液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度評(píng)定

牛曰華

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 福州 350003)

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液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度評(píng)定

牛曰華

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 福州 350003)

當(dāng)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量接近最高殘留限量時(shí)，為準(zhǔn)確判斷產(chǎn)品是否符合要求，開展測(cè)量不確定度評(píng)定便十分重要。基于此，本文建立了液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度分析和評(píng)定方法。依據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS—GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》規(guī)定的基本方法和程序，建立恩諾沙星殘留量的測(cè)量不確定度數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的來源，對(duì)主要不確定度分量進(jìn)行計(jì)算和合成，最終得到擴(kuò)展不確定度。當(dāng)樣品中恩諾沙星測(cè)量值為97.1 μg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為5.6 μg/kg。分析結(jié)果表明，測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來源于樣品前處理和標(biāo)準(zhǔn)溶液。

液相色譜法；水產(chǎn)品；恩諾沙星；不確定度評(píng)定

測(cè)量不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)[1]。一個(gè)完整的檢測(cè)結(jié)果通常包括測(cè)量估計(jì)值和其不確定度等有關(guān)信息[2]?！稒z驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評(píng)審準(zhǔn)則》對(duì)測(cè)量不確定度的評(píng)定提出了明確要求，主要包括：檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)制定測(cè)量不確定度的評(píng)定程序、建立覆蓋主要檢測(cè)類型的測(cè)量不確定度評(píng)定案例以及在必要時(shí)給出測(cè)量不確定度。測(cè)量不確定度在實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對(duì)和檢測(cè)結(jié)果的國際互認(rèn)方面具有重要意義[3]。此外，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果處于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求的臨界值，產(chǎn)品有可能被判定為不合格時(shí)，這種情況下應(yīng)給出測(cè)量不確定度[4]?；诖?，測(cè)量不確定度的評(píng)定在檢測(cè)領(lǐng)域越來越受到重視。

恩諾沙星(Enrofloxacin，EF)是人工合成的第三代氟喹諾酮類(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)抗菌藥物，對(duì)絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌以及部分革蘭氏陽性菌有效[5]，對(duì)殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、殺鮭氣弧菌(Vibriosalmonicida)、鰻弧菌(V.anguillarum)和紅色耶爾森菌(Yersiniarucheri)等水產(chǎn)動(dòng)物致病菌高度敏感[6-7]，因此廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但不合理的用藥也會(huì)對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境帶來危害[8]。因此，恩諾沙星是中國申報(bào)無公害水產(chǎn)品必須要檢測(cè)的項(xiàng)目，也是水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的重要對(duì)象。中國農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中恩諾沙星最高殘留限量為100 μg/kg。農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測(cè)定 液相色譜法》[9]是監(jiān)測(cè)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量常用的檢測(cè)方法。檢測(cè)方法的不確定度是判定測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要依據(jù)。當(dāng)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量檢測(cè)值接近最高殘留限量時(shí)，為準(zhǔn)確判斷產(chǎn)品是否符合要求，對(duì)方法開展測(cè)量不確定度評(píng)定十分必要。因此，本研究根據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[10]以及CNAS—GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[11]規(guī)定的基本方法和程序，對(duì)農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—2—2006方法的不確定度進(jìn)行分析和評(píng)定，找出影響檢測(cè)結(jié)果的主要不確定度分量。在實(shí)際操作中可用于指導(dǎo)檢測(cè)人員對(duì)主要的不確定度分量進(jìn)行重點(diǎn)控制，以提高檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量；為從事水產(chǎn)品藥殘檢測(cè)和研究的相關(guān)人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters H-CLASS超高效液相色譜儀，配FLR檢測(cè)器；ALC-210.3電子天平和BP211D電子天平(德國Sartorius公司)；3-30K高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；LR4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、正已烷為色譜純，購于Merck公司；三乙胺、無水硫酸鈉為分析純，購于國藥集團(tuán)有限公司；磷酸，優(yōu)級(jí)純，購于美國Tedia公司。

1.2 樣品前處理方法

參照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測(cè)定 液相色譜法》進(jìn)行樣品前處理。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用流動(dòng)相溶解后，定容至100 mL。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：準(zhǔn)確移取5.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相定容至100 mL，得到5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別移取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液至10、25、50、100、200 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，得到500、200、100、50、25 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 色譜條件

色譜柱為BEH C18柱，規(guī)格100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm；流動(dòng)相A相為0.025 mol/L磷酸(用三乙胺調(diào)pH至3.0)，B相為乙腈，A∶B=87∶13(V/V)，流速0.30 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2.00 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。

