頂空毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定奧格列汀中有機(jī)溶劑殘留量

鄭飛，華國棟，項(xiàng)穎，張彥麗，張謙，張超

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100078)

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頂空毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定奧格列汀中有機(jī)溶劑殘留量

鄭飛，華國棟，項(xiàng)穎，張彥麗，張謙，張超

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100078)

目的 觀察頂空毛細(xì)管氣相色譜法(GC)測(cè)定奧格列汀原料藥中乙醇、乙酸乙酯、甲苯3種殘留溶劑的效果。方法 采用GC法進(jìn)行殘留溶劑測(cè)定。色譜柱采用DB-5彈性石英毛細(xì)管氣相色譜柱，規(guī)格為50 m×0.32 mm×0.6 μm；進(jìn)樣口溫度為150 ℃，分流比1∶10；柱溫程序?yàn)槭紫仍?0 ℃下保持6 min，再以每分鐘15 ℃的速率升溫至180 ℃；儀器配有氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，檢測(cè)器溫度為240 ℃；載氣為高純氮?dú)猓魉贋楹懔? mL·min-1；取0.2 mL頂部平衡氣體進(jìn)樣。頂空條件為：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，溶液濃度200 g·L-1，加熱時(shí)間30 min，加熱器溫度100 ℃，傳輸線溫度105 ℃。結(jié)果 在相應(yīng)色譜條件下，各殘留溶劑均可基線分離。測(cè)得乙醇、乙酸乙酯、甲苯分別在10.06 ～2 012 mg·L-1、10.10 ～2 020 mg·L-1、1.78 ～356 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。乙醇、乙酸乙酯和甲苯的平均回收率分別為97.91%(n=9)、96.48%(n=9)、95.58%(n=9)。乙醇、乙酸乙酯、甲苯三種溶劑日內(nèi)精密度RSD分別為2.13%(n=6)、4.84%(n=6)、5.41%(n=6)，日間精密度RSD分別為1.98%(n=12)、4.51%(n=12)、5.09%(n=12)。結(jié)論 GC法操作簡便、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于奧格列汀原料藥中殘留溶劑的測(cè)定。

奧格列汀原料藥;有機(jī)溶劑殘留;頂空氣相色譜法

奧格列汀(Omarigliptin)是美國默沙東公司開發(fā)的糖尿病治療藥物。奧格列汀每周只需口服一次，可產(chǎn)生持續(xù)的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制作用，增加了患者的適應(yīng)性。奧格列汀具有全新的降血糖機(jī)制，其作用機(jī)制是通過抑制體內(nèi)DPP-4酶對(duì)胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的降解作用，延長GLP-1的作用時(shí)間，從而提高血液中內(nèi)源性GLP-1和葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽(GIP)的濃度，并最終改善血糖控制。同時(shí)其具有不增加體質(zhì)量、不會(huì)引起低血糖反應(yīng)、不會(huì)引起水腫等優(yōu)越性[1-5]。

在制備奧格列汀過程中使用了多種有機(jī)溶劑，包括乙醇、乙酸乙酯、甲苯。過量攝入有機(jī)溶劑對(duì)人體有害，因此中國藥典規(guī)定了原料中有機(jī)溶劑的限量。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[6-7]建立了頂空毛細(xì)管氣相色譜法(GC)對(duì)3批奧格列汀存在的乙醇、乙酸乙酯、甲苯殘留溶劑進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 本研究采用GC-2014型氣相色譜儀(日本島津公司)，色譜儀配有FID檢測(cè)器和頂空進(jìn)樣器。色譜過程所用載氣為高純氮?dú)?，檢測(cè)器所用的氫氣和空氣均為發(fā)生器自制。色譜過程中使用色譜柱為DB-5型彈性石英毛細(xì)管氣相色譜柱(美國安捷倫公司)，規(guī)格為50 m×0.32 mm×0.6 μm。稱重所用天平為XS5型分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.2 試藥 奧格列汀為企業(yè)自制(原料藥，純度大于99.5%，批號(hào)20150921，20151015，20151225，由南京豐特藥業(yè)有限公司提供)；乙醇、乙酸乙酯、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均為色譜純，購自Merck公司。

2 方法結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：DB-5彈性石英毛細(xì)管氣相色譜柱(50 m×0.32 mm×0.6 μm)；進(jìn)樣口溫度：200 ℃，分流比1∶10；柱溫程序：起始溫度40 ℃保持6 min，再以每分鐘15 ℃的速率升溫至180 ℃；檢測(cè)器：FID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度：250 ℃；載氣：N2，恒流：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：0.2 mL頂部平衡氣體。頂空條件如下： DMF為溶劑，溶液濃度200 g·L-1，加熱時(shí)間30 min，加熱器溫度100 ℃，傳輸線溫度105 ℃。

