響應(yīng)面試驗優(yōu)化纖維素酶輔助提取蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿工藝

任 美，夏延斌,*，王亮亮

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化纖維素酶輔助提取蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿工藝

任 美1，夏延斌1,*，王亮亮2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111）

以蓮子鉆芯粉為原料，采用纖維素酶輔助提取蓮子鉆芯粉中的甲基蓮心堿，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇加酶量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值為自變量，以甲基蓮心堿提取量為響應(yīng)值，通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)選最佳工藝條件。結(jié)果表明：采用纖維素酶輔助提取蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿，最佳提取工藝條件為加酶量3.1%（質(zhì)量分數(shù)）、酶解時間1.7 h、酶解pH 4.8、酶解溫度50 ℃。該工藝條件下得到的甲基蓮心堿提取量為（7.02±0.22）mg/g，高于傳統(tǒng)乙醇法（4.03±0.17）mg/g，提取量提高了71.9%。采用纖維素酶輔助提取法操作簡單，條件溫和，有效地提高了蓮子鉆芯粉的利用率。

蓮子鉆芯粉；甲基蓮心堿；纖維素酶；響應(yīng)面

任美, 夏延斌, 王亮亮. 響應(yīng)面試驗優(yōu)化纖維素酶輔助提取蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(10): 105-110. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610018. http://www.spkx.net.cn

REN Mei, XIA Yanbin, WANG Liangliang. Applying response surface methodology to optimize the extraction of neferine from lotus seed core powder using cellulase[J]. Food Science, 2016, 37(10): 105-110. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610018. http://www.spkx.net.cn

蓮子鉆芯粉是機械鉆頭從蓮子的果蒂到果尖鉆孔取芯形成的粉末，主要由蓮子皮、蓮子心和蓮子肉組成，其中蓮子心是睡蓮科植物蓮成熟種子中間的綠色胚根，含有蓮心堿、甲基蓮心堿和異蓮心堿等生物堿類物質(zhì)。甲基蓮心堿在三大生物堿中含量最高，具有多種生物學活性，如擴充血管[1]、抗心律失常[2]、降壓作用[3]、清除活性氧自由基[4]、抑制脂質(zhì)過氧化作用[5]、抗心肌缺血[6]，在醫(yī)學上常用來治療高血壓、

心律失常[7]、血栓、有機磷中毒等慢性疾病，應(yīng)用前景廣闊。

目前，蓮子鉆芯粉的利用率較低，一般作為動物飼料低值利用。因此，從蓮子鉆芯粉中提取甲基蓮心堿等功效成分，不僅有利于節(jié)約植物資源，而且還能延長蓮子心加工產(chǎn)業(yè)鏈。國內(nèi)外對于蓮芯生物堿的提取方法的研究主要包括：水提法[8]、有機溶劑提取法[9]、超聲輔助提取法、超聲-微波協(xié)同萃取法[10]、另外還有酸液滲漉法[11]等，對于酶法提取這一工藝少有涉及。酶法提取相對于其他方法而言具有處理條件溫和、有效成分浸出率高、專一性強等優(yōu)點。中藥材中常采用纖維素酶或果膠酶對有效成分進行提取，它能在一定程度上溶解和軟化細胞壁，破壞組成細胞壁中纖維素主要成分的β-1,4-糖苷鍵，改變細胞壁的通透性，細胞疏松后，使得植物細胞中的有效成分更多的溶解出來，從而提高蓮心生物堿的提取率。由于蓮子鉆芯粉中的甲基蓮心堿主要是被細胞壁中的纖維素所包裹，因此，采用纖維素酶對其進行酶解處理有利于提高甲基蓮心堿的提取率。

本研究以甲基蓮心堿提取量為指標，采用纖維素酶-乙醇法從蓮子鉆芯粉中提取甲基蓮心堿，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗對條件進行優(yōu)化，以期提高甲基蓮心堿的提取量，為蓮子鉆芯粉副產(chǎn)物的研究與利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子鉆芯粉于2014年6月加工于湘潭宏興隆公司，貯藏于-10 ℃冰箱冷凍室中。

甲基蓮心堿標準品（純度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司；纖維素酶（酶活力400 000 U/g） 上海瑞永生物科技有限公司；無水乙醇、醋酸鈉、甲醇（均為色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

B-260型恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C型pH計 上海奧豪斯儀器有限公司；AP-01P型真空抽濾機 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TGL-16C低速離心機 湖南星科科學儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 甲基蓮心堿的測定

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%三乙胺溶液配比64∶36（V/V）；檢測波長：282 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL；配可變波長檢測器。

