高效液相色譜法測定巴旦木青皮提取物中齊墩果酸和熊果酸

李維霞，魏 佳，蘇玉紅，吳 斌，張 平,*

（1.新疆大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆農業(yè)科學院農產品貯藏加工研究所，新疆 烏魯 木齊 830091）

高效液相色譜法測定巴旦木青皮提取物中齊墩果酸和熊果酸

李維霞1，魏 佳2，蘇玉紅1，吳 斌2，張 平2,*

（1.新疆大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆農業(yè)科學院農產品貯藏加工研究所，新疆 烏魯 木齊 830091）

采用質譜儀對巴旦木青皮提取物中齊墩果酸（oleanolic acid，OA）和熊果酸（ursolic acid，UA）進行鑒定，進一步用高效液相色譜法測定OA和UA含量，優(yōu)化提取條件。高效液相色譜條件：利用Platisil ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.2%磷酸（85∶15，V/V）溶液為流動相，流速0.8 mL/min；柱溫20 ℃；檢測波長210 nm。結果表明：OA在0.005～0.5 mg/mL范圍內線性關系良好（R2=0.999 9），回收率在89.67%～94.85%之間，相對標準偏差在1.28%～3.16%之間（n=3）；UA在0.005～0.5 mg/mL范圍內線性關系良好（R2=0.999 9），回收 率在88.67%～94.77%之間，相對標準偏差在1.07%～1.92%（n=3）之間。在不同提取 條件下，提取劑為體積分數(shù)95%乙醇、料液比1∶40（g/mL）、提取時間40 min及提取3 次為最佳條件。

巴旦木青皮；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法

巴旦木，又名扁桃（Amygdalus Communis L.），是薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）桃屬喬木，為世界著名干果及木本油料樹種[1]。因其果仁營養(yǎng)豐富，含有人體所必需的多種微量元素[2-4]而廣受歡迎。巴旦木作為新疆地區(qū)的特色果品，在南疆喀什與和田地區(qū)被大量種植，每年為當?shù)毓r帶來巨大經濟利益，同時也產生了大量的巴旦木青皮。

巴旦木青皮為巴旦木的干燥外果皮，其含有的三萜酸是自然界藥用植物的主要活性成分之一。齊墩果酸（土當歸酸，oleanolic acid，OA）和熊果酸（烏索酸，ursolic acid，UA）是巴旦木青皮提取物中三萜酸的主要有效成分，二者屬于同分異構體，是廣泛存在于自然界中的五環(huán)三萜類化合物。現(xiàn)代藥理學研究表明，OA和UA具有較強的生理活性，其中OA具有保肝、降血糖、抗心律失常、消炎、增強免疫、抑制血小板聚集和抗氧化等多種藥理作用[5-8]；UA具有鎮(zhèn)靜、抗糖尿病、抗炎、抗菌、降血脂、穩(wěn)定肝功能、抗氧化 和抗腫瘤等作用[9-10]。三萜類物質結構復雜，目前人工合成技術不成熟，其主要來源是從植物中提取[11]，因此，從植物提取物中分離檢測UA和OA是當今研究的熱點之一。

目前，常用的OA和UA的分析方法主要有薄層色譜法[12-14]、分光光度法[15]、氣相色譜法[16]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[17-18]及毛細管電泳法[19]等。其中HPLC法具有分析時間短、分離度好、靈敏度高、操作簡便的特點，近幾年來得到迅速發(fā)展并被廣泛應用[20]。采用HPLC法測定OA和UA的含量已有大量文獻報道，但對巴旦木青皮提取物中OA和UA提取方法的優(yōu)化及含量的檢測報道較少。本實驗通過單因素和正交試驗優(yōu)化了巴旦木青皮提取物中OA和UA的提取條件，采用質譜儀對提取物中OA和UA做了定性分析，并通過HPLC法測定了巴旦木青皮提取物中OA和UA的含量，為巴旦木青皮及其中藥制劑的質量標準提供參考，也為巴旦木青皮資源的深加工提供理論依據和實驗數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴旦木青皮采自新疆喀什市莎車縣國營二農場。將采集的青皮材料從-20 ℃冰箱中取出，立即放入用液氮冷凍過的植物粉碎機中粉碎，在-50 ℃條件下真空冷凍干燥除去水分，研磨并過40 目篩，置于干燥器中備用。

