胚胎期大鼠性腺生長與分化的研究

許麗惠 黃景星 王全溪

福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院福州350002

胚胎期大鼠性腺生長與分化的研究

許麗惠 黃景星 王全溪*

福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院福州350002

本試驗旨在研究胚胎期大鼠性腺生長與分化的情況。選取12.5～15.5 dpc SD大鼠胚胎為研究對象，運用PCR技術(shù)進行大鼠胚胎性別鑒定，采用H-E技術(shù)對大鼠性腺分化形態(tài)進行觀察。結(jié)果表明：12.5 d的鼠胚腎管已經(jīng)開始形成，生殖嵴已經(jīng)建立，此時仍無明顯的性別分化形態(tài)；13.5 d的鼠胚開始出現(xiàn)性別分化的跡象，雄性的原始性索開始形成，雌性性腺分化比雄性稍晚，此期仍不易辨別出典型的卵巢特征結(jié)構(gòu)；14.5 d的鼠胚性腺形態(tài)初步成型，此期性別明顯分化，雄性的原始性索開始分化為實心原始生精小管，雌性胚胎中性腺分為兩層，初步形成卵巢特征；15.5 d的鼠胚，雄性胚胎性腺中已經(jīng)具有明顯的曲精小管的雛形，雌性胚胎卵巢特征也開始明顯。大鼠胚胎性腺從13.5 d胚齡時開始分化，15.5 d胚齡性腺特征明顯。

大鼠胚胎原始生殖細胞性別鑒定性腺分化

性腺分化是指尚無雌雄之分的性腺向雌性或雄性性腺分化形成的過程。所有有性生殖的物種都來源于生殖細胞分化所形成的配子，生殖細胞是通過遺傳物質(zhì)傳遞得以繁衍。原始生殖細胞（PGCs）是生殖細胞的前體細胞，不同物種PGCs的起源各不相同，成分也有所差異。人、哺乳動物及一些爬行動物的PGCs順著背部間充質(zhì)遷移到生殖嵴中繼續(xù)分化發(fā)育。在某一特定時期，生殖嵴中的原始生殖細胞會開始向精原細胞或卵母細胞進行分化。生殖細胞在剛剛決定時不論形態(tài)還是行為在雄雌兩性之間沒有差別，一般在進入生殖嵴以后才開始出現(xiàn)性別分化。由初始形成的生殖腺分化為卵巢或睪丸，在性腺分化的基礎(chǔ)上，繼而進行了性別分化，發(fā)育成雄性或雌性[1]。性腺分化的深入研究對于胚胎發(fā)育研究具有重要意義。

目前很多學(xué)者對胚胎性腺分化做了研究。根據(jù)Clinton等[2]、Smith等[3]的研究資料，雞胚在孵化的第22期（3.5 d）性腺由體腔上皮增厚形成皮質(zhì)，外胚層的原始生殖細胞PGCs通過血液循環(huán)進入早期性腺。在第22～28期（3.5～5.5 d）期間某一時間點，性腺開始分化，發(fā)育出現(xiàn)差異。第30期（6.5 d）性腺在形態(tài)學(xué)上開始呈現(xiàn)差別。張穎等研究出施氏鱘的PGCs最早出現(xiàn)在1.5胚齡（days post-hatching，dph），并在10 dph時期形成性腺，性腺發(fā)育到180 dph時開始向卵巢或睪丸分化[4-5]。據(jù)黃美玉的研究表明，豬的胚胎發(fā)育到29 d時，生殖嵴中充滿原始生殖細胞，30 d時性腺便開始分化，此時可觀察到睪丸或卵巢具有的特征[6]。喬淑芬等認為，中國林蛙性腺分化開始于第31期，生殖腺向兩性開始分化時首先形成的是初級卵母細胞和初級精母細胞[7-8]。杜啟艷等發(fā)現(xiàn)泥鰍性腺發(fā)生于出膜后12 d，40日齡卵巢開始分

化，至55日齡卵巢分化完全，精巢于出膜后55 d左右開始分化，100 d左右分化完全，卵巢分化早于精巢[9-10]。

可見，各類動物性腺分化的時間都有所差異，分化過程也大相徑庭，有的動物在性腺分化過程中在同一時期向著卵巢或睪丸進行分化，而有的動物卵巢與睪丸的分化時間卻是錯開的。大鼠作為常用的試驗?zāi)Ｐ蛣游?，目前對其胚胎性腺生長分化研究較少。本研究以大鼠胚胎為材料，運用PCR技術(shù)進行大鼠胚胎性別鑒定，然后對大鼠胚胎性腺分化的特點進行HE染色觀察，為進一步研究大鼠胚胎發(fā)育、生殖細胞基因表達以及大鼠的繁殖性別控制等提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

試驗動物：健康3月齡SD大鼠6只，雌雄各半。自由采食和飲水。雄性大鼠確認其繁殖性能良好，雌鼠與雄鼠按1：1的比例合籠。次日早晨，檢查陰栓。見陰栓日中午記為0.5 dpc(days post coition,交配后天數(shù))。分別于12.5 dpc、13.5 dpc、14.5 dpc、15.5 dpc以剖腹產(chǎn)方法取大鼠胚胎，將其置于PBS緩沖液中備用。

