Delta樣配體4和基質金屬蛋白酶2、白細胞分化抗原34在結直腸癌組織中的表達水平及相關性

王宏磊，趙永捷，王　玉，高　浩，唐　濤，張明慶，呂宏程

Delta樣配體4和基質金屬蛋白酶2、白細胞分化抗原34在結直腸癌組織中的表達水平及相關性

王宏磊1，趙永捷1，王玉1，高浩2，唐濤3，張明慶2，呂宏程3

目的：探討Delta樣配體4（DLL4）和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、白細胞分化抗原34(CD34)在結直腸癌組織中的表達及其之間的相關性。方法：應用免疫組化方法檢測90例臨床確診為結直腸癌組織中DLL4及MMP-2、CD34的表達情況并分析其與結直腸癌臨床病理特征的相關性。結果：通過免疫組化可以發(fā)現(xiàn)，DLL4（均值為4.91）和MMP-2（均值為5.34）、CD34（均值為5.40）在癌組織中的表達水平較癌旁組織、正常組織中的表達均明顯增高；DLL4和MMP-2、CD34在癌旁組織中的表達水平較正常組織中也明顯增高。DLL4表達水平與病理分期T、N分期相關，呈正相關（相關系數(shù)分別為0.226、0.262），但與MMP-2、CD34的表達水平并無相關性。結論：在結直腸癌組織中，DLL4的表達水平明顯增高，與腫瘤侵潤程度、淋巴結轉移情況相關。

Delta樣配體4；基質金屬蛋白酶2；白細胞分化抗原34；結直腸癌

結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來我國結直腸癌發(fā)病率和病死率迅速增長且發(fā)病年齡明顯提前，中位發(fā)病年齡為58歲，比西方國家要早12～18年。對于結直腸癌，傳統(tǒng)治療以外科手術為主、放化療輔助。但很多患者在就診時已喪失手術機會，且部分患者對于現(xiàn)有化療藥物敏感性差，這就迫使我們進一步尋找新的藥物作用靶點。

在已經發(fā)現(xiàn)的腫瘤分子信號通路中，Notch信號通路可與促使腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的其他關鍵性通路相互作用，調節(jié)包括結直腸癌在內的多種腫瘤細胞的增殖與進展。Notch途徑的受體Notch1在結直腸癌中的高表達是其獨立的預后影響因素[1]。Notch配體Delta樣配體4（delta like ligand-4,DLL4）是5個配體中唯一特異性存在于內皮細胞的配體，在正常機體及腫瘤血管形成的過程中發(fā)揮著重要功能，而且在這個過程中，有許多分子參與其中，如基質金屬蛋白酶2(matrix metalloid proteinase-2,MMP2)、及白細胞分化抗原34(cluster of differentiation 34,CD34)[2]。

本文研究中選擇的DLL4[3-4]、MMP2、CD34等都是與腫瘤新生血管密切相關的分子[5-6]，對尋找新的抗癌藥物靶點和提示病情有重要的指導意義。但在結直腸癌組織中的DLL4、MMP-2、CD34表達水平及其之間相關性的研究目前鮮有報道，本文將就此進行研究，并探討其之間的表達相關性。