OA、UA標準品（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 霍尼韋爾貿易（上海）有限公司；磷酸、乙醇（均為分析純） 天津市福晨化學試劑廠；實驗室用水均為高純水（≥18 MΩ/cm）。

1.2 儀器與設備

Q EXACTIVE PLUS型質譜儀 美國Thermo公司；1260型高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器、示差折光檢測器和EZChrom Elite工作 站） 美國安捷倫公司；DZG-303A艾柯實驗室專用超純水儀 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；A11基本型研磨機 德國IKA公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SK 7200H超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司；RE100-Pro旋轉蒸發(fā)儀 美國Scilogex公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

參照黃浩[21]、鄒盛勤[22]等的方法，并略加改動。準確稱取巴旦木青皮干粉1.0 g，加入30 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液，超聲提取40 min，抽濾，殘渣以相同的方法提取40 min，合并2 次濾液，將濾液在45 ℃、20 r/min旋轉濃縮蒸干乙醇，殘渣用水溶解，石油醚萃取2 次，水層旋轉蒸發(fā)近干，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶后，取上清液過0.22 μm濾膜后直接注入進樣瓶以供HPLC分析。

1.3.2 標準溶液的配制

分別準確稱取OA和UA標準品各5.0 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中，其質量濃度為0.5 mg/mL，將其作為標準儲備液放置冰箱備用。采用逐步稀釋法得到0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL一系列不同質量濃度的標準工作溶液，過0.22 μm濾膜后進樣。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源；檢測方式：正離子模式；鞘氣流速5 psi；輔助氣流速1 psi；噴霧電壓3.5 kV；毛細管溫度320 ℃；輔助氣加熱器溫度300 ℃。

1.3.4 HPLC條件

參照文獻[23-24]等并稍作調整，確定色譜條件為：Platisil ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸（85∶15，V/V）溶液；流速0.8 mL/min；柱溫20 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3.5 提取條件的優(yōu)化

提取條件單因素水平：提取劑為甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和三氯甲烷；提取劑體積分數(shù)為65%、75%、85%、95%、100%；料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）；提取時間為10、20、30、40、50 min；提取次數(shù)為1、2、3、4 次，在單因素試驗基礎上設計了L9（34）正交試驗對提取條件進行全面考察。

2 結果與分析

2.1 巴旦木青皮提取物中OA和UA的鑒定

圖1 OA、UA標準品（A）和巴旦木青皮提取物（B）電噴霧-質譜圖Fig. 1 ESI-MS spectra of mixed OA and UA standards (A) and almond green husk extracts (B)

對巴旦木青皮提取物和OA、UA混合標準品進行電噴霧-質譜正離子模式掃描，通過樣品和混合標準品的精確質荷比判斷巴旦木青皮提取物是否含有OA及其同分異構體UA。由圖1可以看出，巴旦木青皮提取物中目標物的質荷比與混合標準品的質荷比相吻合，故推測巴旦木青皮提取物中可能含有OA或其同分異構體UA[25]，采用HPLC法進一步對樣品進行分析。

2.2 提取條件的優(yōu)化

以巴旦木青皮提取物中OA和UA的提取量為指標，采用單因素試驗和正交試驗對提取條件進行了優(yōu)化。

2.2.1 提取劑的選擇

圖2 提取劑對OA和UA提取量的影響Fig. 2 Effect of organic solvents on the extraction effi ciency of OA and UA

OA和UA可溶于多種有機溶劑，本實驗采用5 種試劑進行溶劑優(yōu)化，由圖2可知，5 種溶劑的提取能力為甲醇＞乙醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞三氯甲烷，由于甲醇有毒，且提取后溶液顏色較深，脂溶性成分較多，故選用乙醇為提取劑。

2.2.2 提取劑體積分數(shù)的優(yōu)化

圖3 提取劑體積分數(shù)對OA和UA提取量的影響Fig. 3 Effect of different ethanol concentrations on the extraction yields of OA and UA

由圖3可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，OA和UA的提取量逐漸增加，當乙醇體積分數(shù)為95%時提取效果最佳，當乙醇體積分數(shù)為100%時，其提取效果有所下降，可能是由于溶劑中少量水的存在增加了溶劑的相對極性，從而增加了其傳質過程，提高了對OA和UA的溶解能力[25]。

2.2.3 料液比的優(yōu)化

圖4 料液比對OA和UA提取量的影響Fig. 4 Effect of solid/solvent ratio on the extraction yields of OA and UA