胚胎的處理：每個胚胎取其頭部組織進行DNA提取和PCR鑒定胚胎性別。頭部以下胚胎組織用4%多聚甲醛固定液固定，用于HE觀察。

2 方法

2.1 性別鑒定

2.1.1 引物設(shè)計SRY基因為Y染色體上具體決定生物雄性性別的基因片段。根據(jù)雄性大鼠的SRY基因（PubMed Nucleotide AF274872）設(shè)計一對特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，目的片段長度為510 bp。

上游引物：5'-ATGTCAAGCGCCCCATGAA-3'；下游引物：5'-TTAGCTGCTGCTAGTGGAACT-3'。

2.1.2 DNA的提取取胚胎頭部組織，無菌獲取組織懸液，按照DNA提取試劑盒說明書提取組織DNA。

2.1.3 PCR鑒定反應(yīng)體系：DNA Sample（female and male）1.0 μL，2×Tap PCR MasterMix 12.5 μL，sense and antisense each 1 μL，加ddH2O至25 μL。

反應(yīng)條件：94℃、2 min 30 s；→59℃、1 min；→72℃、1 min；→94℃、1 min，59℃、50 s，72℃、1 min，35個循環(huán)→72℃、5 min；→4℃。將PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

2.2 HE法對大鼠胚胎性腺分化形態(tài)觀察將固定好的大鼠胚胎經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片制作及染色觀察。觀察12.5 d至15.5 d胚胎生殖嵴的組織形態(tài)學(xué)變化以及性腺分化特征，并用LEICA280顯微攝像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胚胎性別的PCR鑒定結(jié)果本次試驗取12.5 d、13.5 d、14.5 d、15.5 d共四個時期大鼠胚胎進行性別鑒定。根據(jù)圖1可知，PCR擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期的一致，沒有非特異性雜，陽性條帶為雄性胚鼠，其余為雌性胚鼠。

2.2 HE法觀察不同胚齡大鼠性腺組織結(jié)構(gòu)通過HE染色觀察大鼠胚胎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)可知，12.5 d的胚胎（圖2 A、B）腎管已經(jīng)開始形成，生殖嵴已經(jīng)建立，且其中可見遷移來的原始生殖細胞；原始生殖細胞體積大，核大且呈圓形或卵圓形，此時仍無明顯的性別分化形態(tài)，因此，此時大鼠胚胎未分化性腺。13.5 d的胚胎（圖2 C、D）雄性的原始性索開始形成，生殖細胞向精子發(fā)生，細胞分化還不完全，但可見支持細胞呈梭形；雌性性腺分化比雄性稍晚，但仍不易辨別出典型的卵巢特征結(jié)構(gòu)，因此，此時大鼠胚

胎開始出現(xiàn)性別分化。14.5 d的胚胎（圖2 E、F）性腺與中腎開始分離，原始性腺開始膨大，性腺形態(tài)初步成型。隨著性腺分化，性腺中的PGCs會逐漸分化成精原細胞和卵原細胞。雄性胚胎的原始性索開始分化為實心原始生精小管；雌性胚胎中性腺分為兩層，外層含有生殖細胞，內(nèi)層含有血管，具有卵巢特征，可見此時大鼠胚胎性別開始分化。15.5 d的的胚胎（圖2 H、K），雄性胚胎的性腺中已經(jīng)具有曲精細管的雛形，并可觀察到支持細胞和精原細胞；母鼠胚胎卵巢特征也開始明顯，外側(cè)分布著大的生殖細胞，內(nèi)側(cè)含有血管和網(wǎng)狀的細胞，因此，此時大鼠胚胎性別特征明顯。

3 討論

PGCs來源于胚外內(nèi)胚層或上胚層，多數(shù)觀點認為PGCs來源于上胚層[11]。小鼠PGCs最早出現(xiàn)于7.0～7.5 dpc，PGCs定位于后腸，從8.5 dpc開始遷徙，經(jīng)背腸系膜遷徙至中腎側(cè)的生殖嵴[12]。9.5 dpc，PGCs離開后腸，通過背腸系膜向靶器官生殖嵴遷徙；12.5 dpc，所有PGCs到達生殖嵴。在此遷徙中，PGCs數(shù)目增殖300倍，分裂周期為16 h。12.5 dpc，雄性生殖細胞呈索狀排列，雌性則隨意排列。13.5 dpc，雄性生殖細胞進入有絲分裂休止期，而雌性則開始減數(shù)分裂形成卵原細胞，后休止于減數(shù)分裂前期Ⅰ。出生后性成熟時，雄性生殖細胞恢復(fù)有絲分裂，形成生精干細胞，進一步減數(shù)分裂成精子；卵原細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，產(chǎn)生成熟卵子[13]。

