慢性疲勞綜合征小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能降低

趙海， 姚剛， 錢(qián)寧， 陳明飛， 楊智， 吳曙光

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，貴陽(yáng)550002)

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慢性疲勞綜合征小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能降低

趙海， 姚剛， 錢(qián)寧， 陳明飛， 楊智， 吳曙光*

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，貴陽(yáng)550002)

目的 對(duì)比分析慢性疲勞綜合征小鼠與正常小鼠之間空間學(xué)習(xí)記憶功能存在的差異性。方法 采用復(fù)合刺激法復(fù)制慢性疲勞綜合征(CFS)小鼠模型，隨后采用Morris水迷宮檢測(cè)CFS小鼠與正常組小鼠之間空間學(xué)習(xí)記憶功能存在的差異。結(jié)果 模型組小鼠尋找隱藏平臺(tái)的潛伏期、總路程、平均游泳速度及目標(biāo)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的百分比均顯著低于正常組(P<0.05)，正常組小鼠尋找隱藏平臺(tái)主要采用空間搜索策略，而CFS小鼠主要采用重復(fù)環(huán)繞搜索策略。結(jié)論 CFS小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能降低。

Morris水迷宮；復(fù)合刺激；認(rèn)知功能；空間學(xué)習(xí)和記憶

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是在現(xiàn)代節(jié)奏緊張的生活方式下出現(xiàn)的以食欲不振、體質(zhì)量下降、免疫功能受損及精神癥狀不佳等慢性疲勞為突出表現(xiàn)的全身性癥候群(Katafuchietal.,2003；任秋蘭，翟偉，2011)。調(diào)查顯示我國(guó)城市人口發(fā)病率在10%～25%，世界衛(wèi)生組織估計(jì)此病危及世界人口的20%～25%，CFS對(duì)患者的記憶力、注意力、工作、教育和個(gè)人活動(dòng)帶來(lái)嚴(yán)重的影響，現(xiàn)已成為2l世紀(jì)影響人類身心健康的重要因素之一，目前越來(lái)越多的人正受到CFS的困擾，而且發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)(Jiangetal.,2004；吳芳鵬等，2008)。

有研究表明CFS患者的認(rèn)知能力、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、細(xì)胞免疫功能及下丘腦-垂體-腎上腺軸功能等發(fā)生了不同程度的紊亂(李莉，盧洪洲，2009；王小峰，2012；張穎，黃希庭，2012；Tomasetal.,2013； 翟亞南等，2013； Craddocketal.,2014；Kempkeetal.,2015)，同時(shí)患者的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體啟動(dòng)子區(qū)基因多型分布與正常健康人群相比差異顯著(施璐霞，毛廣平，2006)，CFS患者的很多細(xì)胞、組織器官、系統(tǒng)等都受到了不同程度的影響。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)患CFS的SD大鼠血清中雌、孕激素水平顯著降低，下丘腦-垂體-性腺軸功能出現(xiàn)紊亂，同時(shí)其F1代的學(xué)習(xí)記憶能力低下、學(xué)習(xí)興趣降低，定位航行時(shí)間延長(zhǎng)，空間搜索次數(shù)減少，患有先天性甲狀腺功能減退病癥(congenital hypothyroidism)(劉蕾，錢(qián)寧，2011)。小鼠是生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究中重要的模式生物之一，目前將小鼠用于海馬、記憶功能等方面的研究已經(jīng)取得了顯著成就。本實(shí)驗(yàn)擬采用復(fù)合刺激造模法復(fù)制CFS雌性KM小鼠(余曦明等，2014)，采用Morris水迷宮對(duì)CFS小鼠與正常小鼠進(jìn)行記憶功能的行為學(xué)檢測(cè)，對(duì)比分析二者空間學(xué)習(xí)記憶功能的差異，進(jìn)一步探討分析復(fù)合刺激構(gòu)建CFS的方法對(duì)小鼠記憶功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康KM雌性小鼠44只，體質(zhì)量20 g±2 g，由重慶騰鑫公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0001]。購(gòu)入后放入動(dòng)物代養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所批準(zhǔn)后進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 50 mL離心管和計(jì)時(shí)器等實(shí)驗(yàn)器材(上海樂(lè)培實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；Morris水迷宮(中國(guó)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 CFS小鼠模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為2組：正常組(對(duì)照組，n=22)、模型組(給予復(fù)合刺激處理組，n=22)。每天對(duì)模型組小鼠實(shí)施下列3組復(fù)合刺激處理，連續(xù)5周。束縛刺激：前3天對(duì)小鼠用50 mL塑料離心管進(jìn)行適應(yīng)性束縛10 min，以后每天束縛的時(shí)間為30 min；力竭刺激：將小鼠放入水溫為28 ℃±2 ℃，水深25 cm左右的水池中，前3天進(jìn)行適應(yīng)性游泳15 min，以后每天游泳30 min或直至力竭；夾尾刺激：用卵圓鉗夾住小鼠尾根部1 cm處，時(shí)間為15 s左右，鉗夾力度以雌鼠不適、掙扎、發(fā)出哀叫聲為度。在此基礎(chǔ)上每周隨機(jī)對(duì)模型組小鼠進(jìn)行低溫、饑餓、饑渴及明暗顛倒刺激。正常組小鼠不給予任何刺激，實(shí)驗(yàn)期間嚴(yán)格控制小鼠的進(jìn)食量(每只每天5 g)，自由飲水。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)連續(xù)5周復(fù)合刺激處理后，隨機(jī)選取模型組和正常組小鼠各10只，隨后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的起止時(shí)間應(yīng)保持一致，并保證環(huán)境因素的一致性。實(shí)驗(yàn)室必須保持安靜，池壁上標(biāo)記物和池中隱避平臺(tái)的位置保持固定，實(shí)驗(yàn)人員將小鼠放入水池后，立即離開(kāi)所站立的位置，避免小鼠將實(shí)驗(yàn)人員誤認(rèn)為是標(biāo)記物。