1.3.1.2 標準曲線的繪制

精密稱取甲基蓮心堿標準品5.0 mg置于25 mL容量瓶中，加入適量甲醇進行溶解并定容至刻度，配制成200 μg/mL甲基蓮心堿標準品母液。精密量取標準品母液0、1、2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為0、10、20、40、80、120、160 μg/mL系列梯度的標準品子液，將子液超聲10 min后，用甲醇補足質(zhì)量，用0.2 μm微孔過膜，備用。以甲基蓮心堿做標準品，得到線性關(guān)系式：y=3 634.95x+0.28（y為甲基蓮心堿標準品峰面積；x為甲基蓮心堿質(zhì)量濃度/（μg/mL））。

1.3.2 蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿提取工藝

取蓮子鉆芯粉2 g，于100 mL錐形瓶中，加入一定量的纖維素酶，用醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，混合均勻，于水浴鍋中酶解一段時間后，3 500 r/min離心15 min，取上清液。濾渣按料液比1∶20加入體積分數(shù)70%乙醇溶液，于70 ℃水浴回流提取90 min后，3 500 r/min離心15 min，合并上清液。取40 mL上清液用70%乙醇溶液定容至50 mL，高效液相色譜檢測其甲基蓮心堿含量。

1.3.3 樣品中甲基蓮心堿提取量的測定

取定容后的蓮子鉆芯粉樣液，使用0.2 μm微孔濾膜過濾后入高效液相色譜儀進行測定，根據(jù)甲基蓮心堿標準曲線測定提取液中甲基蓮心堿的含量，并按下式計算提取量：

式中：C為甲基蓮心堿質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為溶液體積/mL；m為蓮子鉆芯粉樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿的提取量主要受纖維素酶活性的影響，因此在單因素試驗中，主要考察加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、酶解pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）及酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對物料中甲基蓮心堿提取量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，將纖維素酶加酶量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH值作為考察因素，以甲基蓮心堿提取量作為試驗指標，設(shè)計四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 加酶量對甲基蓮心堿提取量的影響

圖1 加酶量對甲基蓮心堿提取量的影響Fig. 1 Effect of cellulase dosage on the extraction yield of neferine

圖1 顯示，加酶量對甲基蓮心堿提取量的影響基本呈現(xiàn)正相關(guān)，在0.5%～3%的范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，甲基蓮心堿提取量逐漸上升，且在3%加酶量時提取量達到最高（7.58 mg/g），當加酶量大于3%時，蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿提取量有略微下降并趨于平穩(wěn)。原因可能是：在底物質(zhì)量濃度有限[12]的情況下，加酶量少，無法將甲基蓮心堿從細胞壁中釋放出來[13]，其反應(yīng)不徹底，導致當加酶量小于1.5%時，甲基蓮心堿提取量較低；繼續(xù)增加酶量，反應(yīng)體系中細胞壁的通透性增強[14]，阻礙有效成分溶出的阻力減小，甲基蓮心堿提取量增加迅速；而當加酶量過大時，由于酶分子之間的競爭，使得底物與酶接觸減少，甲基蓮心堿提取量呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢[15]。因此，出于酶量節(jié)約考慮，纖維素酶加酶量確定為3%。

2.1.2 料液比對甲基蓮心堿提取量的影響

圖2 料液比對甲基蓮心堿提取量的影響Fig. 2 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of neferine

圖2 表明，料液比在1∶10～1∶15范圍內(nèi)，甲基蓮心堿提取量逐漸增加，由6.542 mg/g增加到7.548 mg/g；當料液比在1∶15之后時，蓮子鉆芯粉中的甲基蓮心堿提取量隨著體系中溶劑用量的增加而緩慢下降，料液比為1∶30時，其提取量僅為4.665 mg/g。原因是：加酶量一定，體系中的溶劑用量逐漸增大時，參與反應(yīng)的酶與底物接觸面積增大，反應(yīng)速率加快，甲基蓮心堿提取量增加。溶劑用量繼續(xù)增加時，降低了酶的質(zhì)量濃度，導致單位體積內(nèi)底物量偏低[16]，因此，本試驗中選擇料液比1∶15比較理想。

2.1.3 酶解pH值對甲基蓮心堿提取量的影響

圖3 酶解pH值對甲基蓮心堿提取量的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis pH on the extraction yield of neferine

每一種酶都有其發(fā)揮最大酶解作用的是最適pH值，纖維素酶的最適pH值為4.0～6.0，低于或高于此范圍都不利于有效成分的提取。由圖3可知，pH值在4.0～5.0之間時，甲基蓮心堿提取量隨溶液體系pH值升高而上升，在pH 5.0時，提取量達到最高6.936 mg/g，當再升高溶液的pH值時，甲基蓮心堿提取量開始逐漸下降。這是因為：溶液體系的pH值會在一定程度上影響酶的活性中心，產(chǎn)生不同的解離狀態(tài)[17]，當pH 5.0時，酶活力最大，當溶液體系偏離最佳pH值時，酶活力會有不同程度的減弱，導致甲基蓮心堿提取量下降。因此，酶解pH值應(yīng)選擇5.0。

