橋本甲狀腺炎患者外周血濾泡輔助T細(xì)胞水平及臨床意義

馬智鴻，潘凌峰，王 靜，包建東

（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無錫214063）

橋本甲狀腺炎患者外周血濾泡輔助T細(xì)胞水平及臨床意義

馬智鴻，潘凌峰，王 靜，包建東

（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無錫214063）

目的 檢測(cè)橋本甲狀腺炎（HT）患者外周血濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）水平，探討Tfh與HT發(fā)病的關(guān)系。方法 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HT患者及對(duì)照組外周血FT3、FT4、TSH、甲狀腺自身抗體水平，采用流式細(xì)胞術(shù)分析各組試驗(yàn)對(duì)象的外周血Tfh的水平，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 與對(duì)照組相比，橋本甲狀腺炎患者外周血Tfh比例顯著升高（P＜0.05）；橋本甲狀腺炎患者外周血Tfh與甲狀腺自身抗體TPO-Ab呈正相關(guān)（P＜0.05），但與Tg-Ab無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)果 HT患者外周血中Tfh可能參與橋本甲狀腺炎的發(fā)生和發(fā)展。

橋本甲狀腺炎； 濾泡輔助性T細(xì)胞； 流式細(xì)胞術(shù)

橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）又稱為慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是引起甲狀腺功能減退的最常見病因。HT是一種器官特異性自身免疫性疾病。研究表明HT的發(fā)病與遺傳易感性、環(huán)境因素、免疫因素密切相關(guān)，但確切的發(fā)病原因尚未闡明。以往對(duì)HT的細(xì)胞免疫學(xué)研究多集中在Th1和Th2細(xì)胞?［1］，近年來，研究者發(fā)現(xiàn)了一種新的Th細(xì)胞亞群，被稱為濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cells，Tfh）。該細(xì)胞在次級(jí)淋巴器官的生發(fā)中心形成、抗體親和力成熟、B細(xì)胞活化、成熟方面均發(fā)揮重要作用。研究表明Tfh細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子參與一些自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［2-4］。目前，Tfh細(xì)胞與HT的發(fā)病機(jī)制的研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在分析HT患者外周血Tfh細(xì)胞的比例及其與HT患者血清中抗甲狀腺自身抗體的關(guān)系，探討Tfh細(xì)胞在HT發(fā)病中的作用。

材料和方法

1 研究對(duì)象

所有HT患者均來自江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所附屬江原醫(yī)院2013年10月至2014年2月期間門診及病房，共20例，其中男 2例，女18例，年齡 25～73歲，平均45.3±15.0歲，診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)制定的《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南》（2007年版）［5］。所納入的研究對(duì)象均排除其他自身免疫性疾病，感染性疾病及妊娠，未服用任何非甾體類和糖皮質(zhì)激素類藥物。對(duì)照組：收集同一時(shí)期江原醫(yī)院體檢中心的體檢健康者18例，男2例，女16例，年齡20～59歲，平均42.5±12.6歲。兩組研究對(duì)象間無年齡及性別差異。本研究經(jīng)江原醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

2 試劑及儀器

PerCP-Cy5.5-鼠抗人CD4單克隆抗體、Alexa Fluor647-鼠抗人CXCR5單克隆抗體、PE-鼠抗人ICOS單克隆抗體、流式細(xì)胞儀溶血?jiǎng)‵ACS Lysing solution）及FACSCalibur流式細(xì)胞儀均為美國(guó)BD Biosciences公司產(chǎn)品；E170全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀、FT3，F(xiàn)T4，TSH，TPO-Ab及Tg-Ab試劑盒均為瑞士Roche公司原裝試劑。

3 甲狀腺激素、抗甲狀腺自身抗體的檢測(cè)

所有研究對(duì)象均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血，其中分離膠促凝管采集5 mL，EDTA-K2抗凝管采集2 mL，充分顛倒混勻，標(biāo)本在6h內(nèi)測(cè)定。分離膠管置37℃溫育，待血清析出，3 000 r/min離心5 min收集血清。血清標(biāo)本用于檢測(cè)甲狀腺激素游離三碘甲腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺素（TSH）和抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、抗甲狀腺球蛋白抗體（Tg-Ab）的含量。EDTAK2抗凝血標(biāo)本用于流式細(xì)胞分析。

4 外周血Tfh細(xì)胞的檢測(cè)

先將試管分為測(cè)定組和對(duì)照組。將上述采集好的EDTA-K2抗凝血充分混勻后分別吸取50 μL至流式細(xì)胞分析管中。在Tfh染色試管中加入PerCPCy5.5-鼠抗人 CD4抗體、Alexa Fluor647-鼠抗人CXCR5抗體、PE-鼠抗人ICOS抗體各10 μL。振蕩器上充分混勻，避光室溫放置15 min。加入新配制的流式細(xì)胞溶血素500 μL，振蕩器混勻，避光放置10 min，加入1 mL PBS洗滌1次，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再加入500 μL PBS充分混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)經(jīng)BD FACSDIVA軟件獲取和分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 甲狀腺激素及甲狀腺自身抗體的表達(dá)水平

