大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與樹枝狀兩親性多肽自組裝凝膠支架的生物相容性

陳 睿，宋玉林，汪文玉，吳 凱，陳偉高

(南昌大學第二附屬醫(yī)院骨科，江西南昌 330000)

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◇基礎研究◇

大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與樹枝狀兩親性多肽自組裝凝膠支架的生物相容性

陳 睿，宋玉林，汪文玉，吳 凱，陳偉高

(南昌大學第二附屬醫(yī)院骨科，江西南昌 330000)

目的 研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)與樹枝狀兩親性多肽自組裝凝膠支架的生物相容性。方法 獲取大鼠BMSCs，傳至第3代行流式細胞術表面抗原檢測及成脂分化誘導鑒定干細胞。設計含雙鏈-IKVAV活性集團的樹枝狀兩親性多肽，用固相合成法合成多肽，質(zhì)譜儀(MS)測其分子量，高效液相色譜儀(HPLC)測其純度；將10 mg/mL樹枝狀兩親性多肽溶液在兔膝關節(jié)滑液作用下自組裝為凝膠支架，透射電鏡觀察凝膠超微結構；1×109/L的BMSCs懸液分別接種于凝膠內(nèi)部(三維培養(yǎng)體系)及多聚賴氨酸包被的蓋玻片表面(二維培養(yǎng)體系)，CCK-8法繪制細胞生長曲線。DEAD/LIVE雙標染色，熒光顯微鏡觀察BMSCs在三維多肽凝膠中成活及增殖情況。結果 分離獲取的細胞高表達CD29、CD90，不表達CD34、CD45，經(jīng)成脂誘導2周出現(xiàn)脂滴，油紅O染色成紅色。MS測得合成多肽相對分子質(zhì)量為2 344.2，與其理論值一致；HPLC分析其純度為95.15%；透射電鏡觀察凝膠由多孔納米纖維構成，納米纖維直徑為5～7 nm，長度為數(shù)百納米至數(shù)微米；CCK8試驗示三維體系中細胞增殖率明顯高于二維培養(yǎng)體系(P<0.05)。DEAD/LIVE雙熒光染色后顯示三維培養(yǎng)體系中細胞生存、增殖情況良好，未出現(xiàn)明顯的細胞毒性導致細胞死亡。結論 含-IKVAV活性基團的樹枝狀兩親性多肽與BMSCs具有良好的細胞相容性并能促進其增殖。

骨髓間充質(zhì)干細胞；-IKVAV；樹枝狀兩親性多肽；細胞相容性

隨著我國交通和工業(yè)的快速發(fā)展，脊髓損傷發(fā)生率不斷增加，治療及康復困難，導致患者勞動能力不同程度喪失，造成患者家屬極度身心痛苦，給社會帶來嚴重經(jīng)濟負擔，是迫切需要解決的問題。

目前，仿生脊髓再生是治療脊髓損傷的有效方法。脊髓組織工程(tissue engineering)是仿生脊髓再生的理想技術[1]。兩親性多肽凝膠因具備高度仿生結構和良好的生物相容性成為脊髓組織工程材料的優(yōu)先選擇[2]。樹枝狀兩親性多肽因在線性多肽的基礎上通過賴氨酸支化使其能同時攜帶多個一種或多種活性表位，從而能為細胞提供更多的生物信號而被重視[3]。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)由于其具有多向分化潛能、低免疫原性、易獲性等優(yōu)點而成為脊髓組織工程的理想種子細胞。本實驗通過設計及合成樹枝狀兩親性多肽，自組裝形成多孔納米凝膠支架，研究大鼠BMSCs與其生物相容性研究，為進一步的脊髓組織工程構建提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康4周齡SD大鼠5只，健康3月齡日本大耳白兔3只，均由南昌大學醫(yī)學院動物中心提供。結構式為IKVAV-KIKVAV-K KLLLAAA(K)-C16H31O 兩親性分支多肽委托上海波泰公司合成。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM-F12培養(yǎng)基、FBS(Gibco北美)；2.5 g/L胰蛋白酶-0.2 g/L(EDTA)(Gibco公司，美國)；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、油紅O染色劑(Sigma公司，美國)；吲哚美辛(Alexis公司，美國)；兔抗大鼠CD29、CD34、CD45、CD90多克隆抗體(BD公司,美國)；碘化丙啶(propidium iodide, PI)，鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)(Invitrogen公司，美國)；0.1 mol/L KCl、0.1 mol/L HCl(國藥集團)。

倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM) (JEM, Japan)；流式細胞儀(BD公司，美國)；CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標儀(Thermo公司，美國)。

1.3 BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 BMSCs的獲取 采用脊髓脫臼法處死健康4周齡SD大鼠，置入750 mL/L乙醇浸泡10 min；無菌條件下取出股骨及脛骨，PBS清洗3次；剪刀剪去股骨及脛骨兩端骨骺，用DMEM-F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，反復吹打沖洗液制備成單細胞懸液。1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，以含有100 mL/L FBS的DMEM-F12完全培養(yǎng)基重懸細胞，以1×109/L的細胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)過程中，48 h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，以后每2 d全量更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底至細胞融合成單層，密度長至80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶2的比例進行傳代培養(yǎng)。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況，傳至第3代供實驗用。

1.3.2 流式細胞術檢測BMSCs表面抗原 取第3代BMSCs，胰蛋白酶消化，離心1 000 r/min×5 min，棄上清，加少量PBS吹打均勻，調(diào)整細胞密度為1×109個/L，將細胞懸液移入EP管(100 μL/管)，每管分別加入含有FITC標記的-CD29、-CD34、-CD45、-CD90流式單克隆抗體各5 μL，以同型FITC-IgG抗體為陰性對照，避光室溫孵育45 min，PBS洗滌2次以去除未結合的抗體，離心棄上清后，以每管500 μL PBS重懸均勻，流式細胞儀進行檢測分析。

1.3.3 BMSCs的體外定向誘導分化 取第3代BMSCs胰蛋白酶消化，按1×108/L濃度接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上，待細胞貼壁融合較多時，將培養(yǎng)基更換為成脂誘導培養(yǎng)基(高糖DMEM，100 mL/L FBS，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰島素，0.5 mmol/L IBMX，200 μmol/L吲哚美辛)，陰性對照用100 mL/L FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每周換液2～3次。定期觀察細胞形態(tài)變化，培養(yǎng)2周后取細胞爬片，PBS清洗后40 g/L多聚甲醛固定5 min，洗滌后加入油紅O工作液染色15 min，PBS洗滌2次后行顯微鏡觀察。

1.4 樹枝狀兩親性肽凝膠的制備 采用空氣栓塞法處死健康3月齡日本大耳白兔，使用含雙抗的PBS溶液徹底清洗四肢，750 mL/L乙醇浸泡后使用無菌手術器械分離切開膝關節(jié)，當關節(jié)囊切口后使用無菌注射器收集關節(jié)液，完畢后放置于4 ℃冰箱中待用。

10 mg(IKVAV)2-PA多肽置入裝有600 μL 0.1 mol/L KCl溶液血清瓶中，使用0.1 mol/L HCl溶液及三蒸水調(diào)節(jié)多肽溶液濃度及pH值，將溶液pH值調(diào)至5，濃度為1%(質(zhì)量分數(shù))后渦旋機反復震蕩形成澄清的臨界狀態(tài)下自組裝溶液。500 μL 1%(質(zhì)量分數(shù))臨界多肽溶液加入到等體積關節(jié)液中形成多肽自組裝凝膠。50 μL 1%(質(zhì)量分數(shù))臨界多肽溶液與等體積關節(jié)液充分混合形成凝膠涂布于金屬濾網(wǎng)上，脫水，臨界點干燥，磷酸鎢染色，作TEM觀察。

1.5 樹枝狀兩親性多肽自組裝凝膠與BMSCs細胞的相容性檢測 將300 μL 1%(質(zhì)量分數(shù))臨界多肽溶液加入到300 μL 1×107/L細胞懸液中數(shù)秒后形成凝膠，吸去多余液體后加入500 μL完全培養(yǎng)基形成三維培養(yǎng)體系，置于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于第3、5、7天進行Calcein-AM和PI染色，觀察每孔板中加入含1/10體積2 μmol/L、4 μmol/L的Calcein-AM和PI的細胞培養(yǎng)基，置于37 ℃孵箱孵育15 min，再用PBS洗滌2遍。在熒光顯微鏡下，先使用490 nm激發(fā)波長觀察綠色的活細胞，然后用545 nm激發(fā)波長觀察紅色的死細胞。觀察各個時間點細胞形態(tài)特征、活細胞和死細胞數(shù)量。每組隨機選取3個視野下拍攝的綠色熒光和紅色熒光圖片通過2名實驗者用Photoshop點計數(shù)工具進行細胞計數(shù)，統(tǒng)計學作圖軟件制作柱狀圖。