2.1.4 酶解溫度對甲基蓮心堿提取量的影響

圖4 酶解溫度對甲基蓮心堿提取量的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction yield of neferine

由圖4可知，甲基蓮心堿提取量隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢，30～50 ℃的酶解溫度范圍內(nèi)，甲基蓮心堿提取量增加較快，在50 ℃時達到最高，為6.915 mg/g，其后，隨著溫度的進一步升高，提取量降低。這是因為：在較低溫度（30 ℃）時，底物分子具有的能量較低，不足以使得酶發(fā)生作用，溫度升高，物料的分子運動加快，同時酶破壞細胞壁的速率加快，蓮子鉆芯粉中的甲基蓮心堿加速溶解到溶液中。但溫度進一步升高時，由于纖維素酶的蛋白質(zhì)特性，在高溫條件下，酶變性失活[18]，甲基蓮心堿提取量降低。因此，酶解溫度選擇50 ℃為宜。

2.1.5 酶解時間對甲基蓮心堿提取量的影響

圖5 酶解時間對甲基蓮心堿提取量的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of neferine

如圖5所示，隨著酶解時間的延長，在0.5～2 h內(nèi)，蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿提取量呈現(xiàn)上升的趨勢，并在2 h時達到最高提取量，6.464 mg/g，隨后提取量開始逐漸減少。在酶解初期，纖維素酶對粉末細胞中的細胞壁進行破碎和溶解，細胞間隙間的有效成分流入到溶液體系中，且在一定范圍內(nèi)，時間越長，細胞壁被破壞的程度越大，甲基蓮心堿提取量越高。超過2 h后，纖維素酶對底物進行分解產(chǎn)生的產(chǎn)物如纖維二糖、寡糖、葡萄糖[19]等對甲基蓮心堿的提取溶出有抑制作用，使得其提取量有所降低，因此，酶解時間選擇2 h為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix with experimental results for neferine yiieelldd

本研究采用纖維素酶法提取蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以加酶量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH值作為響應(yīng)面試驗的影響因素，固定醇提條件和料液比，并以甲基蓮心堿提取量為考察指標，進行四因素三水平的Box-Behnken試驗，選出最優(yōu)試驗條件。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

通過Design-Expert 8.05b軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析并進行回歸擬合，得到試驗實際值的二次回歸模型方程：Y=-56.159 17+24.948 33A+1.308 33B+8.13C+ 0.124 5D-0.22AB-0.07AC+0.011AD+0.67BC+ 0.024BD-0.002CD-3.928 33A2-1.338 33B2-0.943 33C2-0.001 958D2。對回歸方程進行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table 3 Signifi cance test and analysis of variance for the regression model describing enzymatic extraction of neferine

由表3可知，試驗?zāi)Ｐ偷腜＜0.000 1，說明此模型極顯著，模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率[20]，此模型失擬項P=0.383 1＞0.05，表明模型不顯著，擬合的概率高，運用到試驗中誤差小。由表3可知，加酶量（A）及其二次項（A2）、酶解pH值（C）、酶解時間二次項（B2）、酶解pH值二次項（C2）、酶解時間與酶解pH值的交互項（BC）、酶解溫度的二次項（D2）對甲基蓮心堿提取量的影響極顯著（P＜0.01），酶解時間（B）、酶解時間與酶解溫度的交互項（BD）對甲基蓮心堿提取量影響顯著（P＜0.05），說明上述因素對甲

基蓮心堿提取量影響大，改變這些因素的水平會對響應(yīng)值產(chǎn)生較顯著的影響。

根據(jù)表中F值大小，可以得出對甲基蓮心堿提取量影響程度主次為：加酶量＞酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度，其中加酶量對甲基蓮心堿提取量的影響最大?；貧w模型結(jié)果表明，該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.985 4，且模型調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.970 9，說明此模型能用于97.09%的試驗結(jié)果解釋，僅僅只有2.91%的試驗結(jié)果不能用此模型解釋。本試驗中的離散系數(shù)較小，為1.74%，表明此模型反映的試驗結(jié)果可靠性強，數(shù)據(jù)真實。