2.2 溶液的配制 取乙醇500 mg，精密稱定，置于50 mL潔凈容量瓶中，迅速加DMF溶解并稀釋至刻度，得乙醇對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。同法制得乙酸乙酯儲(chǔ)備、甲苯對(duì)照儲(chǔ)備溶液。乙醇儲(chǔ)備液、乙酸乙酯儲(chǔ)備液、甲苯儲(chǔ)備液濃度分別為10.06、10.10、1.78 g·L-1。精密量取乙醇、乙酸乙酯、甲苯儲(chǔ)備液各0.1 mL，置同一100 mL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，作為相當(dāng)于限度濃度1%的對(duì)照品工作溶液。同法分別量取0.5、1、2.5、5、10、20 mL作為5%、10%、25%、50%、100%、200%的系列對(duì)照品工作溶液。取奧格列汀自制品(批號(hào):20150921)2 000 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中。加入適量DMF，微微振搖使溶解并用DMF稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2” 項(xiàng)下100%對(duì)照品溶液2 mL置于頂空瓶中，迅速密封瓶口，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。其中乙醇、乙酸乙酯、甲苯的保留時(shí)間分別為3.991、5.059、9.432 min，各對(duì)照品之間分離度均大于1.5，計(jì)算理論塔板數(shù)均大于10 000。從空白樣品中可以看出DMF對(duì)測(cè)定無干擾。表明該法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系 分別精密移取“2.2”項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液2 mL置于頂空瓶中，迅速密封瓶口，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以各溶劑的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸。線性回歸結(jié)果為：乙醇在10.06 ～2 012 mg·L-1范圍內(nèi)線性方程為Y=1 827X+356(r=0.999 7)；乙酸乙酯在10.10 ～2 020 mg·L-1范圍內(nèi)線性方程為Y=13 489X-5 341(r=0.999 4)；甲

A.對(duì)照品

B.供試品

C.空白樣品

注：1.乙醇;2.乙酸乙酯;3.甲苯;4.DMF。

圖1 氣相色譜圖

苯在1.78～356 mg·L-1范圍內(nèi)線性方程為Y=65 829X-2 758(r=0.999 5)。結(jié)果表明，乙醇、乙酸乙酯、甲苯分別在10.06～2 012 mg·L-1、10.10 ～2 020 mg·L-1、1.78 ～356 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 回收率 取奧格列汀自制品(批號(hào)：20150921)2 000 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中。再從“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液中分別精密量取0.8 mL放入奧格列汀自制品容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL置于頂空瓶中，密封瓶口，作為80%回收率的溶液。同法稱量2 000 mg自制品分別加入1.0、1.2 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液制備100%、120%的加樣回收測(cè)定溶液。將各加樣回收溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，使用外標(biāo)法定量。計(jì)算得乙醇回收率為97.91%，RSD為1.54%(n=9)；乙酸乙酯的回收率96.48%，RSD為2.60%(n=9)；甲苯的回收率95.58%，RSD為3.74%(n=9)。具體數(shù)據(jù)見表1。

2.6 儀器精密度 精密量取“2.2”項(xiàng)下100%對(duì)照品溶液2 mL置于頂空瓶中，迅速密封瓶口，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件將同一溶液重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算各溶劑色譜峰面積的RSD。結(jié)果表明乙醇、乙酸乙酯、甲苯的峰面積RSD分別為1.3%、0.8%、0.6%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 日內(nèi)精密度和日間精密度 取奧格列汀自制品(批號(hào)：20150921)2 000 mg，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，共處理12份，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)日測(cè)定6份、隔日測(cè)定6份，外標(biāo)法計(jì)算各殘留溶劑含量。測(cè)得日內(nèi)精密度結(jié)果為：乙醇的平均含量為0.021%，RSD為2.13%(n=6)；乙酸乙酯的平均含量為0.052%；RSD為4.84%(n=6)，甲苯的平均含量為0.0083%，RSD為5.41%(n=6)日間精密度結(jié)果為：乙醇的平均含量為0.020%，RSD為1.98%(n=12)；乙酸乙酯的平均含量為0.052%；RSD為4.51%(n=12)，甲苯的平均含量為0.0082%，RSD為5.09%(n=12)。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

