豬細(xì)小病毒病血清抗體VP2-ELISA檢測方法的建立

周　潔，南文龍，何遠(yuǎn)清，殷黎靜，任　倩，秦立得，陳義平?

（1.江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇　鎮(zhèn)江　212013；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑室，山東　青島　266032）

豬細(xì)小病毒病血清抗體VP2-ELISA檢測方法的建立

周潔1,2，南文龍2，何遠(yuǎn)清1，殷黎靜1，任倩1，秦立得2，陳義平2?

（1.江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑室，山東青島266032）

利用純化的豬細(xì)小病毒VP2蛋白為抗原，建立檢測豬細(xì)小病毒血清抗體的間接VP2-ELISA。最佳反應(yīng)條件為：抗原包被濃度300 ng/孔，4℃過夜，待檢測血清1∶50稀釋。與豬細(xì)小病毒病陽性血清呈陽性反應(yīng)，與豬瘟、豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬日本腦炎和豬圓環(huán)病毒病等5種疾病的陽性血清均無交叉反應(yīng)。批間、批內(nèi)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%。用該方法與Ceditest PPV豬細(xì)小病毒抗體檢測試劑盒對(duì)102份血清進(jìn)行平行檢測和比較，間接VP2-ELISA的敏感性為93.8%，特異性為81.1%，符合率為89.2%。結(jié)果表明，豬細(xì)小病毒血清抗體間接VP2-ELISA檢測方法具有較高的敏感性和特異性，且重復(fù)性好，可用于豬細(xì)小病毒感染的血清抗體檢測。

豬細(xì)小病毒；抗體；VP2-ELISA

豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）可引起豬的繁殖障礙，如發(fā)情不正常，久配不孕，或產(chǎn)死胎、畸形胎和木乃伊胎，還能引起仔豬的皮炎、腹瀉及關(guān)節(jié)炎[1]，是造成種豬繁殖障礙疾病的病原之一。豬的繁殖障礙是目前困擾集約化豬場生產(chǎn)的重要問題，為了加強(qiáng)對(duì)該病的疫情監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查，有必要建立特異性強(qiáng)、敏感性高的血清學(xué)檢測方法。PPV的結(jié)構(gòu)蛋白（St ructural Protein 2，VP2）具有良好的免疫原性，可作為理想的血清學(xué)檢測用抗原[2-3]。

筆者以pET32（a）作為表達(dá)載體，所選取的片段，盡可能多地涵蓋了VP2的抗原優(yōu)勢區(qū)域，目的蛋白以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體蛋白的65.2%，與PPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。本研究運(yùn)用表達(dá)的蛋白作為抗原，通過一系列的條件優(yōu)化，建立了針對(duì)VP2抗體的間接ELISA檢測方法，可用于豬血清中PPV抗體的檢測。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1抗原的制備表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-VP2由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑室構(gòu)建[4]。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，按照HisBind?Puri f ication Kit說明書純化蛋白，經(jīng)NanoDrop?ND-1000分光光度計(jì)測定蛋白濃度。

1.1.2血清豬細(xì)小病毒病（PPV）陽性血清、偽狂犬病（PRV）陽性血清、豬圓環(huán)病毒（PCV）陽性血清、豬瘟（HCV）陽性血清、豬日本腦炎（JEV）陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）陽性血清、SPF豬血清（以上血清均由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑室提供）。臨床血清樣品采自國內(nèi)不同地區(qū)豬場的PPV滅活苗免疫豬。

1.1.3主要試劑Ceditest?PPV ELISA Kit為荷蘭賽迪診斷公司產(chǎn)品；兔抗豬IgG-HRP和TMB均為Sigma公司（美國）產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1蛋白含量的測定選擇純化好的抗原，用NanoDrop-1000紫外分光光度計(jì)測定蛋白含量，具體方法為：先用2.5μL的純水對(duì)儀器進(jìn)行初始化，再用2.5μL的蛋白洗脫液即含6 M尿素的1×Elution Buf fer做空白調(diào)零，最后取2.5μL純化好的蛋白進(jìn)行測定，測得值即為蛋白濃度。