由圖4可看出，隨著提取劑用量的增加，OA和UA提取量也逐漸增加，當料液比為1∶30時，巴旦木青皮提取物中OA和UA提取量基本保持不變，由于溶劑用量增大，增加了提取成本，同時對后續(xù)濃縮操作過程不利，因此選擇料液比為1∶30。

2.2.4 提取時間的優(yōu)化

圖5 提取時間對OA和UA提取量的影響Fig. 5 Effect of extraction time on the extraction yields of OA and UA

由圖5所示，OA和UA在提取時間低于40 min時，隨著提取時間的延長，OA和UA的提取量隨之增加，當

再延長提取時間其提取量有下降趨勢，可能原因是在提取時間到達40 min時，巴旦木青皮充分溶脹，進而增加了溶劑的溶解能力。隨著時間的延長至50 min時，雜質溶出量會相應增加，同時OA和UA的提取量并無明顯增大，因此，選用40 min為最佳提取時間。

2.2.5 提取次數(shù)的優(yōu)化

圖6 提取次數(shù)對OA和UA提取量的影響Fig. 6 Effect of number of extraction cycles on the extraction yields of OA and UA

由圖6可看出，當提取1 次時，對OA和UA的提取不徹底，含量低于第2、3次提??；繼續(xù)提取，OA和UA的提取量基本保持不變，而且當提取大于2 次時，提取溶劑和提取時間增加，故提取2 次為宜。

2.2.6 正交試驗優(yōu)化和驗證實驗結果

在以上單因素試驗基礎上，以巴旦木青皮提取物中OA和UA提取量為指標，選擇提取劑體積分數(shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)，設計了L9（34）正交試驗，以確定OA和UA的最佳提取條件。結果和數(shù)據處理如表1、2所示。

表 11 LL9（334）正交試驗設計及結果（OOAA）Table 1 The design and results of L9((334) orthogonal tests for OA extraction

由表1可知，各因素對巴旦木青皮提取物中OA提取量影響的主次順序是：D＞A＞C＞B，即提取次數(shù)是最主要因素，提取劑體積分數(shù)料液比、提取時間是次要因素。由極差分析可得出最佳提取條件為A2B2C2D3，從正交試驗表中得出最優(yōu)組合為A2B1C2D3，通過驗證實驗確定提取工藝組合為A2B2C2D3，即提取劑體積分數(shù)95%、料液比1∶40、提取時間40 min及提取3 次。

表 22 LL9（334）正交試驗設計及結果（UUAA）Table 2 The design and results of L9((334) orthogonal tests for UA extraction

由表2可知，各因素對巴旦木青皮提取物中UA提取量影響的主次順序是：D＞C＞A＞B，即提取次數(shù)是最主要，提取劑體積分數(shù)料液比、提取時間是次要因素。由極差分析可得出最佳提取條件為A2B2C2D2，從正交試驗表中得出最優(yōu)組合為A1B2C2D2，通過驗證實驗確定提取工藝組合為A2B2C2D2，即提取劑體積分數(shù)95%、料液比1∶40、提取時間40 min及提取2 次。

在巴旦木青皮提取物中OA和UA同時存在，且二者屬于同分異構體，性質很相似，在提取過程中共存。由于巴旦木青皮提取物中OA含量較高，故提取條件以OA為主。因此巴旦木青皮提取物中OA和UA經正交試驗確定的最佳提取工藝組合為A2B2C2D3，即提取劑體積分數(shù)95%、料液比1∶40、提取時間40 min及提取3 次。在此基礎上，對正交試驗結果和單因素試驗結果進行驗證實驗，由表3可知，在正交試驗條件下，OA和UA含量要高于單因素試驗結果，因此確定巴旦木青皮提取物中OA和UA最佳提取工藝組合為A2B2C2D3，即提取劑體積分數(shù)95%、料液比1∶40、提取時間40 min及提取3 次。

表3 驗證實驗（OA、UA）Table 3 Experimental verififi cation of optimized extraction conditions

2.3 標準品及巴旦木青皮提取物中OA和UA的色譜分離

將0.2 mg/mL的OA和UA混合標準溶液在1.3.4節(jié)色譜條件下注入HPLC儀，如圖7A所示。將樣品進行處理后用HPLC進行分析，如圖7B所示。理論塔板數(shù)以OA和UA峰計均不低于6 000。當甲醇和0.2%磷酸溶液配比為85∶15（V/V）時，OA和UA分離度良好（R＞1.5）且峰形較好。

