轉(zhuǎn)基因抗病玉米飼喂Wistar大鼠食用安全性評價

劉 明，李寶健，仇玉蘭，裴秋玲，王景雪

(1 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275；3山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，太原 030001)

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轉(zhuǎn)基因抗病玉米飼喂Wistar大鼠食用安全性評價

劉 明1，李寶健2，仇玉蘭3，裴秋玲3，王景雪1

(1山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275；3山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，太原 030001)

目的：利用不同劑量的轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶基因的轉(zhuǎn)基因抗病玉米粉飼喂Wistar大鼠28d，之后繼續(xù)用相同劑量未轉(zhuǎn)基因的對照玉米飼喂1w。檢測實驗期和恢復(fù)期Wistar大鼠食用轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性。方法：將Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為1個對照組和飼喂轉(zhuǎn)基因玉米低、中、高劑量組等4個組，每組雌雄各半，經(jīng)口28d攝入轉(zhuǎn)基因玉米。飼喂期間對大鼠的一般生活狀況、體重增長進(jìn)行觀察；大鼠飼喂期和停止飼喂后1w，統(tǒng)計其食物利用率；連續(xù)喂飼4w末和停止喂養(yǎng)后1w，對大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢查，同時進(jìn)行解剖學(xué)檢查。結(jié)果：大鼠飼喂轉(zhuǎn)基因玉米后，與對照組比較，一般生活狀況無明顯差異，無任何中毒癥狀出現(xiàn)，全部動物健康存活；與對照組同期同性別的大鼠相比，體重增長未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；大鼠喂飼4w末和停止喂飼后1w食物利用率未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；飼喂轉(zhuǎn)基因玉米期間，大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)/谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等指標(biāo)與同期對照組比較未見顯著差異(P>0.05)；大體解剖肉眼觀察，各臟器顏色形態(tài)未見異常，臟器系數(shù)未見異常。結(jié)論：實驗周期內(nèi)轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因抗病玉米對Wistar大鼠生長發(fā)育無明顯不良影響，轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因抗病玉米及其親本玉米對大鼠具有同等的食用安全性。

轉(zhuǎn)基因玉米；幾丁質(zhì)酶；β-1，3-葡聚糖酶；食用安全性；劑量

我國是世界玉米生產(chǎn)第二大國，但我國每年因病蟲害造成的玉米產(chǎn)量損失約5%～15%，局部地區(qū)病害嚴(yán)重時產(chǎn)量損失可達(dá)到50%～70%以上[1]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高作物抗病、蟲害能力、抗非生物逆境等方面都取得非常大的進(jìn)展，已研發(fā)出的轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑玉米表現(xiàn)出了良好的增產(chǎn)性能。然而，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的食用安全性一直是科學(xué)界、政府和廣大消費(fèi)者關(guān)心的焦點問題，許多國家都投入了大量的人力物力，對轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性進(jìn)行研究[2-4]。有關(guān)國際組織對此也制定了相關(guān)規(guī)定，我國也制定了一系列的政策措施開展對轉(zhuǎn)基因作物的安全管理和監(jiān)督[5-10]。

根據(jù)轉(zhuǎn)基因生物安全性評價的原則，已經(jīng)有一些研究者對轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行了個案評價，如朱亞熙等[11]對轉(zhuǎn)G2-aroA基因耐草甘膦玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米營養(yǎng)成分進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示兩者之間沒有明顯的差異。Han et al.[12]用轉(zhuǎn)Cry1Ah和G2-aroA基因的抗蟲、耐草甘膦玉米飼喂SD大鼠90d，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米在對SD大鼠的食用安全性上沒有顯著差別[12]。朱晗等[13]用轉(zhuǎn)基因玉米Bt-799飼喂Wistar大鼠14w，證明Bt-799玉米對Wistar大鼠生長發(fā)育無明顯不良影響。Appenzeller et al.[14]用轉(zhuǎn)有Cry1F、PAT、Cry34Ab1/Cry35Ab1 和PAT等4種基因的抗蟲玉米飼喂SD大鼠92d，結(jié)果顯示，該轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠的營養(yǎng)性能上沒有明顯差異。本研究以轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3葡聚糖酶基因玉米為實驗材料，以Wistar大鼠為實驗動物，將不同比例的轉(zhuǎn)基因玉米添加到動物飼料中，飼喂大鼠28d，對其食用安全性進(jìn)行研究，以期為該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

