楔形兩極蟲(黏體門，雙殼目)的形態(tài)學(xué)重描述及其近緣種的分子系統(tǒng)學(xué)研究

李超, 索棟, 楊承忠, 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動物生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401331)

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楔形兩極蟲(黏體門，雙殼目)的形態(tài)學(xué)重描述及其近緣種的分子系統(tǒng)學(xué)研究

李超, 索棟, 楊承忠*, 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動物生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401331)

兩極蟲屬M(fèi)yxidium和楚克拉蟲屬Zschokklella在形態(tài)上非常相似，形態(tài)鑒定界限模糊。為進(jìn)一步厘清兩者的分類學(xué)關(guān)系，本研究對采自涪江重慶市潼南縣江段的楔形兩極蟲M.cuneiformeFujita，1924進(jìn)行了形態(tài)學(xué)重描述，并對其分子系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行了研究。楔形兩極蟲孢子殼面觀呈長條形，中部稍凹陷或孢子一邊突出，殼瓣上有6～8條與縫嵴平行的條紋；縫嵴直，縫面觀呈梭形。孢子長12.5 μm±0.3 μm，寬5.4 μm±0.3 μm(n=20)。極囊2個，呈梨形，分布于孢子兩極端；極囊長4.3 μm±0.2 μm，寬3.1 μm±0.2 μm(n=20)，極絲細(xì)長且明顯，盤曲5～6圈。以18S rDNA為分子標(biāo)記，對楔形兩極蟲及其近緣種進(jìn)行了保守區(qū)變異、遺傳距離、序列相似度和分子系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明：兩極蟲屬和楚克拉蟲屬均非單系發(fā)生，兩屬間物種相互交叉聚支；兩極蟲屬與楚克拉蟲屬物種間具有很近的親緣關(guān)系。本文基于形態(tài)和分子數(shù)據(jù)的研究結(jié)果支持將兩極蟲屬和楚克拉蟲屬合并為一個屬的觀點(diǎn)。

楔形兩極蟲；近緣種；18S rDNA；分子系統(tǒng)學(xué)

Bütschli(1882)從淡水的白斑狗魚Esoxlucius膀胱中檢獲并報道李氏兩極蟲Myxidiumlieberkuehni，從而建立了兩極蟲屬M(fèi)yxidium。兩極蟲孢子一般是紡錘形、直線形或新月形，甚至是S形，末端稍尖；殼瓣表面光滑或具條紋，孢子縫線直，極囊梨形，位于孢子的兩極端，極絲細(xì)長，極絲在極囊內(nèi)橫向盤曲；孢子質(zhì)位于兩極囊之間(Lom & Dyková，2006)。迄今，該屬已記述232種，是粘孢子蟲中繼碘泡蟲屬M(fèi)yxobolusBütschli，1882之后最大的一屬(Eirasetal.，2011)。其主要營腔寄生，少數(shù)可行組織寄生。兩極蟲多寄生于海、淡水魚類，兩棲動物、爬行動物和哺乳動物則鮮有報道(宋微波等，2003；Canning & Okamura，2004；Prunescuetal.，2007)。

因技術(shù)條件限制，過去兩極蟲的分類鑒定主要以成熟孢子的形態(tài)特征作為依據(jù)。但是，粘孢子蟲種類繁多，種間相似度高，加之在形態(tài)判定上主觀因素的干擾，其分類及系統(tǒng)地位研究雖歷史悠久但混亂較多。兩極蟲屬、楚克拉蟲屬Zschokklella和弧形蟲屬Sphaeromyxa物種形態(tài)較為相似，其中，兩極蟲與楚克拉蟲形態(tài)尤為相似，用于物種鑒定的形態(tài)特征常常不能將兩者有效區(qū)分，這點(diǎn)已有學(xué)者對其提出了不同的看法(Diamantetal.，1994；Whipps & Zhao，2015)。