取生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs，血清消化后用關節(jié)液重懸細胞制成密度為1×107/L細胞懸液。將96孔板隨機分為2組。對照組：加入100 μL 1×107/L細胞懸液，待8 h后細胞完全貼壁后吸去關節(jié)液，加入100 μL完全培養(yǎng)基形成二維培養(yǎng)體系。實驗組：加入100 μL 1×107/L細胞懸液后每孔加入100 μL 1%(質(zhì)量分數(shù))臨界多肽溶液，數(shù)秒后形成凝膠，吸去多余液體后加入100 μL完全培養(yǎng)基形成三維培養(yǎng)體系。成膠后再每孔加入100 μL細胞懸液。每組5個復孔，共接種4塊96孔板。置于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。分別在1、3、5、7 d各取出一板，于實驗組和對照組分別加入CCK8 10 μL，孵箱中培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm處A值。將每天平均A值用統(tǒng)計學作圖軟件在坐標紙上繪出實驗組和對照組的增殖曲線。

2 結 果

2.1 BMSCs光鏡下的形態(tài)學觀察 原代細胞接種于培養(yǎng)瓶后，細胞呈圓形，大小不一，懸浮于培養(yǎng)液中。48 h后開始有細胞貼壁，呈梭形、多角形(圖1A)。通過換液逐漸除去不貼壁的雜質(zhì)細胞。3、4 d后可見放射狀排列的細胞集落，伸出長短不一突起(圖1B)。當培養(yǎng)到第8天左右細胞融合至90%，細胞呈現(xiàn)漩渦狀、魚群樣排列。傳代后細胞貼壁生長，細胞形態(tài)均一，呈梭形生長，細胞生長旺盛。傳代時間穩(wěn)定約6 d(圖1C、1D、1E、1F)。

圖1 原代及傳代培養(yǎng)的BMSCs細胞形態(tài)Fig.1 Morphological observation of first-generation and third- generation rat BMSCs (inverted phase contrast microscope)

2.2 流式細胞術檢測BMSCs表面抗原的表達結果 選取的第3代BMSCs經(jīng)4種流式抗體結合后上機檢測，結果顯示，BMSCs表達CD29(陽性率99.88%)、CD90(陽性率99.36%)，不表達或極低表達CD34(陽性率1.15%)、CD45(陽性率1.52%)(圖2)。

圖2 第3代BMSCs流式細胞術檢測表面抗原的表達情況Fig.2 Detection of surface antigens of third-generation BMSCs by flow cytometry

2.3 BMSCs的成脂誘導和油紅O染色結果 BMSCs在成脂誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，第2天即可看到細胞骨架收縮，第3天后可見透亮脂滴開始增多變大。誘導2周后脂滴形成較多，融合為較大脂滴(圖3A)，經(jīng)油紅O染色后可見脂滴被染成紅色(圖3B)。

圖3 BMSCs成脂誘導2周油紅O染色結果Fig.3 Oil red O staining after induction to adipogenic differentiation for two weeks (inverted phase contrast microscope, ×200)

2.4 肽的檢測結果 肽分子結構見圖4A，MS示其平均分子質(zhì)量為2 344.2，與其理論設計肽分子質(zhì)量一致(圖4B)；HPLC顯示合成的樹枝狀兩親性多肽的純度為95.15%(圖4C)；表明所合成的多肽為本實驗目標肽。

圖4 兩親性樹枝狀多肽檢測結果Fig.4 The detection results of the branched peptide-amphiphile

2.5 肽自組裝凝膠及檢測結果 當在1%(質(zhì)量分數(shù))多肽溶液中加入等體積的關節(jié)液促發(fā)其自組裝，數(shù)秒后形成透明多肽凝膠緊貼于瓶壁，晃動血清瓶凝膠不脫落(圖5A)。TEM觀察凝膠由納米纖維構成，納米纖維直徑為5～7 nm，長度為構100～1 500 nm(圖5B)。