根據(jù)王美之等[14]的研究，小鼠胚胎在12.0 dpc時，生殖嵴開始增厚變大，PGCs明顯增多，表面上皮向深部增殖，此時生殖嵴里沒有出現(xiàn)明顯的性別分化。12.5 dpc的小鼠胚胎，生殖嵴與中腎嵴之間縱溝明顯，生殖嵴與中腎嵴明顯分開，此時性腺已經(jīng)開始性別分化，雄性逐漸形成條形性索，且原始性索有分化為原始生精小管的趨勢，PGCs在生殖嵴中分布較均勻，而雌性生殖嵴生成皮質(zhì)索。13.0 dpc的小鼠胚胎，雄性原始性索已經(jīng)分化成實心的原始生精小管，雌性皮質(zhì)索逐漸分離成許多孤立細胞團，由原始生殖細胞與周圍上皮細胞組成。13.5 dpc小鼠胚胎，雄性原始生精小管明顯可見，管腔中可見原始生殖細胞分化的精原細胞以及許多未成熟的支持細胞；雌性生殖腺中孤立細胞團逐漸發(fā)育成原始卵泡，原始生殖細胞分化為卵原細胞，周圍有一層由上皮細胞分化而來的卵泡細胞。

本試驗中，大鼠胚胎性腺在12.5 dpc前還未具有明顯的睪丸和卵巢的特征，仍處于未分化時期。13.5 dpc開始出現(xiàn)性別分化的跡象，雄性的原始性索開始形成，生殖細胞向精子發(fā)生，支持細胞分化還不完全；此期仍不易辨別出典型的卵巢特征結(jié)構(gòu)。14.5 dpc的大鼠胚胎性腺開始出現(xiàn)明顯分化，此時的睪丸發(fā)育明顯，原始性索開始分化為實心原始生精小管；雌性胚胎中性腺分為兩層，外層含有生殖細胞，內(nèi)層含有血管，即具有卵巢特征。15.5 dpc大鼠胚胎已明顯出現(xiàn)精原細胞雛形和原始卵泡，其中公鼠胚胎精原細胞位于曲精細管管壁上，母鼠胚胎的原始卵泡出現(xiàn)在皮質(zhì)層。可見，不同動物由于胚胎發(fā)育的時間不同，其性腺分化時間也表現(xiàn)不盡一致。因此，本研究可為大鼠胚胎發(fā)育的深入研究提供參考。在大鼠胚胎發(fā)育過程中，胚胎生殖嵴于11.0 dpc時已經(jīng)生成。在本試驗中，12.5 dpc大鼠胚胎已可見典型的生殖嵴形態(tài)；13.5 dpc生殖嵴開始有分化跡象，雄性大鼠胚胎開始形成原始性索，雌性表現(xiàn)不明顯，即卵巢發(fā)育晚于睪丸；14.5 dpc則開始出現(xiàn)明顯的分化特征。14.5 dpc至15.5 dpc之間，雄性與雌性原始生殖細胞發(fā)育具有顯著差異并完成性別分化。這一結(jié)論為更進一步研究大鼠胚胎發(fā)育、生殖細胞基因表達等提供了理論依據(jù)，對于大鼠胚胎原始生殖細胞詳細的形態(tài)學(xué)特征還需進一步研究。

4 結(jié)論

大鼠胚胎在13.5 dpc時生殖嵴開始有分化跡象，雄性大鼠胚胎開始形成原始性索，而雌性大鼠卵

巢發(fā)育晚于睪丸，在14.5 dpc時才開始出現(xiàn)明顯的分化特征。這一結(jié)果為進一步研究大鼠胚胎發(fā)育、生殖細胞基因表達以及大鼠的繁殖性別控制等提供數(shù)據(jù)支撐。

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The study of the growth and differentiation of embryonic rat gonads

Xu Lihui Huang Jingxing Wang Quanxi*
（College of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002）

The experiment was to study the growth and differentiation of rat embryonic gonads.In this experiment,six nest of 12.5～15.5 dpc embryos of SD rats,were selected and the sex was identified by PCR technology.Observation of gonadal differentiation characteristics was conducted on three male rats and three female rats of each embryo ages by using H-E techniques.On the 12.5 days' embryo,the renal tubular and genital ridge began to form,but still no clear sex differentiation morphology was observed in the rat embryos.On the 13.5 days'embryo,sex differentiation of rat embryos began to appear,the original male sex cord began to form,but it was still not easy to identify the typical ovarian characterized structure in female gonadal.But the initial shape of mouse embryo gonadal morphology was obviously found on the 14.5 days'embryo.The original male sex cord began to differentiate to the solid original spermatogenic tubules.But the female embryonic gonads had two layers,and showed the initial formation of ovarian characteristics.On the 15.5 days'embryo,the prototype of the seminiferous tubules had been obviously observed in the gonads of male embryonic rats, and the female embryos ovarian characteristics were also clearly found.Therefore,the time of the rat gonads differentiation was on the 13.5th day and the gonad characteristics significantly was on the 15.5th day.

Rat embryo Primordial germ cells Gender identification Gonadal differentiation

A

1003-4331（2016）06-0017-04

許麗惠（1987-），女，福建龍海人，碩士，助理實驗師，從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)的研究。E-mail：xulihui314@qq.com。

*通信作者：王全溪，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，E-mail：wqx608@126.com。