各組研究對(duì)象的血清甲狀腺激素及甲狀腺自身抗體檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 各研究對(duì)象甲狀腺功能及血清TPO-Ab，Tg-Ab水平

2 外周血不同表型的Tfh細(xì)胞比例

Tfh細(xì)胞若采用CD4+CXCR5+兩種標(biāo)記作為其表型的話，HT患者（n=20）CD4+CXCR5+T細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞比例（16.05±3.25）%與健康對(duì)照

組比較（n=18）所占比例（15.88±3.81）%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.15，P＞0.05）。Tfh細(xì)胞若采用CD4+CXCR5+ICOS+三種標(biāo)記作為其表型，此時(shí)HT患者外周血CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞比例（2.85±1.71）%明顯高于健康對(duì)照組（1.15± 0.59）%，（t=4.27，P＜0.05）。見圖1。

3 CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞的比例與抗甲狀腺自身抗體的相關(guān)性分析

對(duì)HT患者（n=20）的CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞比例與抗甲狀腺自身抗體（TPO-Ab、Tg-Ab）進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示HT患者組外周血CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞比例與其外周血中抗甲狀腺自身抗體TPO-Ab呈正相關(guān)（r= 0.678，P＜0.05），但與Tg-Ab無相關(guān)性（r=0.338，P＞0.05）。

討 論

CD4+T細(xì)胞按照細(xì)胞分化和功能可為輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulate T cell，Treg）。Th細(xì)胞又根據(jù)其細(xì)胞分化和功能特征分為Th1和Th2兩個(gè)亞群。Th1主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、和IL-10等細(xì)胞因子，能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖、分化，介導(dǎo)體液免疫。早期的研究認(rèn)為HT是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)發(fā)生的，然而隨著研究的深入，目前認(rèn)為Tfh細(xì)胞才是介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化的主要細(xì)胞。研究顯示，Tfh細(xì)胞亞群表面持續(xù)表達(dá)CXCR5，并表達(dá)CD40L和ICOS、PD-1等表面分子，BCL-6是其特異性的轉(zhuǎn)錄分子［6-7］。淋巴濾泡所產(chǎn)生的趨化因子 CXCL13是CXCR5的特異性配體，表達(dá)CXCR5的Tfh細(xì)胞在淋巴濾泡產(chǎn)生的CXCL13的趨化下，遷移并定居于淋巴濾泡。Tfh細(xì)胞通過其表達(dá)的CD40L、ICOS與B細(xì)胞上的CD40和 ICOSL結(jié)合并相互作用，促進(jìn)Tfh分泌IL-21，繼而作用于B細(xì)胞，使B細(xì)胞活化并分泌抗體。

HT患者外周血Tfh細(xì)胞較對(duì)照組顯著升高，提示Tfh細(xì)胞可能在HT的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用，其機(jī)制可能為：濾泡樹突狀細(xì)胞通過B細(xì)胞受體（BCR）將抗原提呈給B細(xì)胞，活化的B細(xì)胞通過其表達(dá)的 ICOSL、CD40、SLAM等與 Tfh相互作用，在濾泡接受Tfh細(xì)胞的輔助，分化為漿細(xì)胞或者記憶細(xì)胞。這些細(xì)胞過度表達(dá)并作用于甲狀腺自身組織時(shí)，則產(chǎn)生了針對(duì)甲狀腺自身組織的抗體，如 TPO-Ab、Tg-Ab等，這些抗體通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞破壞，甲狀腺組織呈彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)改變。在我們的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，我們分析Tfh細(xì)胞時(shí)采用了兩種表型，分別是CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+ICOS+。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)采用CD4+CXCR5+表型時(shí)，HT組與對(duì)照

組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但采用CD4+CXCR5+ICOS+時(shí)，HT患者外周血Tfh細(xì)胞較對(duì)照組顯著升高。這與姜俊等［8］的結(jié)果不太一致，他們當(dāng)時(shí)對(duì)49例HT患者進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HT組CD4+CXCR5+比例較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差別的可能因素一是試驗(yàn)對(duì)象個(gè)體因素的差別，不同個(gè)體的機(jī)體免疫功能不一樣。還有一種可能是趨化因子CXCR5并不是Tfh細(xì)胞的特異性細(xì)胞因子，其他的CD4+T細(xì)胞也可一過性表達(dá)CXCR5，只有Tfh是持續(xù)表達(dá)CXCR5，若采用CD4+CXCR5+作為Tfh細(xì)胞表型的話，無形中擴(kuò)大了細(xì)胞群體。而Tfh細(xì)胞表達(dá)ICOS因子可于B細(xì)胞表面的ICOSL配體特異性結(jié)合，是T、B細(xì)胞相互協(xié)作時(shí)一組重要的信號(hào)通道，因此以CD4+CXCR5+ICOS+作為標(biāo)志可能更能準(zhǔn)確反映Tfh的比例。