圖7 標準品（A）和巴旦木青皮樣品（B）HPLC色譜圖Fig. 7 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and almond green husk (B)

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的繪制

對不同質量濃度的標準溶液OA、UA分別自動進樣20 μL，按1.3.4節(jié)色譜條件測定，記錄峰面積。以每個標準工作溶液對應的峰面積Y和其質量濃度X進行線性回歸分析，得到OA回歸方程：Y=3.144×108X+ 1.512×105，R2=0.999 9；UA回歸方程：Y=1.349×108X+ 1.365×105，R2=0.999 9。結果顯示OA和UA在0.005～0.5 mg/mL范圍內線性關系良好。將最小質量濃度的標準品溶液無限稀釋，按照1.3.4節(jié)色譜條件進樣測定空白和稀釋的標準品溶液，計算信噪比，以3 倍信噪比對應的標準品質量濃度作為檢出限，以10 倍信噪比對應的OA、UA標準品質量濃度作為定量限，計算結果得出OA、UA的檢出限分別為0.38、0.41 μg/mL，定量限分別為1.28、1.43 μg/mL。

2.4.2 精密度實驗結果

表4 精密度實驗結果（n==55）Table 4 Results of precise test (n == 55))

分別取質量濃度0.2 mg/mL和0.05 mg/mL的OA和UA標準液自動進樣20 μL，平行測定5 次，測定OA和UA峰面積積分值，計算平均值和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），由表4可知，OA的RSD分別為0.50%和0.89%；UA的RSD分別為0.28%和0.27%，說明儀器精密度良好，滿足實驗要求。

2.4.3 重復性實驗

精確稱取相同質量的樣品5 份，按1.3.1節(jié)制備巴旦木青皮提取液，分別進樣20 μL，用HPLC儀測定峰面積，計算峰面積，由表5可知，OA的RSD為2.85%；UA的RSD為3.29%，說明該方法的重復性較好。

表5 重復性實驗結果（n==55）Table 5 Results of repeatability test (n == 55))

2.4.4 回收率實驗結果

在巴旦木青皮樣品中分別加入一定量的OA、UA標準品，進行加標回收率實驗。由表6、7可知，OA的回收率在89.67%～94.85%之間，RSD在1.28%～3.16%之間；UA的回收率在88.67%～94.77%之間，RSD在1.07%～1.92%之間，可能的原因是由于標準物質添加到樣品中存在基質效應導致回收率偏低，但不影響采用該方法測定巴旦木青皮提取物中OA和UA的含量。

表6 OA加標回收率實驗結果（n==33）Table 6 Results of recovery test for OA (n == 33))

表7 UA加標回收率實驗結果（n==33）Table 7 Results of recovery test for UA (n == 33))

2.5 巴旦木青皮提取物中OA和UA含量測定

準確稱取一定質量巴旦木青皮粉末，按1.3.1節(jié)制備巴旦木青皮提取液，分別進樣20 μL，按1.3.4節(jié)色譜條件測定（平行測定3 份），由表8可知，通過外標法測得巴旦木青皮提取物中OA含量是0.101%，UA含量是0.068%。

表8 巴旦木青皮提取物中OA和UA含量的測定（Table 8 The contents of OA and UA in almonds green husk extract (n == 33)) %

3 討論與結論

OA和UA作為一種三萜類物質，在中藥材中共存，常用提取溶劑主要有甲醇、乙醇、氯仿等[26]。本實驗通過對不同提取溶劑的考察，選用體積分數(shù)95%乙醇溶液為提取劑，并采用正交試驗設計，對樣品提取過程進行了單因素和正交試驗優(yōu)化，確定最佳提取條件為提取劑體積分數(shù)95%乙醇溶液、料液比1∶40、提取時間40 min及提取3 次；并采用質譜儀對用最優(yōu)工藝提取出的巴旦木青皮提取物中OA和UA進行了初步的鑒定。