1　資料與方法

1.1結直腸癌標本組織芯片制備收集90例天津市人民醫(yī)院2010年1—2010年9月經手術病理證實的結直腸癌組織蠟塊，其中男性47例，女性43例；平均年齡68歲（24～90歲）。所有患者均未進行新輔助治療。所有患者接受R0切除手術，檢獲淋巴結數(shù)目均大于15枚。根據(jù)HE切片對石蠟標本中有代表性的點進行標記，包括典型的腫瘤和鄰近的正常組織。制備受體蠟塊，在組織芯片制作機上用細針對受體蠟塊打孔，同樣在供體蠟塊上標記的相應部位打孔采集組織芯。將組織芯轉移到受體模塊的孔中。將構建好的TMA芯片蠟塊放在相宜的塑料盒子內，并嚴密固定防止移位。放入55℃溫箱中約10 min，在蠟將要完全溶解前，取出室溫下冷卻，使受體模塊的蠟與新插入的小圓柱狀組織溶為一體，取下蠟塊，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。切片、烤片?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2DLL4及MMP-2、CD34免疫組化染色將組織芯片進行逐步脫蠟和水化，并進行抗原修復：電爐加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10～15 min。采用免疫組化染色SP法：滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體；滴加Ι抗50 μL，室溫靜置1 h或4℃過夜或37℃1 h；PBS洗3次每次2 min；滴加Ⅱ抗45-50 μL，室溫靜置或37℃1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色5～10 min；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3病理閱片及免疫組化結果判定由兩位病理科醫(yī)師在不知臨床病理學資料的情況下對免疫組化的結果進行評估。在高倍鏡(×200)下，隨機取5個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，按陽性細胞數(shù)的平均百分數(shù)進行計分。0.0%～5.0%記0分，5.1%～ 25.0%記1分，25.1%～50.0%記2分，50.1%～75.0%記3分，＞75.0%記4分。染色強度按多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色特征計分。未著色記0分，染色呈淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。最后根據(jù)陽性細胞的百分比和染色強度計分之和進行結果判定。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用LSD-T檢驗，兩者相關性用非參數(shù)Spearman等級相關分析。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學顯著性意義的界值。

2　結果

2.1DLL4及MMP-2、CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達情況DLL4在癌組織中的表達水平較癌旁組織、正常組織均明顯增高(P＜0.05)，DLL4在癌旁組織中的表達水平較正常組織也明顯增高(P＜0.05)；MMP-2在癌組織中的表達水平較癌旁組織、正常組織中的表達均明顯增高(P＜0.05)，MMP-2在癌旁組織中的表達水平較正常組織也明顯增高(P＜0.05)；CD34在癌組織中的表達水平較癌旁組織、正常組織中的表達均明顯增高(P＜0.05)，CD34在癌旁組織中的表達水平較正常組織也明顯增高(P＜0.05)（如表1）。以上差異均有統(tǒng)計學意義。

表1　DLL4、MMP-2、CD34在腫瘤組織、癌旁組織、正常組織中的表達情況（得分，±s）

表1　DLL4、MMP-2、CD34在腫瘤組織、癌旁組織、正常組織中的表達情況（得分，±s）

DLL4 MMP-2 CD34癌組織4.91±1.36 5.34±0.96 5.40±0.93癌旁組織4.43±1.03 4.67±1.12 4.46±1.00正常組織3.14±0.91 3.09±0.75 3.41±1.01

2.2DLL4與MMP-2、CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達相關性DLL4與MMP-2在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達無相關性；DLL4與CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達無相關性；MMP-2與CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達無相關性，見表2。

2.3DLL4、MMP-2、CD34在癌組織中的表達水平與臨床參數(shù)之間的相關性DLL-4表達與病理分期T分期、N分期相關，呈正相關，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表達水平越高。與其余臨床、病理參數(shù)并不相關。見表3。

3　討論

結直腸癌是常見的惡性腫瘤，嚴重危害人們的健康生活，很多患者就診時已喪失手術機會?；熾m可有效控制腫瘤的發(fā)展，但有部分患者對于現(xiàn)有化療藥物敏感性差，這就迫使我們進一步尋找新的藥物作用靶點。