18S rDNA分布于所有的細(xì)胞生物體內(nèi)，并且具有相對緩慢的進(jìn)化歷程。其中，保守區(qū)可用于構(gòu)建所有生命的進(jìn)化樹，而變異區(qū)可用來區(qū)分屬或者種。18S rDNA長度適中，通常為1 200～1 900 bp，其信息量充足，但又不過長且容易獲得。因此，在不同物種的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。以18S rDNA為分子標(biāo)記，學(xué)者們對包括粘孢子蟲在內(nèi)的低等動物的分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)問題進(jìn)行了大量研究，解決了許多懸疑問題(Wrightetal.，1997；Kentetal.，2001；鐘霞等，2007；Zhaoetal.，2013)。眾多研究表明，18S rDNA是一種粘孢子蟲等低等動物分類和系統(tǒng)發(fā)生研究的良好分子標(biāo)記(Micheletal.，2003；魯義善，聶品，2004；Lom & Dyková，2006；Barto?ováetal.，2009)。

本研究在對采自涪江重慶市潼南縣江段的楔形兩極蟲MyxidiumcuneiformeFujita，1924進(jìn)行形態(tài)學(xué)重描述的基礎(chǔ)上，利用18S rDNA為分子標(biāo)記對其分子系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步厘清兩極蟲與楚克拉蟲的分類學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與蟲種鑒定

宿主鯉Cypyinuscarpio于2008年11月采自涪江重慶市潼南縣江段。20條魚體中12條被感染粘孢子蟲，感染率為60%。寄生粘孢子蟲(楔形兩極蟲)標(biāo)本的檢獲、觀察、處理、測量、鑒定方法及相關(guān)術(shù)語參照趙元莙等(2001)完成。

1.2 DNA的提取、擴(kuò)增和測序

1.2.1 DNA的提取 從鯉膽囊獲得游離的粘孢子蟲經(jīng)沖洗收集、離心富集，DNA提取前采用低速離心的方法，用滅菌蒸餾水清洗懸浮液2～3次以除去雜質(zhì)。DNA抽提采用Dneasy Tissue Kit(QIAGEN)試劑盒，操作步驟均按照廠家提供的說明書進(jìn)行。提取的基因組DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA擴(kuò)增和測序 選取粘孢子蟲通用擴(kuò)增引物：ERIB1(5’-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3’)和ERIB10(5’-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-3’)(Ba-rtaetal.，1997)，對樣本進(jìn)行18S rDNA擴(kuò)增。50 μL的PCR反應(yīng)體系包括5 μL 10×Ex Taq buffer，40 μmol·L-1dNTPs，20 μmol·L-1引物各1 μL，100 ng的模板DNA，1.5 μL Ex Taq酶(5 U·μL-1)(TaKaRa)，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至終體積50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min，反應(yīng)完成后12 ℃保溫。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit(OMEGA)進(jìn)行純化回收。最后將純化產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序(測序儀為ABI，3730XL)。

1.3 序列選取和系統(tǒng)分析

將本研究的楔形兩極蟲重慶種群18S rDNA片段在GenBank中通過BLAST進(jìn)行序列同源性比對。根據(jù)比對結(jié)果，選取同源性較高的序列以及其他相關(guān)類群的11條DNA序列(表1)，序列所涉及物種有兩極蟲屬、楚克拉蟲屬、弧形蟲屬和鼩粘蟲屬Soricimyxum等4個屬的種類，另選取鮭四囊蟲Tetracapusuloidesbryosalmonae作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過Clustal W程序按照缺省參數(shù)進(jìn)行序列多重比對，采用PAUP 4.0(Swofford，2001)基于GTR模型按照缺省參數(shù)完成最大似然(ML)系統(tǒng)樹的構(gòu)建，ML樹運(yùn)算100代。貝葉斯(BI)樹通過MrBayes3.0b4(Ronquist & Huelsenbeck，2003)基于GTR模型構(gòu)建而成，BI樹運(yùn)算1 000 000代，由Treeview32和Photoshop完成系統(tǒng)樹的繪制。

表1 粘孢子蟲種GenBank登錄號

對所選序列兩兩之間的遺傳距離利用MEGA6.0(Tamuraetal.，2013)進(jìn)行計算。所選粘孢子蟲之間的相似度用GenBank的BLAST(bl2seq)工具計算獲得。變異位點(diǎn)分析與GC含量的計算借助Bioedit和MEGA 6.0完成。