本試驗在山西醫(yī)科大學(xué)毒理學(xué)教研室完成。

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 體重180～200g左右的幼齡SPF級健康Wistar大鼠，動檢號：070101，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境為標(biāo)準(zhǔn)的SPF級動物室，飼養(yǎng)條件參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.1.2 轉(zhuǎn)基因玉米及其親本對照玉米 受試轉(zhuǎn)基因玉米為玉米自交系海9-21轉(zhuǎn)入幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶基因，經(jīng)分子檢測和田間抗病實驗，證明是轉(zhuǎn)基因并且具有抗玉米絲黑穗病特性的玉米材料。以親本玉米自交系海9-21作為對照，該玉米自交系為山西、重慶、山東等地推廣種植的多個高產(chǎn)雜交種，如晉單36、太單30、金泰99和登海3337的親本，已被證實可安全食用[16]。轉(zhuǎn)基因玉米和未轉(zhuǎn)基因的親本自交系海9-21均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心提供。

1.1.3 飼料配制 動物標(biāo)準(zhǔn)飼料由中國放射防護(hù)研究院動物中心按試驗動物標(biāo)準(zhǔn)飼料配方制成。

(1)飼料基本配方為：68%標(biāo)準(zhǔn)飼料+32%的玉米粉，其中玉米粉為轉(zhuǎn)基因或未轉(zhuǎn)基因的玉米粉。按照飼料中轉(zhuǎn)基因玉米的加入量將實驗分為：對照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組等4組，其中對照組為68%標(biāo)準(zhǔn)飼料+32%玉米自交系海9-21玉米粉；低劑量組為68%標(biāo)準(zhǔn)飼料+8%轉(zhuǎn)基因玉米粉+24%玉米自交系海9-21玉米粉；中劑量組為68%標(biāo)準(zhǔn)飼料+16%轉(zhuǎn)基因玉米粉+16%玉米自交系海9-21玉米粉；高劑量組為68%標(biāo)準(zhǔn)飼料+32%轉(zhuǎn)基因玉米粉。(2)飼料配制方法：標(biāo)準(zhǔn)飼料和玉米粉均勻混合用水和成小塊狀，干燥箱自然烘干，大鼠自由經(jīng)口攝入，大鼠的飲水方式為自由飲水。各實驗處理飼喂劑量保持一致。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及管理 將受試大鼠按體重隨機(jī)分成4個實驗組，每組20只，雌雄各半，以每籠飼養(yǎng)2只同性大鼠進(jìn)行管理，分別飼喂低劑量、中劑量、高劑量和對照組飼料。動物自由飲食，各實驗組大鼠分別連續(xù)飼喂4w(實驗期)相應(yīng)劑量的飼料，之后各實驗組組隨機(jī)取10只大鼠，進(jìn)行眼眶采血以及常規(guī)病理解剖取材，進(jìn)行相應(yīng)的生理生化分析。剩余10只全部改為飼喂對照飼料，1w(恢復(fù)期)后進(jìn)行相同處理和分析。對照組則一直飼喂對照組飼料。在飼喂大鼠的同時每天觀察大鼠經(jīng)口長期攝入轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶基因玉米后機(jī)體產(chǎn)生的異常反應(yīng)和反應(yīng)的可逆程度。

1.2.2 一般狀況 每日觀察大鼠的外觀、精神、行為、活動、被毛、糞便和飲水等情況。

1.2.3 體重 每周稱量并記錄每只大鼠的體重。

1.2.4 攝入量 每周稱1次體重，記錄食物攝入量，計算每周及總的食物利用率如(1)式。

食物利用率=平均體重增長/平均進(jìn)食量

(1)

