不同植物中柯里拉京的含量測定及其對人胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

林志燦,鄭 溢,李 旎,林靖怡,林河通,明艷林*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州350002; 2.廈門華僑亞熱帶植物引種園,廈門市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點實驗室,福建 廈門361002)

不同植物中柯里拉京的含量測定及其對人胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

林志燦1,2,鄭 溢1,2,李 旎1,2,林靖怡2,林河通1*,明艷林1,2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州350002; 2.廈門華僑亞熱帶植物引種園,廈門市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點實驗室,福建 廈門361002)

建立高效液相色譜(HPLC)測定柯里拉京含量的方法,比較不同植物材料中柯里拉京的含量,篩選出柯里拉京含量高的植物,并初步研究柯里拉京對人胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用.HPLC結(jié)果顯示:龍眼核、葉下珠全草、龍眼殼、欖仁樹葉和纖梗葉下珠全草的柯里拉京含量較高,依次為643,619,569,271和159μg/g.通過體外實驗初步研究了柯里拉京對人胃癌細(xì)胞生長的抑制作用,噻唑藍(lán)(MTT)法測得柯里拉京對人胃癌SGC7901細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為(42.46± 3.31)μmol/L;吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)和Hoechst33258染色結(jié)果表明,柯里拉京能誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡.建立的HPLC檢測方法能較快速、準(zhǔn)確地檢測出不同植物的柯里拉京含量,所測的12種材料中龍眼核的柯里拉京含量最高;柯里拉京具有抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的活性,并且能夠誘導(dǎo)其凋亡.

柯里拉京;高效液相色譜;含量測定;抗胃癌活性

柯里拉京(corilagin,β-1-O-galloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucose),又名鞣云實精,屬可水解鞣質(zhì),相對分子質(zhì)量634.45,分布在葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)[1]、龍眼(Dimocarpus longan Lour.)[2]、余甘子(Phyllanthus emblica Linn.)[3]和欖李(Lumnitzera racemosa Willd.)[4]等多種植物中,是老鸛草(Geranium wilfordii Maxim.)、葉下珠等中草藥及制劑的指標(biāo)成分,但關(guān)于柯里拉京單體的研究近幾年才逐漸深入.

已有研究發(fā)現(xiàn)柯里拉京具有抗氧化[5]、抗炎[6]、保護(hù)肝臟[7]等活性,特別是有良好的抗腫瘤[1]活性,在體外可顯著抑制人肝癌[8]、卵巢癌[9]、喉癌[10]、膽管癌[11]等多種癌細(xì)胞的生長,在體內(nèi)也可以明顯抑制卵巢癌和肝癌移植瘤細(xì)胞的生長,且對正常卵巢上皮細(xì)胞毒性非常低[9,12].

目前,柯里拉京的主要來源是植物提取.隨著柯里拉京的需求量越來越大,急需尋找可大量提取柯里拉京的植物,但關(guān)于柯里拉京在植物中的分布、含量等的研究報道很少.近年來,廈門華僑亞熱帶植物引種園對柯里拉京的提取制備及其抗腫瘤活性進(jìn)行了較深入的研究,并已申請柯里拉京作為抗癌植物新藥的國家發(fā)明專利[13].本研究在前期工作的基礎(chǔ)上選擇10種植物12個部位的材料,建立高效液相色譜(HPLC)測定方法對它們進(jìn)行柯里拉京的含量測定,通過比較篩選出其中柯里拉京含量較高的植物,并在體外實驗中檢測柯里拉京對人胃癌SGC7901細(xì)胞的抑制效果.

1 材料與方法

1.1材 料

6科8屬10種植物的12個部位為供試植物樣品:葉下珠全草、纖梗葉下珠(P.tenellus Roxb.)全草、銳尖葉下珠(P.debilis Klein ex Willd.)全草、鐵莧菜(Acalypha australis L.)全草、火炭母(Polygonum chinense L.)帶葉嫩枝、三白草(Saururus chinensis(Lour.)Baill.)葉、欖仁樹(Terminalia catappa L.)葉、龍眼殼、龍眼核、荔枝(Litchi chinensis Sonn.)殼、荔枝核、石榴(Punica granatum L.)籽.12種材料均由廈門華僑亞熱帶植物引種園專家鑒定;柯里拉京對照品購自成都瑞芬思生物科技有限公司(產(chǎn)品號:23094-69-1),純度＞98%;色譜純乙腈、甲醇、吖啶橙(AO)購自Sigma公司;溴化乙錠(EB)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Hoechst33258購自碧云天生物技術(shù)研究所;新生胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640購自美國Gibco公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;人胃癌SGC7901細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所.