1.2.2重組抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定采用方陣試驗(yàn)進(jìn)行滴定。取96孔酶標(biāo)板，將純化的VP2重組蛋白用pH 9.6碳酸鹽緩沖液自上而下依次作1:30、1:62.5、1:125、1:250、1:500、1: 1000、1:2000稀釋，100μL/孔；陰陽性血清按1: 12.5、1:25、1:50、1:100、1:200稀釋，加兔抗豬酶標(biāo)二抗，2%牛血清白蛋白溶液（BSA）為封閉液，進(jìn)行重組抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的優(yōu)化。加入100μL/孔TMB，37℃顯色10 min，最后加入100μL/孔終止液終止反應(yīng)，測OD450值，根據(jù)P/N值確定抗原與血清的最佳稀釋度。

1.2.3反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化采用已優(yōu)化的抗原包被濃度和血清稀釋度，分別改變包被時(shí)間、封閉時(shí)間、待檢血清作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋度和作用時(shí)間以及底物作用時(shí)間，選擇最佳反應(yīng)條件。

1.2.4特異性試驗(yàn)利用已建立的間接ELISA檢測方法對(duì)PCV、PRV、HCV、JEV和PRRSV陽性血清進(jìn)行檢測。

1.2.5重復(fù)性試驗(yàn)

1.2.5.1批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)選取不同OD450值的8份血清樣品，用建立的VP2-ELISA進(jìn)行8次批內(nèi)重復(fù)檢測。

1.2.5.2批間重復(fù)試驗(yàn)取5份陽性血清樣品，3份陰性血清樣品，分別用3個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測。

1.2.6與國外ELISA檢測試劑盒的比較將臨床送檢的102份豬血清樣品分別用建立的VP2-ELISA和國外試劑盒進(jìn)行平行檢測，比較建立的檢測方法與國外試劑盒檢測結(jié)果的敏感性、特異性以及符合率。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白濃度測定結(jié)果經(jīng)NanoDrop-1000紫外分光光度計(jì)測定，測得VP2蛋白濃度為1.53 mg/mL。

2.2重組抗原的誘導(dǎo)表達(dá)及純化如圖1。將重組菌進(jìn)行超聲裂解后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示，在約39.1 KDa處有一條很濃的特異性蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致，而未經(jīng)誘導(dǎo)的pET-VP2轉(zhuǎn)化菌則無此條帶，原始pET-32（a）轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后出現(xiàn)約20.4 KDa的6×His蛋白條帶。重組抗原以包涵體形式表達(dá)，上清中的蛋白量較少。經(jīng)His親和層析柱純化后，獲得了純化的重組抗原。

圖1　表達(dá)純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.1　SDS-PAGE analysis o f the fusion p rotein

表1　VP2抗原和血清最佳稀釋度的方陣試驗(yàn)結(jié)果Tab le1　Result of the checkerboard titration o f VP2

1:2501:500 1:1000 1:2000 positive negative P/N positive negative P/N positive negative P/N positive negative P/N 1.496 0.256 5.844 0.873 0.174 5.017 0.648 0.316 2.051 0.471 0.273 1.725 1.991 0.167 11.922 0.794 0.160 4.963 0.485 0.118 4.110 0.483 0.140 3.450 0.782 0.110 7.109 0.701 0.070 10.014 0.435 0.065 6.692 0.401 0.053 7.566 0.539 0.050 10.780 0.434 0.050 8.68 0.368 0.037 9.946 0.350 0.028 12.500 0.434 0.025 17.360 0.253 0.040 6.325 0.232 0.025 9.28 0.199 0.019 10.474

2.3抗原與血清最佳稀釋度的確定方陣試驗(yàn)結(jié)果（表1）可見，當(dāng)血清和抗原的稀釋倍數(shù)較低時(shí)，OD450值都維持在一個(gè)較高的水平，但隨著稀釋度達(dá)到一定程度時(shí)，開始產(chǎn)生明顯的梯度變化。

