海洋小球藻的生長率，然而對2種硅藻中肋骨條藻和三角褐指藻生長作用不顯著。近年來隨著增塑劑使用量不斷增加，水體中DBP含量也隨之升高，本研究結(jié)果顯示，DBP濃度增加可能在一定程度上刺激有害赤潮藻定鞭藻類如球形棕囊藻和小普林藻的生長。其他研究顯示，低濃度的DBP對藻類有一定的促進作用。如汪星[23]的研究發(fā)現(xiàn)1 mg·mL-1和2 mg·mL-1的DBP處理魚腥藻時，暴露組藻密度高于對照組10%和20%，Acey等[24]也發(fā)現(xiàn)，10、100、500 nmol·L-1、1、10 μmol·L-1五個濃度的DBP不同程度的刺激了聚球藻聚集，使其生物量增加，10-6～10-7mol·L-1之間的DBP也可以促進小球藻的光合作用[25]。

若水環(huán)境中DBP含量持續(xù)上升，在≥50 μg·L-1DBP脅迫下，小普林藻、東海原甲藻生長率有所下降，硅藻中肋骨條藻生長受到抑制。隨著DBP濃度增加，其會對藻類產(chǎn)生毒性作用[14-16]。野外數(shù)據(jù)顯示，暴發(fā)赤潮時水體中DBP濃度顯著增加，且其增加的倍數(shù)與發(fā)生赤潮的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[26]，有毒赤潮藻球形棕囊藻在高濃度DBP(100 μg·L-1)下生長率顯著增大，水體DBP含量的增加通過促進球形棕囊藻等有害赤潮藻的生長而提高其競爭優(yōu)勢，可能提高形成有害藻華的生態(tài)風(fēng)險。海洋微藻組成了海洋食物鏈重要的一部分，藻對DBP不同的響應(yīng)，生長率的不同，對浮游植物群落的改變、分布可能會有很大影響[24]，在適宜環(huán)境條件下引發(fā)藻華。

3.2 DBP對海洋微藻生理生化的影響

光合色素是客觀反映植物利用光照進行光合作用的重要指標(biāo)，研究顯示，在環(huán)境脅迫條件下，微藻光合色素含量下降，Alberte等[31]認(rèn)為主要原因是葉綠體片層中捕光Chla/b-Pro復(fù)合體合成受到抑制，但也有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的DBP能夠提高斜生柵藻光合色素的含量[32]。本研究結(jié)果顯示，50 μg·L-1DBP能夠刺激球形棕囊藻光合色素含量提高，球形棕囊藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率、PSII潛在活性、光合性能指數(shù)均有所增加，說明DBP促進球形棕囊藻進行光合作用，這與球形棕囊藻生長率增加的結(jié)果相符，結(jié)合前面抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)，球形棕囊藻能夠及時清除DBP對其危害，DBP甚至能夠刺激球形棕囊藻的生長，表明在DBP環(huán)境污染日益嚴(yán)重的形勢下，球形棕囊藻具有生長優(yōu)勢并可能在適宜的條件下形成有害藻華。

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Effects of Dibutyl Phthalate(DBP) on the Growth of Marine Microalgae

Huang Bozhu1, He Rui2, Sun Kaifeng3, Duan Shunshan1, Xu Ning1,*

1. Department of Ecology, Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China 2. Pearl River Hydraulic Research Institute, Guangzhou 510611, China 3. Research Center of Offshore Marine Environment, South China Institute of Environmental Sciences, MEP, Guangzhou 510655, China

Received 30 November 2015 accepted 26 January 2016

In order to study the effects of DBP on the growth, antioxidant system and photosynthesis of marine algae, seven marine algae, including Prorocentrum donghaiense, Prymesium parvum, Phaeocystis globosa, Skeletonema costatum, Phaeodactylum tricornutum, Rhodomonus salina, and Chlorella sp. were exposed to DBP at concentration gradients of 5, 10, 20, 50, 100 μg·L-1and a control. Chlorophyll fluorescence were measured each day. T-SOD, CAT, MDA pigment contents and chlorophyll fluorescence of P. globosa were determined during the experiment at concentration of 50 μg·L-1DBP. Results showed that, growth of P. globosa, P. parvum, P.donghaiense, Chlorella sp. and R. salinawere significantly higher than the controls in all treatments (P<0.01). DBP had inhibition effect on S. costatum at 50 and 100 μg·L-1treatments (P<0.01). There was no significant difference in all P. tricornutum treatments compared with the control. SOD, CAT activities and MDA values of P. globosa cultures increased at first and decreased subsequently during the experiments. At day 7, the contents of chlorophyll a, b and carotenoids were increased by 23%, 10%, and 48% respectively, and the maximal photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm), the potential activity of PSII (Fv/F0) and performance index (PI) were also increased by 4.8%, 16%, and 69% respectively. DBP displayed species-specific influences on marine microalgae, and significantly promoted the growth of P. globosa. Increasing concentration of DBP at coastal water may change the community composition of phytoplankton and increase the risk of harmful algal blooms.

dibutyl phthalate; marine algae; growth; SOD; CAT; MDA; photosynthrtic pigment

10.7524/AJE.1673-5897.20151130005

國家自然科學(xué)基金項目(41576159,21307140,U1133003)；

黃博珠(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為藻類生理生態(tài)學(xué)，E-mail: bozhuhuang258@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: txuning@163.com

2015-11-30 錄用日期：2016-01-26

1673-5897(2016)2-292-08

X171.5

A

簡介：徐寧(1971-)，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事藻類生理生態(tài)方面的研究，發(fā)表各類論文40篇

黃博珠, 何瑞, 孫凱峰, 等. 鄰苯二甲酸二丁酯對海洋微藻生長的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(2): 292-299

Huang B Z, He R, Sun K F, et al. Effects of dibutyl phthalate (DBP) on the growth of marine microalgae [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 292-299 (in Chinese)