骨髓增生異常綜合征去甲基化治療后血小板減少的中藥療效探討

賈新顏，楊文忠，沈楨巍，宗　明，馬建偉，丁媛媛，甘欣錦

骨髓增生異常綜合征去甲基化治療后血小板減少的中藥療效探討

賈新顏1，楊文忠1，沈楨巍1，宗明1，馬建偉1，丁媛媛1，甘欣錦2

目的:觀察骨髓增生異常綜合征(MDS)去甲基化治療后血小板減少的中藥療效。方法:將39例MDS去甲基化治療后血小板減少患者隨機(jī)分成兩組，對照組采用常規(guī)方法(止血敏、輸注單采血小板)治療，中藥組在對照組基礎(chǔ)上加服補(bǔ)腎健脾止血中藥治療，檢測血小板計數(shù)、血小板減少持續(xù)時間、血清IL-11水平、骨髓單個核細(xì)胞IL-11受體α基因的表達(dá)與變化。結(jié)果:與對照組比較，中藥組治療后15 d血小板計數(shù)明顯升高達(dá)（101.3±16.2）×109/L，血小板減少持續(xù)時間縮短為（12.2±2.0）d、血小板輸注量減少至17 U；2組血清中IL-11水平及骨髓單個核細(xì)胞IL-11受體α基因的表達(dá)兩組之間無明顯差異。結(jié)論:MDS去甲基化治療后配合補(bǔ)腎健脾止血中藥，可以減輕出血癥狀、加快血小板恢復(fù)，減少血小板輸注。

骨髓增生異常綜合征；去甲基化；中藥；血小板減少

去甲基化藥物DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑-地西他濱是骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)的主要治療手段，骨髓抑制是最常見的毒副反應(yīng),其中血小板的顯著減少直接威脅患者生命。常需減量應(yīng)用或被迫中斷或延誤治療，在一定程度上削弱了藥物對病變細(xì)胞的徹底清除，影響了緩解率及長期無病生存率[1]。我們于2013年10月—2015年2月，對上海市東方醫(yī)院住院的39例MDS患者,采用口服補(bǔ)腎健脾止血中藥治療，取得良好療效，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料本組共39例，經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)檢查、骨髓病例活檢、染色體及骨髓細(xì)胞簇分化抗原檢測，有明確的病理診斷[2]。分型根據(jù)2012年專家共識[3]。將39例患者采用用系統(tǒng)隨機(jī)雙盲法分為對照組18例和中藥組21例，2組性別、年齡及診斷分期無顯著統(tǒng)計學(xué)差異,見表1。

表1　兩組MDS患者臨床特征比較(n，%)

1.2治療方法對照組常規(guī)使用地西他濱去甲基化治療，用止血敏、安絡(luò)血等，部分血小板＜50× 109/L且出血傾向嚴(yán)重者輸注血小板懸液。中藥于使用地西他濱治療當(dāng)天開始加用補(bǔ)腎健脾止血中藥：黃芪30 g，當(dāng)歸10 g，枸杞子10 g，菟絲子10 g，女貞子10 g，仙鶴草30 g，茜草10 g。隨證加減，1劑/d。煎藥機(jī)水煎2次，上下午溫服。高熱則停用本方。余同對照組。

1.3觀察指標(biāo) （1）參照血小板減少程度評價標(biāo)準(zhǔn)[4]評價兩組治療前和治療后15 d外周血血小板減少的程度。Ⅰ度：(75～100)×109/L；Ⅱ度：(50～75)×109/L；Ⅲ度：(25～50)×109/L；Ⅳ度：＜20×109/L；Ⅴ度：死亡。（2）觀察治療前和治療后15 d出血癥狀，包括口腔皮膚黏膜出血、牙齦出血、鼻衄、月經(jīng)量過多，甚至消化道、呼吸道、顱內(nèi)出血等。

1.4檢測方法 （1）采用ELISA方法、IL-11 Quantikine酶聯(lián)免疫試劑盒（美國R&D公司）檢測治療前后血清IL-11水平。（2）血清IL-11R水平檢測：主要試劑為TRIzol試劑，購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄SuperScript TMⅢ First-strand購自Invitrogen公司、Taq DNA聚合酶購自TARAKA公司、熒光定量PCR采用試劑為SYBR Premix Ex TaqTM。引物為Invitrogen公司合成,照文獻(xiàn)[5]設(shè)計,序列如下：IL-11Rα-1∶5'-CCGGATTAATGTGACTGAGGTG-3'；IL-11Rα-2: 5'-GTAGCCGAGGGTGTGGTTGGAG-3'。