圖5 自組裝納米凝膠檢測結果Fig.5 The detection results of self-assembling nanofiber hydrogel

2.6 樹枝狀兩親性多肽凝膠與BMSCs細胞相容性 將300 μL 1%(質(zhì)量分數(shù))臨界多肽溶液加入到300 μL 1×107/L細胞懸液中數(shù)秒后形成凝膠構建細胞三維培養(yǎng)體系，8 h后活細胞向四周發(fā)出不規(guī)則突起，逐漸變?yōu)槎嘟切位蛩笮位謴蜑檎＜毎螒B(tài)，死細胞未伸長呈圓形(圖6)。Calcein-AM和PI染色，細胞點計數(shù)第1、3、5天活細胞與死細胞數(shù)目，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加三維體系中活細胞數(shù)目明顯增多且差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)，但未出現(xiàn)更多的細胞死亡，差異無統(tǒng)計學意義(圖7)。CCK結果顯示，第3天BMSCs開始出現(xiàn)明顯增殖，細胞在三維培養(yǎng)中增殖活性明顯高于二維體，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)，當?shù)降?天二維培養(yǎng)體系細胞達到一個平臺期不再出現(xiàn)細胞分裂增殖，但三維體系中細胞增殖情況仍然繼續(xù)(圖8)。

圖6 BMSCs在納米纖維凝膠中生長8 h后Fig.6 The BMSCs living in the nanofiber hydrogel after 8 h

圖7 細胞三維培養(yǎng)下Calcein-AM和PI染色結果Fig.7 The calcein-AM and PI staining results of cells in three-dimensional culture

圖8 CCK8檢測實驗組和對照組BMSCs增殖曲線Fig.8 BMSCs’ growth curves in experimental group and control group by CCK8 test

3 討 論

脊髓損傷后的治療及康復一直是世界性的難題，是當今迫切需要解決的問題。正常脊髓由功能性微血管、完整血脊髓屏障、細胞外基質(zhì)、神經(jīng)細胞及誘導因子等構成[4]。目前，脊髓損傷研究的熱點一直集中于脊髓組織工程的構建。

脊髓組織工程是仿生脊髓再生的理想技術。樹枝狀兩親性多肽自組裝后形成高寬比的圓柱形納米支架材料具有如下優(yōu)點：①可通過肽分子賴氨酸位點進行支化；②攜帶多個功能基團或抗原表位，該功能基團位于自組裝納米纖維表面，易于與受體結合，執(zhí)行復雜生物功能；③生物相容性好[5]。因此，樹枝狀兩親性多肽是目前構建脊髓組織工程支架材料的良好選擇。

脊髓組織工程大多以神經(jīng)干細胞作為種子細胞，然而有活力的神經(jīng)干細胞主要從胚胎或新生哺乳動物腦或脊髓中獲取,其取材受到倫理限制,必須考慮既合法又不違背倫理及易獲取等特點。骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)可以克服這些缺點，它可以從哺乳動物自身骨髓獲取，通過基因修飾可產(chǎn)生多種生長因子，如neurotrophin-3(NT-3)、angiopoietin-1(Ang-1)及VEGF等；NT-3可通過酪氨酸激酶受體-3(NTPK-3/TrkC)誘導神經(jīng)前體細胞分化為神經(jīng)元,通過轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation)誘導BMSCs分化為功能性神經(jīng)元[6]。所以，BMSCs才是較為理想的種子細胞。

本實驗合成的樹枝狀多肽特點在于：①含有長鏈的烷基尾C16H31O-，該結構可以提高肽對離子敏感度并調(diào)節(jié)自組裝納米纖維直徑和長度。②含有A3L3(AAALLL)，一方面與烷基起協(xié)同效應，另一方面使活性區(qū)域伸出纖維表面。③肽分子羧基末端引入3個賴氨酸分支單元，分別插入IKVAV活性集團。優(yōu)點在于：①由于高電荷賴氨酸樹枝大分子提供空間位阻，使多肽分子互相分離，改善活性結構與整合素受體結合。②肽分子在生理鹽溶作用下自組裝形成高寬比的納米纖維，其分支結構置于納米纖維表面，增強結合能力，而且攜帶多個活性結構。③IKVAV具有能夠促進細胞粘附、神經(jīng)突觸形成、血管再生等作用[7]。

將多肽溶解形成臨界多肽溶液。當加入等體積兔膝關節(jié)液后由于關節(jié)液內(nèi)各種離子的存在，多肽通過分子內(nèi)非共價鍵(氫鍵、疏水鍵、范德華力等)自組裝為三維多孔納米纖維凝膠支架。凝膠由高寬比的三維納米纖維組成，含水量高達99.5%，對細胞有良好的機械支撐作用，蛋白質(zhì)、生物因子、氧氣等通過在凝膠中彌散作用足夠滿足大量細胞生存[8]。

