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    吉林人參低聚肽對(duì)糖尿病大鼠的降血糖作用研究

    2016-12-09 08:05:26毛瑞雪王軍波
    關(guān)鍵詞:胰島素血糖糖尿病

    孫 彬,李 迪,毛瑞雪,李 慧,王軍波,李 勇

    (北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 100191)

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    吉林人參低聚肽對(duì)糖尿病大鼠的降血糖作用研究

    孫 彬,李 迪,毛瑞雪,李 慧,王軍波,李 勇

    (北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 100191)

    目的:研究吉林人參低聚肽(GOP)對(duì)正常大鼠和糖尿病大鼠的血糖調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。方法:正常大鼠降血糖實(shí)驗(yàn):選取雄性SD大鼠30只,根據(jù)空腹血糖值隨機(jī)分為空白對(duì)照組和GOP組,GOP組以灌胃的方式給予0.25g/kg bw的人參肽溶液、空白對(duì)照組給予等劑量的蒸餾水,連續(xù)灌胃30d,測(cè)定空腹血糖水平。糖尿病模型大鼠降血糖實(shí)驗(yàn):采用高熱能飼料聯(lián)合小劑量四氧嘧啶建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型,雄性SD大鼠135只,根據(jù)空腹血糖水平隨機(jī)分為9組:空白對(duì)照組、糖尿病模型組(HGC)、乳清蛋白組(WPC),0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g/kg bw GOP組。GOP組以灌胃方式給予不同劑量的GOP溶液、WPC組給予0.25g/kg bw的乳清蛋白溶液、HGC和空白對(duì)照組給予等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間HGC組、WPC組和GOP各組飼喂高熱能飼料,空白對(duì)照組使用基礎(chǔ)鼠料。連續(xù)灌胃28d,HGC組、WPC組和GOP各組給予四氧嘧啶103~105mg/kg bw腹腔注射,空白對(duì)照組注射等體積生理鹽水。5d后進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT),測(cè)定胰島素水平、糖化血清蛋白、膽固醇等指標(biāo)。結(jié)果:正常大鼠降血糖實(shí)驗(yàn):空白對(duì)照組和GOP組空腹血糖水平?jīng)]有顯著差異。糖尿病大鼠降血糖實(shí)驗(yàn):與HGC組比較,GOP 0.0625、0.125、0.25g/kg bw組和WPC組大鼠空腹胰島素、糖化血清蛋白、總膽固醇、甘油三酯、OGTT實(shí)驗(yàn)0.5h血糖和血糖曲線下面積明顯降低。結(jié)論:GOP對(duì)正常大鼠空腹血糖沒(méi)有影響,而對(duì)高熱能飼料聯(lián)合小劑量四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂具有明顯的改善作用。

    吉林人參低聚肽;糖尿??;口服葡萄糖耐量試驗(yàn)

    糖尿病(Diabetes)是一組以高血糖為特征,由體內(nèi)胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足而引起以糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂為主的內(nèi)分泌疾病。人參是五加科人參屬植物人參(Panaxginseng)的根,據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載,人參“主補(bǔ)五臟、安精神、安魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心益智,久服輕身延年”。中醫(yī)認(rèn)為,人參能夠治療“消渴癥”,國(guó)內(nèi)曾有人用人參復(fù)方治療糖尿病,取得了較好的療效。低聚肽是指由10個(gè)或10個(gè)以下氨基酸組成的小分子肽,在人體內(nèi)不需消化可直接吸收,比單個(gè)氨基酸的吸收更有效率,能夠直接參與蛋白質(zhì)的合成,提高機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的利用率[1]。目前針對(duì)人參低聚肽的研究相對(duì)較少,本課題組之前的研究證明人參低聚肽具有抗疲勞[2]、改善免疫調(diào)節(jié)[3]、增強(qiáng)性功能[4]等作用,但其適宜劑量及作用機(jī)制尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)在高熱能飼料喂飼的基礎(chǔ)上以小劑量四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠采用不同劑量的吉林人參低聚肽水溶液進(jìn)行干預(yù),觀察吉林人參低聚肽的降血糖效果,探尋其發(fā)揮作用的最佳劑量。