全血單個核細(xì)胞（MNC）分離：常規(guī)抽取全血5 mL，EDTA抗凝,用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll分離液)分離MNC加TRIzol總RNA提取液1 mL，混勻后-80℃凍存(時間小于2個月)用于RNA制備。RNA提取及定量采用TRIzol一步法：提取MNC總RNA,紫外分光光度儀測定260，280 nm吸光值(A)，計算RNA含量。cDNA合成：按照試劑盒說明書進(jìn)行操做，完成40個循環(huán)。選擇GAPDH作為內(nèi)參照：GAPDH: IL-11Rα-1∶5'-GTGTCCAGCC TGAATTCCACT-3'，GAPDH:IL-11R α-2∶5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，EB染色，分析鑒定。原始模板濃度=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct-CtGAPDH。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計數(shù)資料采用95%可信區(qū)間的估計以及進(jìn)行卡方檢驗及t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)檢驗。

2　結(jié)果

2.1出血中藥組發(fā)生出血9例，其中6例為Ⅰ～Ⅱ級皮膚黏膜出血，3例為口腔出血。對照組發(fā)生12例，其中9例為Ⅰ～Ⅱ級皮膚黏膜出血，3例為鼻腔口腔出血。無Ⅲ～Ⅳ級出血情況。2組出血發(fā)生率和出血程度對比均有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=5.321，P＜0.05)。

2.2血小板計數(shù)中藥組血小板計數(shù)明顯高于對照組組（P＜0.05），血小板減少持續(xù)時間、輸注血小板總量均低于對照組（P＜0.05）。見表2。

2.3血清IL-11水平2組治療前后血清IL-11水平比較，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.4骨髓中單個核細(xì)胞IL-11αmRNA表達(dá)水平

中藥組IL-11Rα基因表達(dá)水平(1.25±0.31)，與對照組(1.07±0.22)比較無明顯差異(P＞0.05，見圖1)。

表2　兩組患者治療前后血小板相關(guān)參數(shù)比較(±s)

表2　兩組患者治療前后血小板相關(guān)參數(shù)比較(±s)

注：與對照組組相比，aP＜0.05

組別中藥組對照組n 21 18治療前（×109）57.67±14.3 55.8±12.7治療后（×109）101.3±16.2a85.4±12.7血小板減少持續(xù)時間（d）12.2±2.0a17.1±1.8血小板輸注總量（U）17a 27

表3　兩組患者治療前后血清IL-11水平比較（±s，pg/mL）

表3　兩組患者治療前后血清IL-11水平比較（±s，pg/mL）

組別中藥組對照組n 2 1 1 8治療前8 . 0 8 ± 1 . 5 7 . 9 7 ± 1 . 7 1治療后1 0 . 1 4 ± 1 . 1 5 7 . 2 2 ± 1 . 5 8

圖1 骨髓中單個核細(xì)胞IL-11αmRNA相對定量PCR擴(kuò)增及溶解曲線

骨髓中單個核細(xì)胞IL-11αmRNA相對表達(dá)量中藥組為0.23，對照組為0.31，二者比較無明顯差異(P＞0.05)。

2.5不良反應(yīng)中藥組不良反應(yīng)為輕度惡心、胃部不適、大便干結(jié)等，對癥處理后很快好轉(zhuǎn)，未見心、肝腎等臟器損傷。

3　討論

去甲基化藥物—地西他濱是美國FDA最早認(rèn)證的能有效治療和延緩MDS疾病進(jìn)展的藥物，是目前已知最強(qiáng)的DNA甲基化特異性抑制劑，阻斷DNA甲基化可致基因激活與誘導(dǎo)細(xì)胞分化[6-7]。但去甲基化治療后骨髓抑制所致的血小板減少，是威脅MDS患者生命的一個十分嚴(yán)重的并發(fā)癥,常采用的輸注血小板懸液或細(xì)胞因子等治療，均受到各種限制而難以達(dá)到有效的血小板水平，從而極大限制了去甲基化藥物的使用[8-9]。