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面等高線圖可以直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響，以便找出最佳工藝參數(shù)以及各因素之間的交互作用[21-22]。響應(yīng)面圖中3D圖的陡峭程度代表兩個交互作用的強弱，3D圖坡度越陡，因素影響越大，交互作用越明顯。等高線曲線沿一個因素軸方向越密集[23]，并成橢圓狀，其交互作用越強。固定因素取0水平對應(yīng)的值，研究各因素交互作用，響應(yīng)面如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對甲基蓮心堿提取量的影響Fig. 6 Interactive effects of hydrolysis time, pH, temperature and cellulase dosage on the yield of neferine

圖6a、b響應(yīng)面圖在酶解時間、酶解溫度、酶解pH值方向坡面陡峭，向上凸出，甲基蓮心堿提取量有最高值。等高線呈現(xiàn)橢圓狀，交互作用明顯。當加酶量與酶解溫度一定時，隨著酶解時間與酶解pH值的延長和升高，甲基蓮心堿提取量逐漸升高，并在2.1 h、pH 5.1附近達到最高值，之后兩因素水平逐漸增加時，提取量有所下降。由圖6b可知，當加酶量與酶解pH值一定時，隨著酶解時間與酶解pH值的延長和升高，甲基蓮心堿提取量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在2.1 h、50 ℃附近，提取量最高。

圖6c、d、e、f響應(yīng)面圖開口向下，坡面陡峭，其提取量有最高值，加酶量方向的坡面更為陡峭，即加酶量的增加使得甲基蓮心堿提取量的變化更加顯著，隨著加酶量的增加，甲基蓮心堿提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。而隨著酶解時間、酶解pH值和酶解溫度的改變，甲

基蓮心堿提取量的增加趨勢不明顯，表現(xiàn)在響應(yīng)面圖上為坡面平緩。因此，AB、AC、AD、CD之間的交互作用不明顯，與表3中的數(shù)據(jù)一致。

2.3 驗證實驗

通過Design-Expert 8.05b軟件分析得知，最佳酶解條件為加酶量3.15%、酶解時間1.88 h、酶解pH 4.81、酶解溫度49.68 ℃，在此最優(yōu)條件下甲基蓮心堿提取量為6.99 mg/g，結(jié)合實際操作，將最佳提取條件調(diào)整為加酶量3.1%、酶解時間1.7 h、酶解pH 4.8、酶解溫度50 ℃，并對其進行3 次驗證實驗，得到甲基蓮心堿提取量平均值為（7.02±0.22）mg/g，最優(yōu)值與實際值的相對標準偏差為3.57%。說明運用響應(yīng)面進行分析的數(shù)據(jù)可靠性強，能用于生產(chǎn)實際。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Design-Expert 8.05b軟件和Box-Behnken試驗設(shè)計方法優(yōu)化了纖維素酶輔助提取蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿的工藝，并結(jié)合實際操作，確定纖維素酶輔助提取甲基蓮心堿最佳工藝條件為加酶量3.1%、酶解時間1.7 h、酶解pH 4.8、酶解溫度50℃，在此條件下得到甲基蓮心堿平均提取量（7.02±0.22）mg/g，高于傳統(tǒng)乙醇法的提取量（4.03±0.17）mg/g，提取量提高了71.9%。表明采用纖維素酶輔助提取法提高了蓮子鉆芯粉中甲基蓮心堿提取量，有助于提高副產(chǎn)物的利用率，為蓮子鉆芯粉的深加工提供了理論依據(jù)，具有一定的指導意義。

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Applying Response Surface Methodology to Optimize the Extraction of Neferine from Lotus Seed Core Powder Using Cellulase

REN Mei1, XIA Yanbin1,*, WANG Liangliang2
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Changsha 410111, China)

The cellulase-assisted extraction of neferine from lotus seed core powder was optimized using single-factor experiments and response surface methodology based on Box-Behnken design. The independent variables were cellulase dosage, hydrolysis pH, temperature and time. Neferine yield was used as the response. The extraction conditions were optimized as follows： cellulase dosage, 3.1% (m/m); pH, 4.8; hydrolysis time, 1.7 h min; and hydrolysis temperature, 50 ℃. Under the optimized conditions, the yield of neferine was (7.02 ± 0.22) mg/g, which was 71.9% higher than that ((4.03 ± 0.17) mg/g) obtained with the traditional ethanol extraction method. The cellulase-assisted extraction process was accomplished under simple and mild conditions, which could effectively improve the utilization of lotus seed core powder.

lotus seed core powder; neferine; cellulas; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201610018

TS201.1

A

2015-09-24

湘蓮加工技術(shù)集成產(chǎn)業(yè)化示范項目（2013GA770001）

任美（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)。E-mail：531480212@qq.com

*通信作者：夏延斌（1952—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養(yǎng)。E-mail：xy520523@aliyun.com