    1 材料與方法

    1.1 樣品

    吉林人參低聚肽,由吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司提供,淡黃色固體粉末,利用生物酶解技術(shù)從吉林人參中得到的小分子生物活性肽的混合物。經(jīng)過(guò)高效液相色譜純化后,利用質(zhì)譜儀分析,混合物中小分子低聚肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占95.42%。進(jìn)一步利用高效液相色譜法分析,可知游離氨基酸總量占3.94%,其中精氨酸、脯氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸居多(表1)。

    表1 吉林人參低聚肽氨基酸成分表

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    1.2.1 正常動(dòng)物降血糖實(shí)驗(yàn) 健康SPF級(jí)SD雄性大鼠,6w齡,體重160~200g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供。分籠飼養(yǎng),每籠5只。飼養(yǎng)環(huán)境符合國(guó)標(biāo)清潔級(jí),溫度范圍25±1℃,相對(duì)濕度50%~60% RH。

    1.2.2 糖尿病模型動(dòng)物降血糖實(shí)驗(yàn) 健康SPF級(jí)SD雄性大鼠135只,5w齡,體重130~170g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供。分籠飼養(yǎng),每籠5只。飼養(yǎng)環(huán)境符合國(guó)標(biāo)清潔級(jí),溫度范圍25±1℃,相對(duì)濕度50%~60% RH。

    1.3 主要試劑和儀器

    1.3.1 飼料 豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持料52.6%添加劑0.5%、熱量3 600kcal/kg,營(yíng)養(yǎng)成分滿足大鼠基本要求,由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

    1.3.2 試劑 胰島素(INS)放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)、糖化血清蛋白(GSP)檢測(cè)試劑盒(浙江新昌康特生物科技有限公司)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)試劑盒(英科新創(chuàng)科技有限公司)、C06三諾安穩(wěn)血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司)、四氧嘧啶(美國(guó)Sigma公司)。

    1.3.3 儀器 奧林巴斯株式會(huì)社全自動(dòng)生化儀AU400(日本)、西安核儀器廠γ放射免疫計(jì)數(shù)器XH-6080(西安)、三諾安穩(wěn)血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 正常動(dòng)物降血糖實(shí)驗(yàn) 健康SPF級(jí)SD雄性大鼠30只,維持飼料喂養(yǎng)3d,禁食3~5h,尾靜脈采血,使用血糖儀測(cè)量空腹血糖水平,以血糖水平隨機(jī)分為2組:空白對(duì)照組和人參肽干預(yù)組。空白對(duì)照組給蒸餾水灌胃,人參肽干預(yù)組以0.25g/kg BW人參肽溶液灌胃。各組小鼠均給予普通飼料,自由飲食、飲水。每天灌胃1次,連續(xù)灌胃30d。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)標(biāo)清潔級(jí),溫度范圍25±1℃,相對(duì)濕度50%~60%,室內(nèi)照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。

    1.4.2 糖尿病模型動(dòng)物降血糖實(shí)驗(yàn) 5w齡健康SPF級(jí)SD雄性大鼠135只,體重130~170g,維持料適應(yīng)飼養(yǎng)3d,禁食3~4h,尾靜脈采血,使用血糖儀測(cè)定給葡萄糖前(即0h)血糖值,經(jīng)口給予2.5g/kg BW葡萄糖溶液,測(cè)量記錄給葡萄糖后0.5、2h血糖值,作為該批次動(dòng)物基礎(chǔ)值。以0、0.5h血糖水平隨機(jī)分為9個(gè)組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、乳清蛋白組(0.25 g/kg)和0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0g/kg GOP組,每組15只??瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組以蒸餾水灌胃,其余各組灌胃相應(yīng)濃度的乳清蛋白及GOP水溶液。每天灌胃1次,連續(xù)灌胃33d??瞻讓?duì)照組給予普通維持飼料,其余各組給予高熱能飼料,自由飲食、飲水。GOP干預(yù)28d后,模型對(duì)照組、6個(gè)GOP組和乳清蛋白組禁食24h,給予四氧嘧啶103~105mg/kg BW腹腔注射,注射量1mL/100g體重。注射后繼續(xù)給予高熱能飼料喂飼5d。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)標(biāo)清潔級(jí),溫度范圍(25±1)℃,相對(duì)濕度50%~60%,室內(nèi)照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。