注：回收率(%)=(測(cè)得量-原料藥中所含溶劑量)/加入量×100%。

2.8 檢測(cè)限和定量限 精密移取“2.2”項(xiàng)下乙醇儲(chǔ)備液80 μL、乙酸乙酯儲(chǔ)備液10 μL、甲苯儲(chǔ)備液10 μL，至同一10 mL容量瓶中，用DMF定容，搖勻，再逐級(jí)稀釋制成測(cè)定溶液。分別取各測(cè)定溶液2 mL，置頂空瓶中，立即密封，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，并計(jì)算信噪比。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)的樣品濃度為定量限，此時(shí)乙醇濃度為5.04 mg·L-1，乙酸乙酯濃度為0.63 mg·L-1，甲苯濃度為0.11 mg·L-1。當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)的樣品濃度為檢測(cè)限，此時(shí)乙醇濃度為1.68 mg·L-1，乙酸乙酯濃度為0.21 mg·L-1，甲苯濃度為0.04 mg·L-1。

2.9 樣品測(cè)定 取3批自制品各2 000 mg，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1，按照外標(biāo)法計(jì)算各溶劑的含量，結(jié)果見表2。

表2 三批樣品溶劑殘留量/(%，n=3)

3 討論

3.1 氣相色譜條件的選擇和優(yōu)化 藥典中提倡使用水作為溶解樣品的溶劑，但是乙酸乙酯在水中溶解度較小，且奧格列汀水中溶解性較差，因此未選用水作為溶劑來溶解樣品。經(jīng)過嘗試多種溶劑后發(fā)現(xiàn)，DMF可以充分溶解奧格列汀自制品和三種待測(cè)溶劑，同時(shí)DMF在相應(yīng)溶劑位置無保留，因此選擇DMF可以得到良好的專屬性。

選定溶劑后，緊接著考察了頂空加熱時(shí)間。分別考察加熱時(shí)間為20、30、40、50 min時(shí)各個(gè)溶劑的揮發(fā)量。發(fā)現(xiàn)各溶劑在30 min時(shí)峰面積已經(jīng)達(dá)到平臺(tái)期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30 min后瓶中氣體揮發(fā)已經(jīng)達(dá)到了平衡，因此選擇30 min作為頂空加熱的時(shí)間。本試驗(yàn)中待測(cè)殘留溶劑沸點(diǎn)相差大，故選擇程序升溫。經(jīng)摸索，確定升溫程序?yàn)槠鹗贾鶞?0 ℃保持6 min，再以每分鐘15 ℃的升溫速率升至180 ℃。使用該條件可以縮短檢測(cè)時(shí)間，提升試驗(yàn)效率。

3.2 溶劑殘留量 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部附錄0861項(xiàng)殘留溶劑測(cè)定法規(guī)定[8]，原料藥中乙醇、乙酸乙酯、甲苯的含量分別不得超過0.5%、0.5%、0.089%。經(jīng)測(cè)定，三批奧格列汀自制品的溶劑殘留均遠(yuǎn)小于藥典規(guī)定限度。本方法中三種溶劑的檢測(cè)濃度和定量濃度均遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定，方法學(xué)中精密度、線性等各項(xiàng)均符合藥典相應(yīng)規(guī)定，以上結(jié)果表明該方法用于測(cè)定奧格列汀中溶劑殘留重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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[8] 國家藥典委員會(huì).中國藥典(四部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:附錄0861項(xiàng).

Determination of residual organic solvents in omarigliptin by headspace gas chromatography

ZHENG Fei,HUA Guodong，GONG Ying,et al

(DepartmentofPharmacy,DongfangHospitalofBeijingUniversityofTCM,Beijing100078,China)

Objective To establish a method to determine residual solvents in omarigliptin bulk drug.Methods The headspace GC was performed with DB-5 capillary column with standard of 50 m×0.32 mm×0.6 μm.The condition of GC was as follows:the inlettemperature was 150 ℃;the injection volume was 0.2 mL with separation ratio of 1∶10;the column temperature was programmed with an initial temperature below 40 ℃,maintained for 6 min,then raised to 180 ℃ with a rate of 15 ℃·min-1,and maintained for another 5 min.The detector was equipped with FID with a temperature of 240 ℃.The carrying gas was N2with the flow rate of 1 mL·min-1.DMF was used as solvent for omarigliptin with the concentration of 200 g·L-1.The solution was heated at 100 ℃ for 30 mins.The temperature of transferring line was 105 ℃.Results All solvents can be separated completely with good linear relationship in the range of 10.06 ～2 012 mg·L-1(ethanol)， 10.10 ～2 020 mg·L-1(ethyl acetate) and 1.78 ～356 mg·L-1(toluene).The average recoveries of ethanol,ethyl acetate and toluene were 97.91% (n=9),96.48% (n=9),and 95.58% (n=9) respectively.Conclusions All the results demonstrate that this method is simple,reproducible and accurate enough for the determination of residual solvents in omarigliptin bulk drug.

Omarigliptin;Residual organic solvent;Headspace GC

華國棟，男，主任藥師，研究方向：中藥學(xué)，臨床藥學(xué)，藥事管理，E-mail：zhaojhuagd@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.012

2016-06-13，

2016-08-08)