1.2.5 血清生化學(xué)檢查 連續(xù)喂飼4w末，每個試驗組隨機(jī)選取10只大鼠，禁食16h后采血，每只大鼠眼眶采血約1mL。停止喂養(yǎng)后1w對剩余10只大鼠采血，處理同前。取樣后，對血液樣品進(jìn)行抗凝處理，分別對2次采取的血液樣品分離血清，并使用日本日立公司生產(chǎn)的7060型自動生化分析儀和北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn)的生化檢驗試劑盒進(jìn)行血清生化學(xué)檢查，檢測項目包括：谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)/谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等指標(biāo)。

1.2.6 大體解剖和臟器稱重 麻醉處死大鼠，肉眼逐一觀察各組織器官，仔細(xì)分離并稱量心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃和腦重量，并與體重進(jìn)行比較，按照(2)式計算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)=臟器重量/體重

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀況

通過觀察大鼠飼喂轉(zhuǎn)基因玉米后其外觀、精神、行為、活動、被毛、糞便和飲水等方面的微小變化，各實驗組動物活動正常，與對照組比較，無明顯差異，也無任何中毒癥狀出現(xiàn)，全部動物健康存活。

2.2 體重增長

各實驗組和對照組的大鼠在實驗期間體重增加比較穩(wěn)定，雄性大鼠體重增幅略高于雌性。對于雄性大鼠，只有在第2w時，各雄性實驗組與雄性對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余各實驗組和對照組同期相比，大鼠體重增長未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。對于雌性大鼠，各實驗組與對照組同期相比，大鼠體重增長均未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖2)。

圖1 雄性大鼠體重變化

圖2 雌性大鼠體重變化

2.3 食物利用率

大鼠連續(xù)喂飼4w末和停止喂養(yǎng)1w后，同期同性別的各實驗組與其對照組相比，總食物利用率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.4 血清生化學(xué)檢查

連續(xù)喂飼4w末和停止喂養(yǎng)后1w，同時期各實驗組分別與對照組相比，血清生化學(xué)檢查的相應(yīng)指標(biāo)也未見顯著差異(P>0.05)(表2)。

2.5 大體解剖肉眼觀

連續(xù)喂飼4w末和停止喂養(yǎng)后1w對實驗組大鼠進(jìn)行解剖，仔細(xì)觀察心、肝、脾等臟器，顏色形態(tài)未見異常。

表1 大鼠食物利用率的比較

2.6 臟器重量

連續(xù)喂飼4w末和停止喂養(yǎng)1w后對實驗組和對照組大鼠進(jìn)行解剖，稱量喂飼前后的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃和腦的重量，與體重進(jìn)行比較。各實驗組與同期對照組相比，各臟器系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)上差異(P>0.05)，臟體比較未見異常(表3)。

表2 大鼠血清生化學(xué)分析

表3 大鼠臟器觀察結(jié)果的比較

3 討論

轉(zhuǎn)基因食品安全性評價包括營養(yǎng)學(xué)及抗?fàn)I養(yǎng)素安全評價、致敏性研究、毒理學(xué)安全評價等[17，18]。本研究所用轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)有幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶基因。幾丁質(zhì)和葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶能特異地催化水解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)和葡聚糖，阻止真菌對植物的入侵，從而起到抗真菌性病害的作用。

研究證實，本研究所用的轉(zhuǎn)基因玉米對真菌引起的玉米絲黑穗病具有良好的抗性。雖然轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶可以提高植物抗真菌病害的能力已經(jīng)是一個不爭的事實[19-21]，但關(guān)于轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性卻鮮有報道[22]。本研究利用轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠進(jìn)行了連續(xù)28d喂養(yǎng)，在飼喂期和停喂1w后，分別對實驗組和對照組大鼠的一般生長狀況、體重增長、食物利用率以及血清生化學(xué)指標(biāo)等進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因的對照組、以及不同劑量組與對照組之間均沒有明顯差異。說明在實驗條件下，轉(zhuǎn)基因玉米以占飼料8%、16%、32%的比例飼喂大鼠28d，在飼喂期間和停喂1w后，轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠未產(chǎn)生毒害作用，表明轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶基因玉米與親本海9-21對Wistar大鼠具有同等食用安全性。