綜合陰、陽性值、P/N值等方面的因素，初步確定抗原最佳包被濃度為300 ng/孔（即重組抗原以1: 500稀釋），待檢血清以1:50稀釋。

2.4ELISA反應(yīng)程序通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立的ELISA反應(yīng)程序如下：以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至300 ng/孔，每孔包被100μL，37℃作用2 h后，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次5 min；用pH 7.4的10%小牛血清/PBST溶液封閉，200μL/孔，37℃封閉2 h，PBST洗板（方法同前）；用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液作為樣品稀釋液將待檢血清按1:50稀釋，以100μL/孔加至各孔，37℃孵育1 h，PBST洗板（方法同前），加入1: 25000稀釋的兔抗豬酶標(biāo)二抗100μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗板（方法同前），加入100μL/孔TMB-過氧化氫尿素溶液，37℃避光顯色10 min后，加入100μL/孔2 M H2SO4終止液終止反應(yīng)，10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取OD450值。檢測時(shí)，每塊酶標(biāo)板上設(shè)兩份陽性血清對(duì)照、兩份陰性血清對(duì)照。計(jì)算陽性血清平均值ODP和陰性血清ODN值，陽性血清對(duì)照OD450平均值ODP≥0.5，陰性血清對(duì)照OD450平均值ODN≤0.2時(shí)，試驗(yàn)成立。待檢血清樣品的OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判為陽性，反之則判為陰性。

2.5特異性試驗(yàn)PCV、PRV、HCV、JEV和PRRSV陽性血清用建立的間接VP2-ELISA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

2.6.1批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)選取不同OD450值的8份血清樣品，用建立的VP2-ELISA進(jìn)行8次批內(nèi)重復(fù)檢測，結(jié)果見表2，變異系數(shù)均低于10%，說明該方法具有良好的批內(nèi)重復(fù)性。

2.6.2批間重復(fù)性試驗(yàn)用建立的VP2-ELISA，取5份陽性血清樣品和3份陰性血清樣品分別用3個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測。3次檢測的陰、陽性結(jié)果完全一致。5份陽性血清樣品的變異系數(shù)分別為5.067%、4.582%、7.573%、4.23%和8.641%，3份陰性血清樣品的變異系數(shù)分別為6.714%、5.793%和7.858%，變異系數(shù)均低于10%。表明建立的方法具有良好的批間重復(fù)性。

表2　VP2-ELISA批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table2　Results of repeat test of VP2-ELISA w ithin a batch

表3　VP2-ELISA與 Ceditest? PPV ELISA檢測結(jié)果比較Table3　Results of parallel detection by indirect VP2-ELISA and Ceditest? PPV ELISA

2.7VP2-ELISA方法與Ceditest? PPV ELISA Kit檢測結(jié)果比較將102份豬血清樣品分別用建立的間接VP2-ELISA和Ceditest PPV抗體檢測試劑盒進(jìn)行平行檢測，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，Ceditest?PPV ELISA Kit檢測為陽性的65份血清樣品中間接VP2-ELISA檢測出61份陽性；Ceditest?PPV ELISA Kit檢測為陰性的37份血清樣品中，間接VP2-ELISA檢出30份陰性。平行檢測的102份血清樣品中兩種方法檢測結(jié)果一致的有91份。與Ceditest?PPV ELISA Kit相比，間接VP2-ELISA的敏感性為93.8%，特異性為81.1%，符合率為89.2%。