OA和UA為三萜類同分異構體，因結構相似，分離檢測較困難。本實驗采用紫外分光光度計對OA和UA在波長190～400 nm處進行掃描，最終確定波長210 nm為檢測波長。有文獻[27]報道采用HPLC分離OA和UA時流動相通常為甲醇-水和乙腈-水。本實驗參考文獻[28-29]，分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-醋酸溶液等流動相，結果表明采用甲醇-0.2%磷酸（85∶15，V/V）溶液時分離效果較好，可能的原因是在流動相中加入一定比例的酸調節(jié)流動相pH值，有助于改善色譜峰峰形，提高目標物的分離度；進一步對流速和柱溫進行考察，結果顯示，當流速為0.8 mL/min、柱溫為20 ℃時，OA和UA基本可以分離，且基線較平穩(wěn)。

在上述色譜條件下測得巴旦木青皮提取物中的OA和UA的含量分別為0.101%和0.068%，精密度和準確度均符合分析要求，重復性好，OA回收率在89.67%～94.85%之間，RSD在1.28%～3.16%之間；UA回收率在88.67%～94.77%之間，RSD在1.07%～1.92%之間，表明該方法準確可靠，可用于巴旦木青皮提取物中OA和UA含量測定。

OA和UA主要存在于木瓜、夏枯草、女貞子等植物中，主要以游離形式或與糖苷結合的形式存在，二者的藥理活性有所差別，OA是臨床治療慢性病毒性肝炎和黃疸型肝炎較理想的藥物；UA具有多種生物活性；尤其在抗腫瘤、抗氧化、護肝、降血脂方面的作用顯著，通常利用HPLC對二者分離，使其起到獨特的藥理作用，歐洋等[30]采用HPLC對西藏木瓜中OA和UA含量進行測定，測得木瓜樣品中OA、UA的含量分別為0.18%、0.49%。劉偉等[31]通過HPLC測定了河南夏枯草中OA、UA含量，測得河南夏枯草中OA和UA含量分別為0.08%和0.31%。通過與上述文獻對比，本實驗所建立的測定OA與UA的HPLC方法與文獻中的方法基本一致，同時巴旦木青皮提取物中OA和UA的含量較高，表明采用本研究建立的HPLC方法對巴旦木青皮提取物中OA、UA的分離檢測有一定的研究價值。該方法為巴旦木青皮及其中藥制劑的質量標準提供了參考方法和一定的科學依據，同時也為其他天然產物同類化合物的研究提供了一種借鑒。

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Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in Almond Green Husk Extract by High Performance Liquid Chromatography

LI Weixia1, WEI Jia2, SU Yuhong1, WU Bin2, ZHANG Ping2,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 2. Institute of Agro-Products Storage and Processing, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, ürümqi 830091, China)

Oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) were identifi ed by mass spectrometry (MS) in almond green husk extract. Further, a high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the determination of the contents of OA and UA, and the extraction conditions were optimized using single factor and orthogonal array experiments. The HPLC conditions were set as follows: separation column, Platisil ODS C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm); mobile phase, methanol-0.2% phosphorus acid (85:15, V/V); fl ow rate, 0.8 mL/min; column temperature, 20 ℃; and detection wavelength, 210 nm. In the range of 0.005–0.5 mg/mL (R2= 0.999 9), both OA and UA presented a good li n ear relationship. The average recoveries of OA varied from 89.67% to 94.85% with RSD of 1.28%–3.16% (n = 3). The average recoveries of UA ranged from 88.67% to 94.77%, and the RSD was between 1.07% and 1.92% (n = 3). The optimum conditions for extracting OA and UA from almond green husk extract were as follows: 95% ethanol as extractant; solid/solvent ratio, 1:40 (g/mL); extraction time, 40 min; and 3 extraction cycles.

almond green husk; oleanolic acid (OA); ursolic acid (UA); high performance liquid chromatography (HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201610026

O657.72

A

1002-6630（2016）10-0151-07

李維霞, 魏佳, 蘇玉紅, 等. 高效液相色譜法測定巴旦木青皮提取物中齊墩果酸和熊果酸[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 151-157. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610026. http://www.spkx.net.cn

LI Weixia, WEI Jia, SU Yuhong, et al. Determination of oleanolic acid and ursolic acid in almond green husk extract by high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(10): 151-157. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610026. http://www.spkx.net.cn

2015-08-24

新疆特色林果貯運保鮮及精深加工關鍵技術研究與示范項目（2011BAD27B01）

李維霞（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物分析。E-mail：912861088@qq.com

*通信作者：張平（1964—），男，研究員，博士，研究方向為食品科學。E-mail：zhangpingyys@163.com