目前，用轉(zhuǎn)基因植物或食品直接喂養(yǎng)實驗動物，以觀察轉(zhuǎn)基因植物或食品的食用安全性，有很多的研究。由于實驗設(shè)計依據(jù)不同，轉(zhuǎn)基因飼料在整個飼料中所占比例差別很大，從5%～90%以上，各不相同[23-25]，本實驗轉(zhuǎn)基因飼料設(shè)置了3個不同的劑量組，8%、16%、32%對大鼠進(jìn)行實驗，未發(fā)現(xiàn)有毒害作用。今后，可以加大轉(zhuǎn)基因玉米在飼料中比例，進(jìn)行進(jìn)一步的實驗，也可以將幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶蛋白提取出來，直接以高出正常攝入量數(shù)十倍或數(shù)百倍的量直接飼喂，進(jìn)行毒性實驗。如Nicola et al.的研究[26]。

鑒于本文所研究的轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性，僅僅是飼喂28d所得的結(jié)果，還需要進(jìn)行更長時間的喂養(yǎng)以進(jìn)行進(jìn)一步的驗證?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Food Safety Evaluation on Transgenic Corn Fed Wistar Rats

LIU Ming1，LI Bao-jian2，QIU Yu-lan3，PEI Qiu-ling3，WANG Jing-xue1

(1School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China；3School of Public Health，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

【Objective】 Wistar rats were fed by transgenic corn expressing chitinase and β-1，3-glucanase gene to study if the transgenic corn possesses potential toxic or adverse effects for rats.The gene type of wild type corn was the inbred line，Hai 9-21.【Method】 Wistar rats were randomly divided into four groups with applied 32% wild type corn flour added 68% normal food(control group)，8% transgenic corn flour added 24% wild type corn flour and added 68% normal food(low dose group)，16% transgenic corn flour added 16% wild type corn flour and added 68% normal food(middle dose group)，32% transgenic corn flour added 68% normal food(high dose group).They were fed for 28 d with low/ middle/ high dose group food and control group food，respectively，in experimental stage.All of the Wistar Rats were fed for 7 d with the control group food in recover stage.During experimental stage and recover stage，the rats’ general living status，body weight and average food utilization rate were observed.At the end of experimental stage and recover stage，the rats’ serum biochemistry index were examined，then the rats were carried on anatomical examination.【Result】Compared with the control group，there were no significant differences between low/ middle/ high dose group and control group about general living status，and without any toxic symptom appears in low/ middle/ high dose group.All of rats were health survival during experimental stage and recover stage .Compared with the control group during the same period of same sex rats，there was no significant difference(P>0.05)about body weight growth in low/ middle/ high dose group.At the end of experimental stage and recover stage，the rats’ food utilization rate had no statistical difference(P>0.05)between low/ middle/ high dose group and control group.During the period of rats fed transgenic corn，compared with the control group，there were no significant differences on amount of AST/ALT，TP，ALB，BUN，AST(P>0.05).With gross anatomy observation，each organ’s color，morphology and weight were normal in all of rats.【Conclusion】Transgenic corn had no adverse effects on rats，and the transgenic corn was same safe as wild type corn at the experiment period.

transgenic maize；chitinase；β-1，3glucanase；food safety；dosage

山西省人事廳人才引進(jìn)與開發(fā)專項資金項目(2007)；太原市科技攻關(guān)項目(2007)。

劉明(1988— )，男，碩士研究生，研究方向：轉(zhuǎn)基因植物生物安全性評價。

王景雪(1961— )，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：作物基因工程。