    1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

    1.5.1 正常動(dòng)物降血糖實(shí)驗(yàn) 分組連續(xù)灌胃30d后,禁食3~5h,尾靜脈采血,使用血糖儀測(cè)空腹血糖值。

    1.5.2 糖尿病模型動(dòng)物降血糖實(shí)驗(yàn) 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT):于GOP干預(yù)33d后,各組動(dòng)物禁食3~4h,尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖,即給葡萄糖前(0h)血糖值,劑量組給予不同濃度GOP,模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水,空白對(duì)照組不做處理,15~20min后各組經(jīng)口給予葡萄糖2.5g/kg BW,測(cè)定給葡萄糖后0.5、2h的血糖值。觀察各組各組給葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)血糖曲線下面積(AUC)的變化,血糖曲線下面積計(jì)算如(1)式:

    AUC=0.25×(0h血糖+4×0.5h血糖+3×2h血糖)

    (1)

    糖化血清蛋白、胰島素、血脂檢測(cè):于GOP干預(yù)33d后,空腹采血,分離血清,用全自動(dòng)生化儀分別檢測(cè)血清糖化血清蛋白、TC、TG,采用放射免疫法檢測(cè)血清胰島素(INS)含量。

    1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

    數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,差異顯著者進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GOP對(duì)正常大鼠空腹血糖的影響

    由表2可知,空白對(duì)照組和GOP組大鼠初始空腹血糖、終末空腹血糖和血糖變化率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

    表2 GOP對(duì)正常大鼠空腹血糖的影響

    2.2 GOP對(duì)糖尿病模型大鼠的影響

    2.2.1 GOP對(duì)糖尿病模型大鼠糖耐量的影響 OGTT結(jié)果顯示,GOP 0.0625、0.125和0.25g/kg bw組大鼠給予葡萄糖后0.5h血糖明顯低于HGC組,血糖曲線下面積明顯低于HGC組(P<0.05)(表3)。

    表3 GOP對(duì)糖尿病大鼠血糖和血糖曲線下面積的影響單位:mmol/L

    2.2.2 GOP對(duì)糖尿病模型大鼠胰島素、糖化血清蛋白和血脂水平的影響 高熱能飼料飼養(yǎng)33d后,HGC組和GOP 2.0g/kg bw大鼠INS、GSP、TC和TG水平顯著高于NC組(P<0.05);GOP 0.125g/kg bw組INS、GSP、TC水平顯著低于HGC組(P<0.05);GOP 0.25g/kg bw組INS、GSP、TC和TG水平均顯著低于HGC組(P<0.05)(表4)。

    表4 GOP對(duì)糖尿病大鼠胰島素、糖化血清蛋白、甘油三酯、膽固醇的影響

    3 討論

    根據(jù)IDF于2015發(fā)布的第七版糖尿病地圖,全球約有4.15億人患有糖尿病,其中約有46.5%未被確診。而按照近年的趨勢(shì),IDF推測(cè)2040年全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到6.42億[5],是嚴(yán)重危害社會(huì)和人類健康的慢性疾病之一。