2 結(jié)果

2.1 楔形兩極蟲重慶種群的形態(tài)學(xué)重描述

楔形兩極蟲孢子殼面觀長條形，中部稍凹陷或孢子一邊突出，一邊稍凹；殼瓣上有6～8條與縫嵴平行的條紋?？p嵴直，縫面觀呈梭形。極囊2個，呈梨形，分布于孢子兩極端；極絲細(xì)長且明顯，盤曲5～6圈。孢子量度(n=20)為：孢子長12.5 μm±0.3 μm(12.0～13.1 μm),孢子寬5.4 μm±0.3 μm(4.8～6.1 μm)，極囊長4.3 μm±0.2 μm(4.0～4.6 μm)，極囊寬3.1 μm±0.2 μm(2.6～3.4 μm)(圖1)。

2.2 楔形兩極蟲18S rDNA分子特征及其系統(tǒng)發(fā)生

本研究所得到的楔形兩極蟲18S rDNA部分序列片段長度為1 622 nt。楔形兩極蟲重慶種群比武漢種群GC含量略低(46.58% vs.46.97%)。楔形兩極蟲的18S rDNA經(jīng)BLAST比對的結(jié)果顯示，在可比范圍內(nèi)，本研究的楔形兩極蟲重慶種群與武漢種群(Fiala，2006)相似度高達(dá)99%。本種群與鲇楚克拉蟲Zschokklellaparasiluri、新楚克拉蟲Z.nova以及鮭兩極蟲M.truttae的相似度為91%、90%、90%。本研究對序列相似度最高的2條序列，即楔形兩極蟲武漢種群和重慶種群進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明武漢種群和重慶種群共有8個變異位點(diǎn)(圖2)。

圖1 楔形兩極蟲重慶種群孢子形態(tài)圖

A.殼面觀 front view, B.縫面觀 lateral view.

圖2 楔形兩極蟲重慶種群與武漢種群變異位點(diǎn)分析

基于18S rDNA序列片段的遺傳距離分析表明，本研究的楔形兩極蟲重慶種群與武漢種群的遺傳距離為0.001，楔形兩極蟲重慶種群與鮭兩極蟲之間的遺傳距離為0.046，楔形兩極蟲重慶種群和新楚克拉蟲之間的遺傳距離為0.046，鮭兩極蟲和新楚克拉蟲之間的遺傳距離為0.006(表2)。

利用ML和BI法分別構(gòu)建了楔形兩極蟲及其相關(guān)種的18S rDNA系統(tǒng)樹，兩者呈一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖3)。粘孢子蟲首先聚類為兩大支系，即海水支系(圖3，B支)和淡水支系(圖3，A支)。海水支系由海水兩極蟲(M.bergense、M.laticurvum)組成，而淡水支系則由兩極蟲、弧形蟲、楚克拉蟲和肝鼩粘蟲Soricimyxumfegati組成。兩極蟲屬和楚克拉蟲屬均非單系發(fā)生，兩屬間物種相互交叉聚支(圖3)。本研究得到的楔形兩極蟲位于淡水支系，其首先和楔形兩極蟲武漢種群聚在一起，且顯示兩者具有較高支持率(PP=1.00，BS=100)支持的同源性，它們形成的一支與鲇楚克拉蟲Z.parasilui形成姐妹群關(guān)系，弧形蟲支則位于淡水兩極蟲-楚克拉蟲支系的基部。

表2 12種粘孢子蟲基于18S rDNA序列的相似度和遺傳距離

注Notes： 1.MyxidiumcuneiformeCQ, 2.M.bergense, 3.M.chelonarum, 4.M.cuneiformeWH, 5.M.laticurvum, 6.M.truttae, 7.Soricimyxumfegati, 8.Sphaeromyxahellandi, 9.S.zaharoni, 10.Zschokkellanova, 11.Z.parasiluri, 12.Z.soleae.

圖3 利用ML/BI(最大似然法/貝葉斯法) 基于18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

A為淡水支, B為海水支。

A.Fresh water clade, B.Marine clade.