中醫(yī)認(rèn)為，MDS以肝郁、脾虛、腎虧為本，氣血陰陽虧虛為先，肝郁氣滯，繼則邪毒內(nèi)壅，氣血滯行，終致虛實夾雜。大量臨床藥理證實[10]，健脾補(bǔ)腎中藥有促進(jìn)骨髓干細(xì)胞和早期細(xì)胞增殖分化、自我復(fù)制的作用，中醫(yī)中藥通過整體辨證施治，可改善造血刺激因子和造血抑制因子的失衡，減少造血祖細(xì)胞凋亡，促進(jìn)早期造血細(xì)胞增殖、分化的作用并減少治療后感染、出血等并發(fā)癥。我們查閱了近10年來國內(nèi)所有雜志上發(fā)表的關(guān)于去甲基化后血小板減少的方劑，并以2006年以后的為主，從中篩選出31首最典型的方劑[11-12]。經(jīng)過統(tǒng)計，此31首方劑一共主要使用了50多種藥物，我們參照辨證，并結(jié)合其中最常見的用藥，設(shè)基本方為黃芪、當(dāng)歸、枸杞子、菟絲子、女貞子、仙鶴草、茜草。并隨證加減。本方中女貞子滋陰補(bǔ)腎;茜草、仙鶴草涼血止血；黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣以生血;甘草調(diào)和諸藥;共奏健脾益氣填精、化瘀止血之功[13-14]。希望能通過刺激正常殘存造血干/祖細(xì)胞，從而提高血細(xì)胞數(shù)量，早日擺脫輸注血小板，提高生活質(zhì)量。

白介素-11（IL-11）可刺激原始干細(xì)胞擴(kuò)增及向定向干細(xì)胞分化，促進(jìn)骨髓紅系、粒系、淋巴系、巨核細(xì)胞系的生成。并與上調(diào)骨髓細(xì)胞IL-11αmRNA的表達(dá)水平、增強(qiáng)巨核細(xì)胞增殖活化信號相關(guān)[15]。早期及晚期巨核系祖細(xì)胞和各期巨核細(xì)胞均有IL-11受體α鏈的表達(dá)[16]。我們使用補(bǔ)腎健脾止血法治療39例甲基化治療后的MDS患者。結(jié)果顯示，與對照組比較，雖然血清IL-11水平變化及骨髓中單個核細(xì)胞IL-11αmRNA相對轉(zhuǎn)錄水平較治療組略升高，但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。使用該法治療患者，血小板恢復(fù)時間加快、血小板減少持續(xù)時間縮短、血小板輸注頻率和輸注量明顯減少（P＜0.05）。且該方法不良反應(yīng)輕微,經(jīng)對癥處理后很快好轉(zhuǎn)。提示健脾益腎法治療MDS去甲基化治療后血小板減少副作用，具有良好的有效性和安全性。

研究證明，本法治療MDS去甲基化治療后血小板減少，可以改善出血癥狀，減少輸注血小板數(shù)量，促進(jìn)骨髓增生，有促進(jìn)造血細(xì)胞增殖，并且副作用輕微，是治療MDS血小板減少的中西醫(yī)結(jié)合的一種新方法。

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（收稿：2016-01-26修回：2016-05-20）

（責(zé)任編輯劉洪斌）

Effect of Traditional Chinese Medicine on Thrombocytopenia after Demethylation of Myelodysplastic Syndrome

JIA Xin-yan,Yang Wen-zhong,Shen Zhen-wei,et al.Shanghai East Hospital,Tongji University, Shanghai(200120),China

ObjectiveTo study the effect of traditional Chinese medicine for thrombocytopenia patients af?ter the treatment of myelodysplastic Syndrome(MDS)demethylation.MethodsThirty-nine patients diagnosed with thrombocytopenia after the treatment of MDS demethylation were randomly divided into two groups.The con?trol group was treated with conventional methods(dicynone,single donor platelets infusion);While the traditional Chinese medicine group was treated basing on conventional methods,traditional Chinese medicine with curative effect of invigorating the kidney and reinforcing spleen and hemostasis.The purpose of the research is to detect the expression and changes of the platelet count,platelet reducing duration,serum level of IL-11,bone marrow mononuclear cells IL-11 receptor alpha gene.ResultsCompared with control group,after treatment of tradi?tional Chinese medicine for 15 days,the platelet count significantly increased to（101.3±16.2）×109/L,the plate?let reducing duration decreased to（12.2±2.0）d，the volume of platelet transfusion decreased to 17 u.The ex?pression level of serum IL-11 and bone marrow mononuclear cells(IL-11 receptor alpha)gene showed no obvi?ous difference between the two groups.Conclusion Posttreatment of MDS demethylation combined with tradi?tional Chinese medicine which has invigorating the kidney,reinforcing spleen and hemostasis effect can reduce bleeding symptoms,accelerate the platelet recovery and reduce platelet transfusion.

Myelodysplastic Syndrome;demethylation;traditional chinese medicine;thrombocytopenia

R551.3

A

1007-6948(2016)03-0249-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.03.011

浦東新區(qū)社發(fā)局資助項目(PW2013A-1)

1.上海市東方醫(yī)院同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院血液科（上海200120）

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院血液科（上海 200320）

甘欣錦，E-mail:ganxinjin11@163.com