1.2方 法

1.2.1HPLC條件

色譜柱,Waters XBridgeTMShield RP18(4.6 mm ×250 mm,5μm);二極管陣列(DAD)檢測器,檢測波長280 nm;柱溫30℃;流動相流速1 m L/min;進(jìn)樣量20μL;流動相為乙腈(A)-0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸水溶液(B).洗脫程序:0～10 min,V(A)∶V(B)=15∶85; 10.01～15 min,V(A)∶V(B)=20∶80;15.01～20 min,V(A)∶V(B)=25∶75.

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取柯里拉京對照品2.5 mg,50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇定容至10 m L,得到0.25 mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液.將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成質(zhì)量濃度為25,50, 75,100,125μg/m L,各進(jìn)樣20μL,按1.2.1條件進(jìn)行HPLC分析.記錄峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.3植物樣品制備及其柯里拉京的含量測定

精密稱取烘干粉碎的植物樣品5 g,95%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇25 m L常溫下浸漬提取3次,每次12 h.合并提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于旋蒸瓶中真空濃縮至干,50%甲醇溶解并定容至10 m L即得樣品提取液.其中,龍眼殼、龍眼核以及葉下珠的樣品提取液稀釋10倍后,與其他樣品提取液分別經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后取20μL,按1.2.1進(jìn)行HPLC分析.記錄峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中柯里拉京的含量.

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人胃癌SGC7901細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活FBS、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中,于37℃恒溫、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng).人胃癌SGC7901細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后懸浮于培養(yǎng)基中,臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞后,調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至3×104m L-1;在平底96孔板中,每孔接種100μL,使每孔中細(xì)胞總數(shù)約為3 000,培養(yǎng)過夜;次日,向每孔中加入200μL用培養(yǎng)基稀釋的柯里拉京,柯里拉京作用濃度分別為0,6.25,25,50,75, 100μmol/L.

1.2.5噻唑藍(lán)(MTT)法測定計算細(xì)胞的存活率

按1.2.4處理后,培養(yǎng)48 h,向每孔中加入20μL 5 mg/m L MTT溶液(溶于PBS),繼續(xù)培養(yǎng)4～8 h;用真空泵吸去培養(yǎng)液,加入200μL PBS洗滌后離心,并小心地吸去PBS;每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO),置于微孔振蕩器上,以500 r/min震蕩20 min,測定492 nm處的吸光度(OD);計算細(xì)胞在柯里拉京作用后的存活率(每個濃度設(shè)6個孔,重復(fù)3次):

1.2.6AO/EB和Hoechst33258染色

AO/EB熒光染色:按1.2.4處理后,培養(yǎng)24 h; AO和EB按體積比1∶1混合后,混合液與培養(yǎng)基以體積比1∶3再混合配成染色液;將細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)液去除,每孔加入200μL AO/EB染色液,孵育1～2 min,顯微鏡下拍照.

Hoechst33258染色:按1.2.4處理后,培養(yǎng)24 h,將細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)液去除;Hoechst33258與75%乙醇按體積比1∶2混合配成染色液;每孔加入200μL Hoechst33258染色液,避光孵育10 min,顯微鏡下拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1HPLC分析

按1.2.1進(jìn)行HPLC分析,如圖1中箭頭所示,樣品的HPLC譜圖中柯里拉京的峰均在7.7 min左右,說明柯里拉京的保留時間及分離度都比較理想.

2.1.1柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)不同質(zhì)量濃度對照品溶液所測得數(shù)據(jù),得出回歸方程為Y=24 742.3X+1.033 33(R= 0.994 7),表明柯里拉京在0～125μg/m L范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,可見本研究確定的HPLC條件能較好地實現(xiàn)12種材料的柯里拉京與其他成分分離,從而能較快速、準(zhǔn)確地測定樣品中柯里拉京的含量.

2.1.2精密度試驗

以20μL的100μg/m L柯里拉京對照品溶液為樣品進(jìn)行HPLC分析,重復(fù)6次,測得柯里拉京含量的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為3.3%,表明儀器精密度良好.

2.1.3重復(fù)性試驗

精密稱取龍眼核粉末6份,按1.2.3方法制備,按1.2.1測定龍眼核的柯里拉京含量,其RSD為1.9%,表明方法的重復(fù)性良好.