通過分析得到該12條序列共有保守區(qū)33個，較淡水種類而言，海水兩極蟲整體上具有更多的變異位點(diǎn)，弧形蟲的變異位點(diǎn)個數(shù)介于海水兩極蟲和淡水種類之間，肝鼩粘蟲序列保守區(qū)更相似于淡水兩極蟲(圖4)。

3 討論

楔形兩極蟲在日本從鯉膽囊中檢獲并首次描述(Fujita，1924)，隨后，在前蘇聯(lián)，日本和中國的遼寧、杭州西湖、四川、重慶、湖北武漢等地都有過相關(guān)報道(陳啟鎏,馬成倫，1998)。本研究從鯉膽囊中檢獲兩極蟲，用20個樣品進(jìn)行了形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的測量，采用統(tǒng)計學(xué)方法對各種形態(tài)特征進(jìn)行描述，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)與楔形兩極蟲源報道種群(Fujita，1924)所描述的形態(tài)特征基本一致，但孢子和極囊大小與原始描述略有差異(表3)，同時與《中國動物志》(陳啟鎏，馬成倫,1998)記載描述種群相比較，整體偏小(表3)。這可能與宿主種類和地理分布等有關(guān)。然而比較遺憾的是，除本研究外，唯一公布有18S rDNA分子數(shù)據(jù)的楔形兩極蟲報道卻未給出其形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，因此不能與該種群進(jìn)行形態(tài)比較。本研究綜合了該物種的形態(tài)和分子數(shù)據(jù)，補(bǔ)充和豐富了粘孢子蟲物種基礎(chǔ)資料。

較保守序列的變異位點(diǎn)的個數(shù)可以反映生物體之間的關(guān)系，變異位點(diǎn)越少，2種生物體之間的親緣關(guān)系可能越近，反之亦然。序列變異位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，在1 622 nt長度的18S rDNA序列上，本研究所得的楔形兩極蟲重慶種群與武漢種群之間共有8個變異位點(diǎn)，其主要表現(xiàn)為堿基的缺失，如在531位點(diǎn)、570位點(diǎn)、771位點(diǎn)、1281位點(diǎn)、1282位點(diǎn)、1283位點(diǎn)分別缺失1個堿基。據(jù)Zhao等(2013)對粘孢子蟲18S rDNA序列的分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)，本研究所得的粘孢子蟲應(yīng)為楔形兩極蟲，這從分子水平進(jìn)一步驗(yàn)證了從形態(tài)上對該種鑒定的準(zhǔn)確性。

冉佼等(2014)基于18S rDNA為分子標(biāo)記的遺傳距離的粘孢子蟲分類研究認(rèn)為，種內(nèi)水平的遺傳距離范圍為0～0.042，其中大部分物種的遺傳距離集中在0～0.007范圍內(nèi)；種間水平的遺傳距離范圍為0.010～0.323，其中大多數(shù)物種的遺傳距離集中在0.135 2～0.260 4范圍內(nèi)；屬間水平的遺傳距離范圍為0.105～0.296，其中大多數(shù)物種的遺傳距離集中在0.181 4～0.257 8范圍內(nèi)。本研究中，選取與楔形兩極蟲重慶種群相似度最高的11種粘孢子蟲進(jìn)行18S rDNA遺傳距離計算，結(jié)果顯示：本研究得到的楔形兩極蟲重慶種群與武漢種群之間的遺傳距離為0.001，為種內(nèi)遺傳水平(Zhaoetal.，2013；冉佼等，2014)，進(jìn)一步證實(shí)了本研究所得物種為楔形兩極蟲。同時，序列相似度的分析得到了同樣的結(jié)論。

本研究所選取的11種粘孢子蟲利用BI/ML法構(gòu)建的系統(tǒng)樹一致顯示，來自海水呈單系發(fā)生的弧形蟲卻位于淡水支(兩極蟲-楚克拉蟲)的基部，這表明弧形蟲與淡水兩極蟲有較近的親緣關(guān)系。同時，保守區(qū)變異位點(diǎn)分析顯示，弧形蟲的序列差異整體上介于海水兩極蟲和淡水兩極蟲之間?；⌒蜗x宿主大多生活于海洋性環(huán)境，其中一些有洄游習(xí)性(如Sphaeroxyumhellandi的宿主黑線鱈Melanogrammusaeglefinus)，這可能對弧形蟲在海-淡水中的演化有重要影響。這些表明，弧形蟲在兩極蟲類群中地位較為特殊，其物種的形成與分化規(guī)律有待今后深入研究。18S rDNA保守區(qū)的變異位點(diǎn)分析(圖4)和系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)同時表明，陸生哺乳動物肝臟寄生的肝鼩粘蟲與淡水粘孢子蟲具有更近的親緣關(guān)系，這與前人的研究結(jié)果一致(Dykováetal.，2007)，這可能與其宿主鼩鼱Sorexaraneus淡水飲水環(huán)境(Michielsen，1966)有關(guān)。