由20世紀70年代FRIEDENSTEIN等采用差異貼壁法首次從骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，該法至今仍是培養(yǎng)BMSCs的常用方法。本實驗采用該方法獲取的BMSCs后，通過形態(tài)學觀察、表面抗原檢測和定向誘導分化，驗證獲取的細胞為BMSCs。將BMSCs與多孔納米纖維凝膠支架組合構建三維培養(yǎng)體系后，由于自組裝三維多肽凝膠為細胞的生長與繁殖提供了更大的生長空間和-IKVAV活性表位。CCK-8結果顯示細胞在三維培養(yǎng)中增殖活性明顯高于二維體，且到達平臺期時細胞數(shù)量也明顯增多。DEAD/LIVE試劑盒是通過鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)分別將活細胞胞質(zhì)和死細胞核染成綠、紅色，可進行細胞標記，也用于檢測細胞存活率[9]。三維培養(yǎng)體系通過染色后顯示，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞健康程度明顯升高，提示多肽凝膠與BMSCs具有良好的生物相容性。而第1天中有一部分細胞死亡主要考慮自組裝過程中溶液離子濃度及pH值變化所致。

綜上所述，本實驗通過構建以BMSCs為種子細胞、樹枝狀兩親性多肽為支架材料的三維培養(yǎng)體系，充分說明了樹枝狀兩親性多肽自主裝凝膠支架對BMSCs具有良好的生物相容性，為今后進一步的脊髓組織工程模塊構建提供基礎。

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(編輯 卓選鵬)

Compatibility between rat bone marrow mesenchymal stem cells and self-assembling branched peptide-amphiphile nanofiber hydrogel scaffolds

CHEN Rui, SONG Yu-lin, WANG Wen-yu, WU Kai, CHEN Wei-gao

(Department of Orthopedics Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330000, China)

Objective To study the compatibility between bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and self-assembling branched peptide-amphiphile nanofiber hydrogel scaffolds. Methods First, we obtained BMSCs from rats by whole marrow adherence method and then detected surface antigens using flow cytometry, and induced adipogenic differentiation to identify these stem cells. We designed the branched peptide-amphiphile containing double-IKVAV epitopes. The peptide whose molecular weight (MW) and purity were detected by mass spectrometer (MS) and high performance liquid chromatograph (HPLC), respectively, was synthesized with solid phase method. The 10 mg/mL peptide solution was triggered to form self-assembling branched peptide-amphiphile nanofiber hydrogel under the effect of the rabbit knee joint synovial fluid. The self-assembly hydrogel was examined with transmission electron microscope (TEM). 1×109/L BMSCs were seeded in three-dimensional (3D) hydrogels (experimental group, EG) or surface of coverslips (control Group, CG). A growth curve of the cells was obtained according to CCK-8. After double-labeling with DEAD/LIVE, the survival and proliferation of the BMSCs living in three-dimensional (3D) hydrogels were observed by fluorescence microscope. Results The cells we obtained highly expressed CD29 and CD90, but did not express CD34 or CD45. Lipid droplets were generated after induction to adipogenic differentiation for two weeks, and oil red O staining was positive. MS showed that molecular weight of the peptide was 2 344.2, which was identical to that in theory. HPLC testified that the peptide purity was 96%.

bone marrow mesenchymal stem cell; -IKVAV; branched peptide amphiphile; cytocompatibility

2016-01-01

2016-04-19

國家自然科學基金資助項目(No.81360271)；江西省教育廳科學技術研究重點項目(No.GJJ14054)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81360271) and Key Science and Technology Research Programs of Jiangxi Provincial Education Department (No.GJJ14054)

宋玉林. E-mail: songyulin2001@163.com

R318

A

10.7652/jdyxb201606007

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1800.012.html(2016-10-10)

TEM showed that the hydrogel was composed of nanofibers with 5-7 nm in diameter and hundreds of nanometers to several microns in length. CCK8 test showed that BMSCs proliferated more actively in 3D hydrogel than in 2D culture (P<0.05). Observed under fluorescence microscope after DEAD/LIVE kit staining, the cells survived and proliferated in good condition, the hydrogel had no cytotoxicity to the cells. Conclusion The self-assembled hydrogel containing double-IKVAV epitopes can provide survival environment for BMSCs and promote their proliferation.