中藥治療對精子非整倍體率及輔助生殖結(jié)局的影響*

韓臨曉 孫曉巖 陳 博 鄭志濤 鐘秋生 潘瑞華

東莞市第三人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東東莞 523326

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·臨床研究·

中藥治療對精子非整倍體率及輔助生殖結(jié)局的影響*

韓臨曉 孫曉巖 陳 博 鄭志濤 鐘秋生 潘瑞華

東莞市第三人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東東莞 523326

目的 研究中藥治療對少弱畸形精子癥患者的精子染色體非整倍體率及輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)結(jié)局的影響。方法 將58例要求接受ART的少弱畸形精子癥患者隨機分為試驗組和對照組。試驗組26例，采用生精湯治療3個月后進行精子染色體分析，再接受輔助生殖治療；對照組32例，直接進行輔助生殖治療，2組均采用卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)受精方式，觀察2組的受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚胎率、妊娠率及流產(chǎn)率。結(jié)果 治療前，試驗組和對照組的精子非整倍體率分別為2.3%和2.1%，差異無統(tǒng)計學意義。治療后，試驗組經(jīng)復查，精子染色體非整倍體率為1.7%，與治療前相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；試驗組和對照組的受精率分別為82.55%和80.80%，卵裂率分別為99.25%和98.77%，優(yōu)胚率分別為24.91%和24.07%，可用胚胎率分別為76.23%和70.68%，妊娠率分別為57.69%和31.25%，流產(chǎn)率分別為7.70%和12.50%，種植率分別為38.98%和22.20%，其中妊娠率和種植率2組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 中藥治療可降低精子染色體非整倍體率，改善輔助生殖技術的結(jié)局。

中藥；精子染色體；非整倍體；輔助生殖技術；卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射

輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)的應用解決了少弱畸形精子癥患者的生育問題，尤其是卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術的應用，ICSI技術越過受精過程中精子自然選擇的過程，有可能將含有遺傳缺陷的精子注射到卵母細胞內(nèi)。有研究[1-3]表明，需行ICSI治療的嚴重少弱畸形精子癥患者的精子染色體非整倍體率明顯升高。Aytoz[4]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ICSI治療的嚴重少弱畸形精子癥患者，妊娠后胎兒宮內(nèi)死亡率、稽留流產(chǎn)率較精液指標正常人群升高，其子代染色體非整倍體率升高?，F(xiàn)代研究表明中藥治療可改善精液質(zhì)量，其機制有促進睪丸生精功能、減少生精細胞凋亡、上調(diào)生精細胞中抑制凋亡基因Bcl-2的表達等，但中藥治療的同時能否降低精子染色體非整倍體率，目前尚無相關研究報道。本研究旨在探索中藥治療對精子染色體非整倍體率及ART結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2014年9月—2015年2月因男性不育因素來本中心擬行ICSI治療的患者為研究對象，共58例。將患者隨機分為試驗組和對照組。試驗組26例，配偶平均年齡(32.12±1.81)歲。對照組32例，配偶平均年齡(33.22±2.31)歲，2組間一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入標準

患者納入標準如下：①以WHO精液質(zhì)量診斷標準(第5版)為參考，精子濃度<15×106/ml，前向運動精子(PR)<32%，正常形態(tài)精子<4%；②符合腎虛證候表現(xiàn)，如精子數(shù)減少或活力差、精液量較少、伴有腰膝酸軟、頭暈耳鳴、精神疲憊、失眠健忘、舌淡苔白和脈沉細弱等。

排除因染色體異常、生殖道炎癥、性激素異常、生殖道畸形等因素致不孕不育者。

1.3 治療方法

試驗組根據(jù)患者的癥狀與體征辨證用藥，方劑生精湯由淫羊藿18 g，菟絲子12 g，覆盆子12 g，巴戟天12 g，五味子6 g，蛇床子6 g，車前子12 g，枸杞子12 g，石斛6 g，肉蓯蓉10 g，熟地12 g，當歸15 g等組成。水煎服，每日1劑，分早晚2次服用，30 d為1個療程，3個療程后再進行ART。對照組直接進行ART。對試驗組患者的治療前、治療3個療程后精子染色體進行FISH檢測，并比較精子非整倍體率。試驗組與對照組接受ICSI治療后，比較2組患者的受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚胎率、妊娠率、種植率及流產(chǎn)率。

1.4 精子熒光原位雜交(FISH)檢測方法

FISH檢測方法步驟如下：①用密度梯度方法處理所有研究對象的精液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后離心，將精子沉淀，用3∶1甲醇/冰醋酸固定，調(diào)整精子濃度約為5×106/ml，―20 ℃凍存2 h，將精子固定液滴在玻片上風干；②將玻片置于2×檸檬酸鈉緩沖液(SSC)中洗滌2次，3 min/次，1 mol/L NaOH作用4 min，70%、85%、100%乙醇梯度脫水，加入含13、18、21號、X和Y染色體著絲粒探針混合液后，蓋上玻片用膠封口，放入FISH雜交儀72 ℃ 4 min，37 ℃ 16 h后，用0.4×檸檬酸鈉緩沖液/0.3%壬基酚聚氧乙烯醚-40(0.4×SSC/0.3%NP-40)，73 ℃洗脫2 min，再用2.0×SSC/0.1%NP-40洗脫1 min，風干后加入DAPI，10 min后于熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)，每個標本計數(shù)1 000個精子；③熒光信號判讀參照Munne標準，熒光亮度弱的信號不予計數(shù)，因其多為非特異性雜交信號，以1個信號的直徑為1個域，2個同色信號距離很近或成對排列、相距在1個信號直徑以內(nèi)時計為1個信號，因其多為1條染色體的DNA復制形成的姐妹染色單體或信號分裂，當2個信號相距至少2個域以上時，則認為它們是2個不同的信號。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組精子非整倍體率比較