此外本實(shí)驗(yàn)還對(duì)Tfh細(xì)胞與HT患者體內(nèi)的TPO-Ab、Tg-Ab抗體做了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示HT患者外周血Tfh細(xì)胞與TPO-Ab呈正相關(guān)（r= 0.678，P＜0.05），但與Tg-Ab無相關(guān)性（r=0.338，P＞0.05）。這與Zhu等［9］的研究結(jié)果較相符。

以往認(rèn)為Th2細(xì)胞通過分泌IL-4刺激B細(xì)胞增殖和Ig類別轉(zhuǎn)換，上調(diào)B細(xì)胞CD40和MHCII的表達(dá)，是輔助B細(xì)胞分化、成熟的主要Th細(xì)胞?，F(xiàn)在則認(rèn)為Tfh細(xì)胞才是輔助B細(xì)胞分化、成熟的主要Th細(xì)胞亞群，而Th2細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子在B細(xì)胞的活化過程中僅起調(diào)節(jié)作用。目前有關(guān)HT的發(fā)病機(jī)制與T細(xì)胞的關(guān)系正成為細(xì)胞免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，一些研究相繼報(bào)道了Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子及Treg細(xì)胞及其細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在HT患者外周血及甲狀腺組織中的異常表達(dá)［10-11］。Tfh細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步拓寬了我們對(duì)自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，為我們闡明HT的發(fā)病機(jī)制，以及在對(duì)HT的診斷和治療方面提供新的思路和方向。

［1］Phenekos C，Vryonidou A，Gritzapis A D，et al.Th1 and Th2 serum cytokine profiles characterize patients with Hashimoto’s thyroiditis（Th1）andGraves’disease（Th2）.Neuroimmunomodulation，2004，11（4）：209-213.

［2］Simpson N，Gatenby P A，Wilson A，et al.Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype thatidentifiesasubsetofseveresystemiclupus erythematosus.Arthritis Rheum，2010，62（1）：234-244.

［3］Ma J，Zhu C，Ma B，et al.Increased frequency of circulating follicular helper T cells in patients with rheumatoid arthritis.Clin Dev Immunol，2012，2012：827480.

［4］Li X Y，Wu Z B，Ding J，et al.Role of the frequency of blood CD4（+）CXCR5（+）CCR6（+）T cells in autoimmunity in patients with Sj?gren’s syndrome.Biochem Biophys Res Commun，2012，422（2）：238-244.

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南》編寫組.中國(guó)甲狀腺疾病診治指南—甲狀腺炎.中華內(nèi)科雜志，2008，47（9）：784-788.

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［7］金伯泉.T-B細(xì)胞協(xié)作研究的重大突破—濾泡輔助性T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，一個(gè)新的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞群.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25（1）：1-5.

［8］姜俊，陳宜剛，葉軍，等.橋本氏甲狀腺炎患者濾泡輔助性T細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，33（12）：1719-1721.

［9］Zhu C，Ma J，Liu Y，et al.Increased frequency of follicular helper T cells in patients with autoimmune thyroid disease.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（3）：943-950.

［10］王榮，張健，秦秋，等.Foxp3在自身免疫性甲狀腺病患者外周血和病變組織中的表達(dá).西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，33（1）：56-60.

［11］薛海波，馬蕾，王秀云，等.橋本甲狀腺炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th17細(xì)胞平衡動(dòng)態(tài)變化的研究.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2012，6（8）：2075-2079.

（潘子昂編輯）

The Relationship Between Follicular Helper T Cells in Peripheral Blood and Hashimoto’s Thyroiditis

MA Zhi-hong，PAN Ling-feng，WANG Jing，BAO Jian-dong
（Institute of Jiangsu Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China）

Objective To detect the frequencies of circulating follicular helper T cells（Tfh）in peripheral blood of patients with Hashimoto’s thyroiditis（HT），in order to evaluate the relationship between Tfh cells and pathogenesis of HT.Methods The serum levels of thyroid hormone and thyroid autoantibodies（TPOAb，Tg-Ab）were measured by electro-chemiluminescence immunoassay（ECLIA）of both HT patients and normal controls.Frequencies of Tfh cells in peripheral blood were analyzed by flow cytometry，and the relationship with the levels of autoimmune antibody was assessed.Results Tfh cells in Hashimoto’s thyroiditis patients were higher than those in the healthy controls（P＜0.05）.Tfh cells had a positive correlation with TPO-Ab in patients with HT（P＜0.05）.However，there were no relationship between the serum levels of Tg-Ab and the percentage of Tfh cells in HT patients（P＞0.05）.Conclusion Tfh cell may be involved in the onset and development of Hashimoto’s thyroiditis.

Hashimoto’s thyroiditis； Follicular helper T cells； Flow cytometry

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.010

2016-06-13；

2016-07-14