2 測(cè)量不確定度的評(píng)定

2.1 數(shù)學(xué)模型

水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的數(shù)學(xué)模型如式(1)所示。

式(1)

式(1)中，X為樣品中恩諾沙星的含量(μg/kg)；m為樣品的稱取量(g)；v為樣品的定容體積(mL)；Cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/L)；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；A為樣液中恩諾沙星的峰面積；f為回收率校正因子。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型和檢測(cè)過程分析，水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度來源主要包括：樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品定容、樣品前處理以及測(cè)量?jī)x器。其中，樣品稱量的不確定度主要來自于天平；標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度由配制過程中產(chǎn)生，主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量以及配制過程中使用玻璃量器等引入；樣品定容的不確定度主要來自于移液器；樣品前處理的不確定度主要來自樣品的提取和凈化等操作步驟。

2.3 不確定度分量的計(jì)算

2.3.1 樣品稱量的不確定度

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程產(chǎn)生的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量以及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用的移液管和容量瓶等引入。

1) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的不確定度

2) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量的不確定度

3) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中玻璃量器引入的不確定度

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用了經(jīng)檢定為A級(jí)的容量瓶和單標(biāo)線吸量管。使用容量瓶和吸量管引入的不確定度主要包括量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度ur(c3，v)和配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)的溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度(20℃)不同產(chǎn)生的不確定度ur(c3，t)。

式(2)

式(2)中，V1為量器的標(biāo)稱容量，V2為量器容量最大允許誤差。

式(3)

由公式(2)和公式(3)，得到ur(c3，v)和ur(c3，t)，進(jìn)而得到各量器的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果如表1所示。

表1 量器的不確定度

續(xù)表1

根據(jù)量器的使用次數(shù)，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用量器產(chǎn)生的不確定度：

因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

將配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，得到恩諾沙星各濃度的色譜峰面積，如表2所示。

表2 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰面積

用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到恩諾沙星濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=6 380x-5 164(其中y表示峰面積，x表示恩諾沙星濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率a=6 380，標(biāo)準(zhǔn)曲線截距b=-5 164。標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差S用式(4)表示。

式(4)

式(4)中，a、b、n、xi、yi分別代表標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、標(biāo)準(zhǔn)曲線截距、標(biāo)準(zhǔn)溶液總的測(cè)量次數(shù)(n=5)、第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/L)和第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積(μV·s)。

由式(4)得到標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差S=7 230。

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和Scc用式(5)表示。

式(5)

由式(5)得到標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和Scc=150 000。

對(duì)水產(chǎn)品樣品中的恩諾沙星進(jìn)行2次平行檢測(cè)，得到的峰面積分別為2 910 879 μV·s和3 275 113 μV·s，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣液濃度分別為457.06 μg/L和514.15 μg/L，平均值為485.60 μg/L。

由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(q)用式(6)表示。

式(6)

式(6)中，X為樣液中恩諾沙星的濃度，X=485.60 μg/L；p為樣品測(cè)量次數(shù)，p=2。

2.3.4 樣品定容的不確定度

2.3.5 樣品前處理引入的不確定度

樣品前處理主要包括酸化乙腈提取、正己烷除脂凈化以及濃縮等操作步驟，其產(chǎn)生的不確定度通常用加標(biāo)回收率進(jìn)行評(píng)定。用陰性草魚樣品做6份平行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度為國家規(guī)定的最高殘留限量濃度100 μg/kg。測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果

設(shè)顯著水平α=0.05，tα(0.05，5)=2.571。t>tα(0.05，5)=2.571，說明平均回收率與100%差異顯著，因此必須考慮方法回收率引入的不確定度。

2.3.6 檢測(cè)儀器引入的不確定度

2.4 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成和擴(kuò)展

2.4.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)得到的各不確定度分量，得到總的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由樣液中恩諾沙星的濃度485.60 μg/L，得到樣品中恩諾沙星測(cè)量值為97.1 μg/kg。因此樣品測(cè)定中恩諾沙星合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(X)=97.1×0.028 78 μg/kg=2.79 μg/kg。

2.4.2 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k×uc(X)=2×2.79 μg/kg=5.6 μg/kg。

2.5 不確定度報(bào)告

采用農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測(cè)定 液相色譜法》，測(cè)得水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量為X=(97.1±5.6)μg/kg，k=2。

由此結(jié)果可以看出，樣品中恩諾沙星殘留量檢測(cè)值97.1 μg/kg小于國家規(guī)定的最高殘留限量100 μg/kg，可以判定為合格產(chǎn)品。但同時(shí)由于該檢測(cè)值已經(jīng)較為接近最高殘留限量，并且該檢測(cè)值的擴(kuò)展不確定度為5.6 μg/kg，樣品仍可能存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步加以關(guān)注。