圖1　柯里拉京對照品(a)和各樣品(b～m)的HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectra of corilagin standard(a)and samples(b-m)

2.1.4回收率試驗

根據(jù)10種植物的取材部位的不同,選擇龍眼核、龍眼殼、葉下珠全草和欖仁樹葉4種樣品進(jìn)行回收率試驗.精密稱取5 g上述4種樣品各3份,分別加入與樣品含量相當(dāng)?shù)目吕锢φ掌?按1.2.3方法提取、制備,按1.2.1分析計算.結(jié)果表明,柯里拉京在龍眼核、龍眼殼、葉下珠全草及欖仁樹葉中的平均回收率分別為100.3%(RSD為4.6%),102.8%(RSD為3.7%),101%(RSD為5.9%),95.2%(RSD為4.0%).

2.2不同植物的柯里拉京含量

根據(jù)各供試植物樣品的峰面積,代入2.1.1所得的回歸方程,計算出12種樣品中柯里拉京的含量(表1).結(jié)果表明:在所測的12種樣品中,龍眼核與葉下珠的柯里拉京含量較高,分別為643和619μg/g,遠(yuǎn)高于其他樣品;與葉下珠同是大戟科的其他3種植物樣品中,柯里拉京含量差別甚大,葉下珠中柯里拉京的含量是鐵莧菜的286.57倍,是同屬纖梗葉下珠的3.89倍,是銳尖葉下珠的9.12倍.

2.3柯里拉京對人胃癌SGC7901細(xì)胞生長的影響

如圖2結(jié)果所示,柯里拉京對人胃癌SGC7901細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用.隨著柯里拉京濃度的升高,SGC7901細(xì)胞的存活率也相應(yīng)降低,呈濃度依賴性.在柯里拉京濃度由6.25μmol/L增加到100 μmol/L時,SGC7901細(xì)胞的存活率由97.4%下降到12.4%,其中柯里拉京濃度為25～50μmol/L時存活率下降最快.根據(jù)存活率用SPSS 19.0軟件計算得柯里拉京對SGC7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(42.46±3.31)μmol/L.

圖2　柯里拉京對胃癌細(xì)胞SGC7901的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of corilagin on the growth of SGC7901 cells

表1　不同植物材料的柯里拉京含量Tab.1 Contents of corilagin in different samples

2.4AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡

AO和EB是2種不同的熒光核酸染料:AO能透過細(xì)胞膜完整的細(xì)胞,嵌入細(xì)胞核DNA,使之發(fā)出明亮的綠色熒光;EB只能透過細(xì)胞膜破損的細(xì)胞,與細(xì)胞核DNA結(jié)合,發(fā)出橘紅色熒光.AO/EB雙染色時,凋亡細(xì)胞發(fā)橙色、橘紅色熒光.如圖3所示:人胃癌SGC7901細(xì)胞在柯里拉京濃度為50μmol/L及以上時發(fā)橙色、橘紅色熒光,凋亡特征十分明顯(圖中箭頭所指);而濃度在25μmol/L及以下時未觀察到明顯的發(fā)橙色、橘紅色熒光的細(xì)胞.以上結(jié)果表明,柯里拉京能誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡.

圖3　AO/EB染色觀察不同濃度柯里拉京作用24 h后人胃癌SGC7901細(xì)胞的凋亡情況Fig.3 Effect of various concentrations of corilagin on the apoptosis of SGC7901 cells by staining with AO/EB

圖4　Hoechest33258染色觀察不同濃度柯里拉京作用24 h后人胃癌細(xì)胞SGC7901的凋亡情況Fig.4 Effect of various concentrations of corilagin on the apoptosis of SGC7901 cells by staining with Hoechst33258

2.5Hoechest33258染色觀察細(xì)胞凋亡

Hoechst33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,對細(xì)胞的毒性較低.其為特異性DNA染料,與A-T鍵結(jié)合,對死細(xì)胞或經(jīng)70%冷乙醇固定的細(xì)胞可立即染色;而活細(xì)胞的著色是漸進(jìn)性的,在10 min內(nèi)可達(dá)飽和.在熒光顯微鏡下,活細(xì)胞核呈彌散均勻熒光,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時,細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光.如圖4所示:人胃癌SGC7901細(xì)胞在柯里拉京濃度為50μmol/L時大部分為濃染致密的顆粒塊狀熒光,凋亡特征十分明顯(如圖中箭頭所指);而在25μmol/L時僅觀察到少量的濃染致密的顆粒塊狀熒光,無明顯的凋亡現(xiàn)象.以上結(jié)果表明,柯里拉京能誘導(dǎo)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡,與AO/EB染色結(jié)果一致.