3　討論與結(jié)論

已報(bào)道的PPV診斷方法主要有血凝試驗(yàn)（HA）及血凝抑制試驗(yàn)（HI）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光技術(shù)（IFA）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、核酸探針技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)（SECGA）、血清中和試驗(yàn)（SN）、乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）和免疫電泳技術(shù)等。PPV具有血凝性，應(yīng)用HA試驗(yàn)檢測病原，是較為快速、簡單的檢測方法[5]，主要用來檢測死產(chǎn)和木乃伊胎兒體內(nèi)的PPV，但該方法敏感性和特異性不太理想。PCR、核酸探針等診斷技術(shù)具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，近年來開始廣泛應(yīng)用于PPV的病原學(xué)檢測。HI試驗(yàn)可用于PPV的血清學(xué)檢測，但該方法所需紅細(xì)胞為豚鼠紅細(xì)胞，且待檢血清的處理也較為繁瑣。ELISA方法特異性好、靈敏度高、快速易行，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測。國內(nèi)早有PPV全病毒間接ELISA檢測方法的研究報(bào)道[6-8]，但是全病毒抗原因?yàn)榧兌葐栴}容易導(dǎo)致不同程度的背景反應(yīng)，且病毒純化過程較為繁瑣，難以標(biāo)準(zhǔn)化，還存在潛在散毒的危險(xiǎn)[9]。用重組蛋白建立間接ELISA可解決這些問題。

PPV基因組有2個(gè)主要的開放閱讀框，包括3’端結(jié)構(gòu)蛋白（核衣殼蛋白）VP1、VP2、VP3以及5’端非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和NS3。其中VP2蛋白是構(gòu)成病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[10]。李昌文等[11]經(jīng)過分析表明，不同PPV毒株VP2基因的核苷酸之間的同源性為99%左右，含有細(xì)小病毒的保守序列。因此，可選用VP2基因作為檢測豬群感染PPV血清抗體的抗原。國內(nèi)已有許多學(xué)者[12-14]對(duì)VP2基因的表達(dá)及ELISA檢測方法的建立開展了相關(guān)研究，但尚未見與國外商品化PPV ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較的專題報(bào)道。本研究所獲得的VP2重組蛋白，純化后產(chǎn)量高，利用其作為檢測用抗原進(jìn)行包被，建立了針對(duì)VP2抗體的間接ELISA檢測方法，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。與Ceditest?PPV ELISA Kit檢測結(jié)果相比，本方法的敏感性、特異性和符合率分別為93.8%（61/65）、81.1%（30/37）和89.2%（91/102），可用于豬細(xì)小病毒病血清抗體的檢測，為豬細(xì)小病毒病的防控發(fā)揮積極作用。

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Establishmentof the IndirectELISA for the Detection of Viralstructuralprotein Antibodies againstPorcine Parvovirus

Zhou Jie1,2,Nan Wenlong2,He Yuanqing1,Yin Lij ing1, Ren Qian1,Qin Lide2,Chen Yiping2*
(1.Laboratory Animal Research Center,Jiangsu University,JiangsuZhenj iang212013; 2.Diagnostic Reagent Laboratory,China Animal Heal th and Epidemic Center,ShandongQingdao266032)

In order to detect porcine parvovirus antibodies,an indirect ELISA was establ ished, by using the recombinant VP2 protein as antigen.The reaction conditions of the VP2-ELISA were explored and optimized.The optimal coating concent ration was 300 ng per wel l,the coating condition was at 4℃overnight,and serum samples were di luted to 1:50.The resul ts showed the VP2-ELISA assay was able to detect PPV positive serum,and had no cross-reactivity with serum against HCV,PRV,PRRSV,JEV and PCV,respectively.The int ra and inter-assay coef f icients of variation(CV)of the VP2-ELISA were al l less than 10%.102 swine serum samples were detected by the VP2-ELISA and Ceditest?PPV ELISA Kit in paral lel.The sensitivity and speci ficity of the VP2-ELISA were 93.8%and 81.1%respectively.The coincidence rate between these two assays was 89.2%.The resul ts indicated that the indirect VP2-ELISA was highly sensitive and speci f ic,and could be used for cl inical detection of PPV antibodies.

Porcine Parvovirus;Antibody;VP2-ELISA

S852.65

B

1672-9692(2016)04-0001-07

2016-03-01

周潔（1984-），女，碩士研究生，主要從事診斷試劑研究和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)工作。

陳義平（1966-），男，博士，研究員，主任，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)、診斷試劑研究相關(guān)工作。