目前，粘孢子蟲基于分子數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與依據(jù)孢子形態(tài)的分類具有很多差異(張婧等，2015a，2015b)。根據(jù)兩極蟲與楚克拉蟲形態(tài)的相似性和差異性，前人把兩者歸入兩極科下的2個平行屬(陳啟鎏，馬成倫，1998；Lom & Dyková，2006)。然而，兩屬間諸多分類學(xué)特征卻甚為模糊，如兩極蟲縫線多為直線形，楚克拉蟲縫線彎曲成“S”形，兩極蟲屬的極囊多為梨形，楚克拉蟲屬的極囊多近似圓形。但是，依據(jù)這些特征并不能解決其所有的形態(tài)分類問題，如當(dāng)極囊既不是嚴(yán)格的梨形也不是嚴(yán)格的圓形時，極囊形態(tài)作為一種分類依據(jù)就顯得很混亂。類似這樣的鑒別性描述還有很多，如極囊開口方向，縫線形狀等。但系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這2屬的物種相互交叉聚支(圖3)，并不能將兩者有效地分開。同時，淡水支系的兩極蟲與楚克拉蟲在保守區(qū)的變異位點(diǎn)上也顯示出其較近的親緣關(guān)系(圖4)?；谝陨闲螒B(tài)和分子數(shù)據(jù)的比較研究，本研究支持Diamant等(1994)將兩極蟲屬和楚克拉蟲屬合并為1個屬的觀點(diǎn)。

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Redescription ofMyxidiumcuneiformeFujita, 1924 (Myxosporea： Bivalvulida) and Molecular Phylogeny with its Relative Species

LI Chao, SUO Dong, YANG Chengzhong*, ZHAO Yuanjun

(Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

The species identification betweenMyxidiumandZschokklellais difficult due to their similar morphology and vague boundaries.To clarify the taxonomic relationship of the two genera, the morphology ofMyxidiumcuneiformeFujita，1924 collected from the Fujiang River in Tongnan county, Chongqing, China was redescribed.Subsequently, molecular phylogeny was analyzed along with the relative species.The mature spore ofM.cuneiformewas elongated in valvular view with the middle part concaved slightly.The surface of each valve had 6～8 longitudinal grooves.The suture line was straight, and spore was fusiform in sutural view.The spore was 12.5 μm±0.3 μm long and 5.4 μm±0.3 μm wide (n=20), each with two polar capsules posited at the both end of the spore.The two polar capsules were pyriform with equal size of 4.3 μm±0.2 μm long and 3.1 μm±0.2 μm wide (n=20), containing polar filaments coiled 5～6 turns.Analyses of the variation of conserved regions, genetic distances, sequence similarities and molecular phylogeny based on 18S rDNA sequences indicated that,MyxidiumandZschokkellawere not monophyletic, as they clustered together with each other in the phylogenetic analysis.Therefore,MyxidiumandZschokkellahad a very close genetic relationship.The results from the morphological and molecular data supported the proposal thatMyxidiumandZschokkellashould be assigned to one single genus.

Myxidiumcuneiforme; relative species; 18S rDNA; molecular phylogeny

2015-11-06 接受日期：2016-01-15 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31471980, No.31501845); 重慶市科委基金項(xiàng)目(No.cstc2014jcyjA80014); 重慶市教委科技項(xiàng)目(KJ1400502)

李超(1989—), 男, 碩士研究生, 研究方向?yàn)榧纳x進(jìn)化生態(tài)學(xué), E-mail：1027276898@qq.com

*通信作者Corresponding author，E-mail：drczyang@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20150350

Q959.115

A

1000-7083(2016)03-0384-07