3 討論與結(jié)論

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)建立了針對柯里拉京含量測定的HPLC法.結(jié)果表明,利用該方法測定10種植物(12個部位)中柯里拉京含量,能實現(xiàn)12種材料的柯里拉京與其他成分較好的分離,且基線平穩(wěn),分析時間適中.因此,本研究建立的HPLC法可作為快速測定植物中柯里拉京含量的手段之一.

目前,植物提取還是柯里拉京的主要來源.本研究測定的12種材料經(jīng)比較后,結(jié)果顯示龍眼核與葉下珠中柯里拉京含量較高.隨著龍眼酒、龍眼罐頭、桂圓干、龍眼膏等龍眼深加工產(chǎn)品的不斷增多[14],大量的龍眼核被當(dāng)作加工廢棄物.葉下珠為一年生草本,高10～60 cm,產(chǎn)于河北、山西、陜西、華東、華中、華南、西南等省區(qū)[15],分布廣,易采集.根據(jù)本研究的結(jié)果,龍眼核與葉下珠都可以作為柯里拉京大量提取的植物來源.

柯里拉京對腫瘤細(xì)胞的生長具有廣泛的抑制效應(yīng)[16],而對正常細(xì)胞(NOE01,NOE02,NOE03)的毒性作用非常低[9],因此柯里拉京在抗腫瘤方面的應(yīng)用越來越引起重視.本研究對柯里拉京抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞生長的活性進(jìn)行檢測,MTT實驗結(jié)果表明柯里拉京對人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖具有抑制作用;AO/EB和Hoechst33258染色觀察發(fā)現(xiàn)人胃癌細(xì)胞經(jīng)柯里拉京處理后,在一定的濃度下展現(xiàn)出明顯的凋亡特征.

本研究為篩選適合進(jìn)行柯里拉京大規(guī)模提取的植物提供了科學(xué)的方法,確定龍眼核與葉下珠都可作為柯里拉京大量提取的植物來源,這對柯里拉京的規(guī)?；崛≈苽渚哂兄笇?dǎo)意義.此外,通過研究柯里拉京對人胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用,證實了柯里拉京的抗胃癌活性,為深入研究柯里拉京抗胃癌的機(jī)制提供了一定的基礎(chǔ).

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Determination of Contents of Corilagin in Different Plants and Its Inhibitory Activity on Human Gastric Cancer Cell Proliferation

LIN Zhican1,2,ZHENG Yi1,2,LI Ni1,2,LIN Jingyi2,LIN Hetong1*,MING Yanlin1,2*

(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.The Research and Development Center for Medicinal Plants and Plant Medicine,Xiamen Overseas Chinese Subtropical Plant Introduction Garden,Xiamen 361002,China)

To filter plants with high corilagin content,a high performance liquid chromatography(HPLC)method was established for determination of corilagin contents in different plants,and the anti-gastric cancer activity of corilagin was also investigated by thiazolyl blue(MTT)assay,acridine orange/ethidium bromide(AO/EB)staining,and Hoechst 33258 staining.HPLC analyses showed that longan(Dimocarpus longan Lour.)seed,Phyllanthus urinaria L.,longan shell,Terminalia catappa L.leaf and P.tenellus Roxb.contained higher levels of corilagin,which were 643,619,569,271 and 159μg/g respectively.MTT assay results showed that gastric cancer cells SGC7901 had IC50value of(42.46±3.31)μmol/L with corilagin treatment.AO/EB staining and Hoechst33258 staining showed that corilagin induced apoptosis of gastric cancer cells SGC7901.As a conclusion,the conditions of HPLC explored in this study can quickly and accurately detect corilagin content of different plants,and longan seed contains the highest level of corilagin among the 12 kinds of plant samples,and corilagin exhibits anti-gastric cancer activity.

corilagin;high performance liquid chromatography(HPLC);content determination;anti-gastric cancer activity

R 282.71

A

0438-0479(2016)06-0847-06

10.6043/j.issn.0438-0479.201603105

2016-03-22 錄用日期:2016-08-01

國家自然科學(xué)基金(81274149);廈門市重點實驗室項目(3502Z20130038);廈門市科技創(chuàng)新項目(3502Z20062008);廈門市科技計劃項

目(3502Z20142003)

xmyanlin@gmail.com

林志燦,鄭溢,李旎,等.不同植物中柯里拉京的含量測定及其對人胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,55(6):847-852.

LIN Z C,ZHENG Y,LI N,et al.Determination of contents of corilagin in different plants and its inhibitory activity on gastric cancer cell proliferation[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(6):847-852.(in Chinese)