空間記憶采集實(shí)驗(yàn)(acquisition trial)：實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，每只小鼠每天訓(xùn)練4次，每天以半隨機(jī)的方式選擇入水點(diǎn)(表1)，將小鼠面向池壁，輕放入水中，小鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，記其登上平臺(tái)所需的時(shí)間，即為潛伏期；若60 s未能找到平臺(tái)，記潛伏期為60 s，并引導(dǎo)小鼠到平臺(tái)上并停留30 s，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，必須將小鼠擦干，并用加熱器烘干其毛發(fā)，每天記錄小鼠的潛伏期、游泳路程、速度和游泳軌跡等情況。

空間探索實(shí)驗(yàn)(probe/retention trial)：在游泳訓(xùn)練6 d結(jié)束后，第7天時(shí)撤除平臺(tái)，分析各組小鼠在水迷宮里搜索原隱藏平臺(tái)的行為，收集相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 Morris水迷宮空間記憶采集(隱藏平臺(tái)尋找)實(shí)驗(yàn)起始象限

注： N. 北方， E. 東方， S. 南方， W. 西方。

Notes： N. north， E. east， S. south， W. west.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 空間記憶采集實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)6 d的游泳訓(xùn)練，隨著時(shí)間的推移，正常組與模型組小鼠的潛伏期縮短，從訓(xùn)練的第3天起，正常組小鼠的潛伏期極顯著低于模型組(圖1：A，P<0.01)。2組小鼠在目標(biāo)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的百分比隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，正常組小鼠增長(zhǎng)的速度明顯快于模型組，且從第4天起，目標(biāo)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的百分比極顯著高于模型組(圖1：B，P<0.01)。模型組小鼠游泳前3天的總路程顯著低于正常組，但是從第4天起，其總路程顯著高于正常組(圖1：C，P<0.05)，模型組平均游泳速度從第1天起顯著低于正常組(圖1：D，P<0.05)。

圖1 正常組與模型組小鼠空間記憶采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

A. 潛伏期， B. 目標(biāo)象限滯留時(shí)間的百分比， C. 總路程， D. 平均游泳速度; 與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01; 下同。

A. time of latency， B. time percentage in target quadrant， C. path length， D. average swim speed; compared with the normal group，*P<0.05，**P<0.01; the same below.

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮第7天的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠平臺(tái)穿越次數(shù)和游泳總路程極顯著低于正常組(圖2：A，C，P<0.01)。模型組小鼠的平均游泳速度和在目標(biāo)象限滯留時(shí)間的百分比與正常組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2：B，D，P<0.05)。

2.3 搜索策略分布

通過(guò)軟件對(duì)2組小鼠7 d游泳實(shí)驗(yàn)搜索策略進(jìn)行分析，結(jié)果顯示正常組小鼠主要是采用在游泳池內(nèi)直接向平臺(tái)游去，或是最多用1圈的路程便游向目標(biāo)象限的模式進(jìn)行尋找隱藏平臺(tái)，以空間搜索策略為主(圖3：A)；模型組小鼠主要采用在游泳水池的四周環(huán)繞游泳的模式進(jìn)行尋找隱藏平臺(tái)，以重復(fù)環(huán)繞搜索策略為主(圖3：B)；對(duì)2組小鼠的搜索策略進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示第7天，2組小鼠空間搜索策略百分比之間的差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，重復(fù)環(huán)繞搜索策略百分比之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，P<0.05)。2組小鼠典型搜索軌跡分別見(jiàn)圖3：C，D。

圖2 正常組與模型組小鼠第7天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

A. 平臺(tái)穿越次數(shù)， B. 目標(biāo)象限滯留時(shí)間的百分比， C. 總路程， D. 平均游泳速度。

A. passing times across platform， B. time percentage in target quadrant， C. path length， D.average swim speed.

圖3 正常組與模型組小鼠實(shí)驗(yàn)期間搜索策略分布

A. 正常組小鼠搜索策略， B. 模型組小鼠搜素策略， C. 正常組小鼠典型游泳軌跡， D. 模型組小鼠典型游泳軌跡。

A. searching strategies employed by normal mice， B. searching strategies employed by chronic fatigue syndrome mice， C. typical swim-tracking path employed by normal mice， D. typical swim-tracking path employed by chronic fatigue syndrome mice.