2.6 不確定度分量分布

根據(jù)上述計(jì)算，得到各主要不確定度分量，結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)：樣品前處理>標(biāo)準(zhǔn)溶液>樣品定容>檢測(cè)儀器>標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合>樣品稱量。在這些不確定度分量中，樣品前處理對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)在50%以上，標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)約占22%，樣品稱量對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)最小。

表4 不確定度分量分布表

3 結(jié)論

當(dāng)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量接近最高殘留限量時(shí)，為準(zhǔn)確判斷產(chǎn)品是否符合要求，開展不確定度評(píng)定便十分重要。本研究表明，采用農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測(cè)定 液相色譜法》進(jìn)行水產(chǎn)品中恩諾沙星測(cè)定，當(dāng)樣品中恩諾沙星檢測(cè)值為97.1 μg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為5.6 μg/kg。樣品前處理是恩諾沙星測(cè)量不確定度的最主要來源，占各不確定度分量總和的50%以上；其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液，約占各不確定度分量總和的22%；樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品定容和檢測(cè)儀器對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)較小。因此，在檢測(cè)過程中，應(yīng)保證實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性，增加平行樣的檢測(cè)，加強(qiáng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)溶液的管理，以及對(duì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液所用的玻璃量器定期進(jìn)行檢定校準(zhǔn)。

[1]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF 1001—2011通用計(jì)量術(shù)語及定義[S].北京：中國質(zhì)檢出版社，2012.

[2]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計(jì)量司.測(cè)量不確定度評(píng)定與表示指南[M].北京：中國計(jì)量出版社，2005.

[3]劉安平，宋桂蘭.GB/T 27025—2008檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求：理解與實(shí)施[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[4]王學(xué)杰.示值誤差和測(cè)量不確定度在實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可中的應(yīng)用[J].上海計(jì)量測(cè)試，2013，(1)：54-56.

[5]應(yīng)翔宇，楊永勝.獸用新型抗菌藥物—恩諾沙星[J].中國獸藥雜志，1995，29(3)：53-56.

[6]Martinsen B，Oppegaard H，Wichstrom R，et al.Temperature-dependent in vitro antimicrobial activity of four 4-quinolones and oxytetracycline against bacteria pathogenic to fish[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1992，36(8)：1738-1743.

[7]Bowser P R，Babish J G.Enrofloxacin in salmonids[J].Vet Hum Toxicol，1991，33(Suppl 1)：46-54.

[8]宋紅波，吳光紅，沈美芳，等.恩諾沙星在水產(chǎn)品中殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2008，35(5)：39-42.

[9]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—2—2006 水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測(cè)定 液相色譜法[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[10]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF 1059.1—2012 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京：中國質(zhì)檢出版社，2013.

[11]中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì).CNAS—GL06：2006 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S].北京：中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)，2006.

[12]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 196—2006 常用玻璃量器[S].北京：中國計(jì)量出版社，2007.

[13]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG 646—2006 移液器[S].北京：中國計(jì)量出版社，2007.

Uncertainty evaluation for determination of enrofloxacin residue in aquatic products by liquid chromatography

NIU Yuehua

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center，F(xiàn)uzhou 350003，China)

When enrofloxacin residue is close to the maximum residue limit in aquatic products，it is very important to carry out evaluation of measurement uncertainty to accurately determine whether the products meet the quality standards.So a method of uncertainty evaluation for the determination of enrofloxacin residue in aquatic products by liquid chromatography was established.According to “Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”(JJF 1059.1—2012)and “Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis”(CNAS—GL06：2006)，a mathematical model was constructed and the uncertainty sources were analyzed，and then the main components of uncertainty were quantified and combined.Finally the expanded uncertainty was achieved.When the measured value of enrofloxacin residue in aquatic products was 97.1 μg/kg，its expanded uncertainty was 5.6 μg/kg.The results showed that the major factors of uncertainty were sample pre-treatment and standard solution.The uncertainties of sample pre-treatment and standard solution accounted for more than 50% and 22% of the total uncertainties，respectively.

liquid chromatography；aquatic products；enrofloxacin；uncertainty evaluation

2016-07-12 作者簡(jiǎn)介：牛曰華(1981-)，男，工程師，農(nóng)業(yè)推廣碩士，研究方向：主要從事水產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè).Tel：0591-87836015.E-mail：yhniu99@126.com

S94

A

1006-5601(2016)05-0402-07

牛曰華.液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度評(píng)定[J].漁業(yè)研究，2016，38(5)：402-408.