    研究結(jié)果表明,人參具有良好的降血糖作用。在尚文斌[6]等的研究中,人參可能通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化,增加胰島素敏感性和抑制基礎(chǔ)脂分解達(dá)到降糖作用。張南[7]等的研究也發(fā)現(xiàn),人參與刺加五配伍提取物可能通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌、改善機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性、提高機(jī)體的抗氧化能力等途徑改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖狀況。1995年,芬蘭Sotaniemi[8]等隨機(jī)選擇36名新確診的2型糖尿病患者,分別給予100~200mg/d和安慰劑,結(jié)果顯示,服用人參的糖尿病患者心情愉悅,精神飽滿,空腹血糖明顯降低。人參中人參多肽具有一定的降血糖作用,可對(duì)腎上腺、四氧嘧啶和葡萄糖所引起的高血糖有一定的抑制作用,并能增強(qiáng)腎上腺素對(duì)肝糖原的分解[9]。

    生物活性肽又稱功能肽,是指對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的一類肽化合物。研究發(fā)現(xiàn),小分子的低聚肽是蛋白質(zhì)吸收的主要形式之一,可不經(jīng)消化直接在胃內(nèi)吸收,提高了機(jī)體利用蛋白質(zhì)的能力。一些已有的研究表明,生物活性肽具對(duì)糖尿病具有一定的改善作用[10]。在王軍波[11]等的研究中,海洋膠原肽(marine collagen peptides,MCPs)能夠緩解高胰島素血癥大鼠的胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷,使分泌顆粒增加,脂滴減少,提高胰島素的生物學(xué)活性;顯著降低的空腹胰島素水平,對(duì)空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作用。黃鳳杰[12,13]等研究提示,鯊魚肝活性肽S-8300有助于清除脂質(zhì)過(guò)氧化物和自由基,提高機(jī)體的抗氧化能力,減輕自由基對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷,改善血糖,調(diào)節(jié)糖脂代謝,減輕脂毒性,延緩胰島β細(xì)胞的衰竭,具有一定的治療糖尿病的作用。

    有研究顯示,高脂飲食導(dǎo)致大鼠骨骼肌葡萄糖攝入減少,減弱胰島素抑制肝糖原輸出能力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在基礎(chǔ)飼料中添加豬油、蛋黃粉,以此飼料喂養(yǎng)33d后,HGC組與NC組相比,血糖曲線下面積(AUC)有所升高,且差異具有顯著性,根據(jù)2012年印發(fā)的《輔助降血糖功能評(píng)價(jià)方法》,可判定建立的糖尿病大鼠模型成立,說(shuō)明HGC出現(xiàn)INS升高并伴有糖/脂代謝紊亂,出現(xiàn)明顯的糖耐量損傷。通過(guò)人參肽干預(yù),GOP 0.0625、0.125、0.25g/kg bw組和WPC組大鼠空腹血糖值與HGC組相比無(wú)明顯差異,給葡萄糖后0.5h血糖值和AUC明顯降低,GSP、INS、TC、TG明顯降低,并隨干預(yù)劑量上升,各項(xiàng)指標(biāo)下降效果越明顯。這一結(jié)果可能與人參肽中富含精氨酸相關(guān),研究顯示,精氨酸能有效改善胰島素抵抗及血脂代謝紊亂。在GOP 0.5、1.0和2.0g/kg bw組中無(wú)法得到降血糖、血脂的效果或效果不顯著。

    綜上所述,吉林人參低聚肽可能通過(guò)保護(hù)胰島β細(xì)胞,提高胰島素敏感性,調(diào)節(jié)糖脂代謝,抑制餐后血糖的上升,降低血糖曲線下面積,達(dá)到降血糖的作用。對(duì)于大鼠而言,人參肽發(fā)揮降血糖作用較適宜為0.125~0.25g/kg bw。◇

    [1]李勇.肽臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)[M].北京大學(xué)出版社,2012:1-3.

    [2]鮑雷,等.吉林人參低聚肽抗疲勞作用[J].科技導(dǎo)報(bào),2015,13:56-60.

    [3]何麗霞,劉睿,任金威,等.吉林人參低聚肽的免疫調(diào)節(jié)作用[J].科技導(dǎo)報(bào),2015,18:62-67.

    [4]鮑雷,王軍波,張遠(yuǎn),等.吉林人參低聚肽對(duì)雄性小鼠性功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2015,10:757-760.