治療前，試驗組和對照組的精子非整倍體率分別為2.3%和2.1%，差異無統(tǒng)計學意義。治療后，試驗組精子染色體非整倍體率為1.7%，比治療前明顯降低(P<0.05)。

2.2 2組ART結(jié)局分析比較

試驗組和對照組的受精率分別為82.55%、80.80%，卵裂率分別為99.25%、98.77%，優(yōu)胚率分別為24.91%、24.07%，可用胚胎率分別為76.23%、70.68%，妊娠率分別為57.69%、31.25%，流產(chǎn)率分別為7.70%、12.50%，種植率分別為38.98%、22.20%。其中妊娠率和種植率2組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組ART結(jié)局分析比較(例，%)

與對照組比較*P<0.05

3 討論

本中心數(shù)據(jù)顯示極度少弱畸形精子癥患者行ICSI治療后受精率、優(yōu)胚率等較常規(guī)體外受精或其他指征ICSI的低，分析原因可能是患者精子染色體非整倍體率高。有學者[5]研究發(fā)現(xiàn)，與生育力和精液各參數(shù)均正常男性相比，畸形精子癥患者18號、X和Y染色體非整倍體率明顯升高。精液各參數(shù)與精子非整體率的相關性爭議較多。Lewis-jones等[6]研究發(fā)現(xiàn)精子畸形與精子染色體異常有關，大頭畸形、多尾畸形、雙頭畸形的精子染色體畸形率高達76%～100%。對這類患者進行ART要慎重。Rives等[7]研究發(fā)現(xiàn)，非整倍體率與精子活動率呈負相關，與精子的形態(tài)無關。導致這些矛盾結(jié)果可能有以下因素：①研究中應用的精液常規(guī)診斷標準不同；②可能精子非整倍體率與某些特殊類型的形態(tài)異常有關，如雙頭、大頭、多尾精子等；③將弱精、少精、畸形精子癥作為一個單獨指標有困難，大部分患者存在弱精和(或)畸形精子癥同時也有少精子癥。

中藥治療男性精液異常有悠久歷史。現(xiàn)代研究[8-11]表明，中藥可通過調(diào)整附睪功能，促進α-糖苷酶分泌，提高精子活力和精子活率；中藥具有雄激素樣作用，能促進睪丸的生精功能，提高精子數(shù)量及活力；可提高血清中NO、LH和T水平，降低FSH水平，減少生精細胞的凋亡，對損傷的睪丸生精小管有較好的修復作用；可提高睪丸組織中SOD的活性，降低NOS活性及NO、MDA含量，清除睪丸中過量的氧自由基，同時上調(diào)生精細胞中抑制凋亡基因Bcl-2的表達。本觀察基于現(xiàn)有研究及經(jīng)驗，配制生精湯，通過FISH技術檢測精子染色體非整倍體，發(fā)現(xiàn)非整倍體率較治療前降低，具體機制可能是通過改善睪丸及附睪內(nèi)環(huán)境，從而減少精原細胞減數(shù)分裂中的錯誤，改善附睪轉(zhuǎn)運分離不正常精子的作用。精子非整倍體率降低可使胚胎染色體異常發(fā)生率降低，從而提高胚胎質(zhì)量，提高妊娠率。

中藥調(diào)節(jié)精原細胞減數(shù)分裂的機制還需進一步研究，為極度少弱畸形精子癥患者降低精子非整倍體率，從而改善輔助生殖結(jié)局。

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Influence of Chinese Medicine on the Rate of Sperm Aneuploidy and Assisted Reproductive Technology Result

HAN Linxiao，SUN Xiaoyan，CHEN Bo，et al

CenterofReproductiveMedicine，theThirdPeople'sHospitalofDongguan，Dongguan523326，China

Objective To study the influence of Chinese medicine on the rate of sperm aneuploidy and assisted reproductive technology(ART) result.Methods 58 infertile men with oligoasthenoterazoospermia who received ART treatment were divided into experimental group(26 cases)and control group(32 cases).The experimental group received ART treatment after 3 course of Chinese medicine.The control group received ART treatment directly.Fluorescence in situ hybridization(FISH)was used to analyze spermatozoa chromosomes.The rate of fertilization，the rate of cleavage，the rate of high embryo，he rate of useful embryo，the rate of pregnancy，the rate of abortion and the rate of implantation were observed and compared between two groups.Results Before treatment，the rate of sperm aneuploidy for experimental group and control group was 2.3% and 2.1% respectively，with no significant difference.After treatment，the rate of sperm aneuploidy for experimental group was 1.7% which was significant lower than before(P<0.05).For experimental group and control group，the rate of fertilization was 82.55%，80.80%，the rate of cleavage was 99.25%，98.77%，the rate of high embryo was 24.91%，24.07%，the rate of useful embryo was 76.23%，70.68%，the rate of pregnancy was 57.69%，31.25%，the rate of abortion was 7.70%，12.50%，the rate of implantation was 38.98%，22.20%.There was significant difference for the rate of pregnancy and implantation between two groups(bothP<0.05).Conclusion Chinese medicine can reduce the rate of sperm aneuploidy and improve ART result.

Chinese medicine；spermatozoa chromosome；aneuploidy；ART；ICSI

10.3969/j.issn.1674-4616.2016.05.001

*東莞市科技計劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研一般項目(No.東科[2014]104號之232)

2016-03-25)