圖4 正常組與模型組小鼠第7天搜索策略百分比(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

3 討論

目前CFS已成為21世紀(jì)影響人類身心健康的新殺手，發(fā)病率逐年上升，越來(lái)越多的人患有CFS(姜淑云等，2004)。CFS患者體力、腦力活動(dòng)長(zhǎng)期過(guò)度緊張，導(dǎo)致各系統(tǒng)調(diào)節(jié)失常，嚴(yán)重威脅人類身心健康，使生活質(zhì)量明顯下降，青少年患者以工作記憶功能受損為最突出表現(xiàn)(Sulheimetal.,2015)。研究發(fā)現(xiàn)CFS患者神經(jīng)解剖學(xué)發(fā)生了改變，對(duì)內(nèi)源性疼痛的認(rèn)知功能受損(Ickmansetal.,2015；van Der Schaafetal.,2015)，患者的腦內(nèi)側(cè)前額葉皮層、島葉、軀體感覺(jué)皮質(zhì)、前扣帶回皮層之間的腦區(qū)功能連接出現(xiàn)了異常(孟凡星等，2014；Boissoneaultetal.,2016)，左頂葉小葉額上回連接區(qū)域變大(Hampsonetal.,2015)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用經(jīng)典的復(fù)合刺激造模法復(fù)制CFS雌性KM小鼠，Morris水迷宮檢測(cè)CFS小鼠與正常小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化，意在對(duì)比分析二者空間學(xué)習(xí)記憶功能存在的差異性。

Morris水迷宮空間記憶采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)6 d的游泳訓(xùn)練，隨著時(shí)間的推移，正常組與模型組雌性小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短，但正常組小鼠潛伏期縮短的速度更快，從訓(xùn)練第3天起正常組的潛伏期極顯著低于模型組(P<0.01)。2組小鼠在目標(biāo)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的百分比隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，正常組小鼠增長(zhǎng)的速度明顯快于模型組，且從第4天起目標(biāo)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的百分比極顯著高于模型組(P<0.01)。模型組小鼠游泳的總路程和平均游泳速度均顯著低于正常組(P<0.05)，由此可見(jiàn)CFS雌性小鼠的空間記憶能力受到了影響；隨后于游泳訓(xùn)練后的第7天撤除隱藏平臺(tái)，檢測(cè)分析2組小鼠在搜索原隱藏平臺(tái)的行為變化，結(jié)果顯示模型組小鼠平臺(tái)穿越次數(shù)、游泳總路程、平均游泳速度及目標(biāo)象限滯留時(shí)間的百分比均顯著低于正常組(P<0.05)；最后對(duì)小鼠Morris水迷宮期間進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)搜索策略分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組雌性小鼠以空間搜索策略為主尋找隱藏平臺(tái)，CFS雌性小鼠以重復(fù)環(huán)繞搜索策略為主尋找隱藏平臺(tái)。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，復(fù)合刺激構(gòu)建CFS模型的方法不僅對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、下丘腦-垂體-性腺軸等產(chǎn)生影響，對(duì)其學(xué)習(xí)記憶功能也產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，CFS雌性小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能降低。CFS小鼠的大腦功能、海馬結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，CFS小鼠F1代出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力低下與其母鼠孕前患有CFS之間是否存在必然的聯(lián)系，這種內(nèi)在的聯(lián)系具體機(jī)制如何，有待在今后科研工作中進(jìn)一步研究和探討。

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The Spatial Learning and Memory Function were Reduced in Chronic Fatigue Syndrome Mice

ZHAO Hai， YAO Gang， QIAN Ning， CHEN Mingfei， YANG Zhi， WU Shuguang*

(Institute of Laboratory Animals, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China)

Objective To analysis the differences of spatial learning and memory function between chronic fatigue syndrome and normal mice. Methods The chronic fatigue syndrome (CFS) mice was first established by compound stimulus method， and then the differences of spatial learning and memory function between chronic fatigue syndrome and normal mice were explored using Morris water maze test. Results The time of latency， path length， average swim speed and percent time in target quadrant for searching hidden platform were significantly decreased in CFS mice compared with the normal group (P<0.05). The normal mice adopt spatial strategy to find the hidden platform， while the CFS mice will adopt a repetitive looping strategy. Conclusion The spatial learning and memory function was decreased in CFS mice compared with the normal mice.

Morris water maze; compound stimulus; cognitive function; spatial learning and memory

2016-06-14 接受日期：2016-08-19

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院院內(nèi)項(xiàng)目([2015]01)

趙海， 碩士， 助理實(shí)驗(yàn)師， 從事胎盤(pán)形成研究， E-mail：344947218@qq.com

*通信作者 Corresponding author， 碩士， 高級(jí)實(shí)驗(yàn)師， 從事中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究， E-mail：243099502@qq.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160161

Q959.837

A

1000-7083(2016)06-0879-05