    [5]IDF Diabetes Atlas 7ed[R].IDF,2015:1-3.

    [6]尚文斌,等.人參皂甙Rb_1促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化并抑制脂解[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2007,3:258-263.

    [7]張南,李娜,李佳琳,等.人參、刺五加提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降糖作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,10:1690-1695.

    [8]Sotaniemi,E A Haapakoski,E Rautio,A.Ginseng therapy in non-insulin-dependent diabetic patients[J].Diabetes Care,1995,10(18):1373-1375.

    [9]王本祥,楊明,金玉蓮,等.人參多肽降血糖機(jī)制的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1990,10:727-731.

    [10]李勇,蔡木易.肽營(yíng)養(yǎng)學(xué)[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2012:1-3.

    [11]王軍波,等.海洋膠原肽對(duì)高胰島素血癥模型大鼠糖脂代謝的影響[J].衛(wèi)生研究,2010,2:143-146.

    [12]黃鳳杰,吳梧桐.鯊魚肝活性肽S-8300抗糖尿病與細(xì)胞保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2007,11:1283-1287.

    [13]黃鳳杰,錢璟,吳梧桐.鯊魚肝活性肽S-8300對(duì)糖尿病小鼠受損胰島β細(xì)胞和腎小球細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2007,9:993-997.

    [14]劉慶,等.L-精氨酸對(duì)果糖喂養(yǎng)大鼠血壓及胰島素抵抗影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].武警醫(yī)學(xué),2006,4:260-263.

    (責(zé)任編輯 李婷婷)

    Anti-diabetic Effects of Panax ginseng Oligopeptides in Jilin Province on Diabetes Mice

    SUN Bin,LI Di,MAO Rui-xue,LI Hui,WANG Jun-bo,LI Yong(Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Peking University,Beijing 100191,China)

    【Objective】To investigate the anti-diabetic effects ofPanaxginsengoligopeptides(GOP)and its mechanism in rats.【Method】Normal rats experiment:a total of 30 specific pathogen free(SPF)male SD rats were randomized divided into 2 groups by fasting blood-glucose which were normal control group andPanaxginsengoligopeptides group(GOP).Normal control group rats were given distilled water andPanaxginsengoligopeptides group were given GOP by intragastric way to get fasting blood-glucose.Diabetic rats experiment:rats were induced by high-calorie feed and small doses of alloxan.A total of 135 specific pathogen free(SPF)male SD rats were randomized divided into 9 groups by fasting blood-glucose which were normal control group(NC),high blood glucose group(HGC),whey protein control group(WPC)and 6Panaxginsengoligopeptides groups(GOP).NC used sustaining feed and the others used high calorie feed.Rats inPanaxginsengoligopeptides groups were treated by intragastric way with GOP at the dose of 0.062 5,0.125,0.25,0.25,0.5,1.0 and 2.0g/kg bw,rats in WPC were given whey protein at the dose of 0.25g/kg bw and others were given distilled water respectively for 28 days.We injected alloxan to get diabetic rats and did oral glucose tolerance test(OGTT)5 days later to get the INS,GSP,TG and else.【Result】Normal rats experiment:there was no obvious differences between normal control group andPanaxginsengoligopeptides group(GOP).Diabetic rats experiment:compared with HGC group,AUC,INS,GSP,TC and TG of the 0.062 5,0.125 and 0.25g/kg bw GOP groups and WPC group decreased obviously.【Conclusion】 GOP had no obvious effect on fasting blood-glucose of normal rats,but was effective in improving glucose and lipid metabolism in diabetic rats induced by high-calorie feed.

    Panaxginsengoligopeptide in Jilin province;diabetes;oral glucose tolerance test(OGTT)

    “十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào):2006BAD27B08)。

    孫彬(1989— ),男,碩士,研究方向:營(yíng)養(yǎng)與疾病。

    王軍波(1973— ),男,博士,副教授,研究方向:營(yíng)養(yǎng)與疾病。

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