表2　DLL4、MMP-2、CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達相關性

表3　DLL4、MMP-2、CD34的表達水平與臨床、病理參數(shù)之間的相關性

Notch信號同路是目前我們發(fā)現(xiàn)的結直腸癌信號傳導同路中的一個重要通路，該通路在內皮細胞的發(fā)育分化、干細胞分化、血管形成及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。Notch途徑的受體Notch1在結直腸癌中的高表達是其獨立的預后影響因素[1]。Notch配體DLL4是5個配體中唯一特異性存在于內皮細胞的配體，目前多項研究發(fā)現(xiàn)DLL4的表達與腫瘤血管生成密切相關。體外實驗中，不同研究者通過改變DLL4的狀態(tài)觀察其對血管生成及腫瘤生長的作用，Noguera-Troise等[7]將DLL4的表達的腫瘤細胞移植到小鼠體內，腫瘤血管內皮增生、血管密度增加。Ridgway等[8]研究也顯示抑制DLL4的表達可減少人類纖維肉瘤細胞系或白血病細胞系的小鼠腫瘤的生長。Stewart等[9]還發(fā)現(xiàn)，阻斷DLL4的表達會導致血管周細胞/血管平滑肌細胞的數(shù)量減少、血管開放、管腔減少及血管功能下降，進而抑制腫瘤生長。而腫瘤血管生成是一個極其復雜的過程，包括毛細血管基底膜降解、血管內皮細胞遷移增殖、形成管狀結構、基底膜形成、血流貫通等步驟[10]。這一過程既受機體神經內分泌因素等影響，又受腫瘤細胞和腫瘤基質細胞表達的生長因子調控。DLL4對于腫瘤血管生成的調控可能與其他因素互相影響，共同作用。一項針對臍靜脈內皮細胞的研究顯示，Notch途徑參與了VEGF介導的MMPs的激活，且MMPs抑制劑能夠阻斷Notch活化導致的血管內皮細胞的形態(tài)變化[11]。目前研究已證實基質金屬蛋白酶（MMPs）在腫瘤的血管生成中發(fā)揮重要的作用。其中MMP-2是參與血管形成的主要成員。此外，MMPs能夠降解細胞外基質，MMP-2是MMPs中破壞基質降解平衡，促進腫瘤浸潤和轉移的主要因子[12]。在腫瘤血管生成及浸潤轉移的過程中，可能同樣存在Notch途徑與MMPs表達之間的互相影響，共同參與腫瘤血管生成及浸潤轉移。而且已有研究[13-15]表明DLL4的表達情況與乳腺癌、膽管癌、胰腺癌的預后都有密切關系，且在乳腺癌中DLL4的表達與MMP2相關[16-17]。但是，結直腸癌腫瘤組織中的DLL4、MMP-2、CD34表達水平及其之間相關性的研究目前鮮有報道。

本文研究發(fā)現(xiàn)DLL4和MMP-2、CD34在癌組織中的表達水平均較癌旁組織、正常組織中明顯增高，且癌旁組織中的表達也較正常組織明顯增高。但DLL4與MMP-2、DLL4與CD34、MMP-2與CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達并無明顯相關性。DLL4是VEGF信號通路的下游信號分子，也是腫瘤血管新生的條件，而MMP-2是腫瘤生長和浸潤必須的酶，同時CD34是血管內皮的標記物，理論上三者應該有密切的關聯(lián)性。但我們研究中發(fā)現(xiàn)三者之間并無明顯相關性。這可能是由于腫瘤生長是VEGF-Notch/DLL4信號通路和其他促進腫瘤生長的因素共同作用的結果，有其他因素干預或者調節(jié)這條信號同路。

我們同時對DLL4、MMP-2、CD34的在結直腸癌組織表達水平與臨床參數(shù)之間的相關性進行了分析，發(fā)現(xiàn)DLL4的表達DLL-4表達與病理分期T分期、N分期相關，呈正相關，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表達水平越高。這提示我們DLL4在結直腸癌腫瘤組織中的表達水平可能與腫瘤侵潤程度及淋巴結轉移相關，可能對患者的預后產生影響，但仍需進一步的隨訪調查來探究。

綜上，DLL4、MMP-2、CD34在癌組織中的表達水平較癌旁組織、正常組織中均明顯增高，且DLL4的表達水平與病理分期T分期、N分期呈正相關。但是，DLL4與MMP-2、CD34的表達水平與臨床預后之間的關系目前仍不清楚，仍需進一步的隨訪調查來探究。這也是我們下一步的研究方向。

[1]Chu D,Zhou Y,Zhang Z,et al.Notch1 expression,which is relat?ed to p65 Status,is an independent predictor of prognosis in colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2011,17(17):5686-5694.

[2]Oon CE,Harris AL.New pathways and mechanisms regulating and responding to Delta-like ligand 4-Notch signalling in tumour an?giogenesis[J].Biochem Soc Trans,2011,39(6):1612-1618.

[3]Kume T.Novel insights into the differential functions of Notch li?gands in vascular formation[J].Angiogenes Res,2009,1:8.

[4]Hellstr?m M,Phng LK,Hofmann JJ,et al.Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J].Na?ture,2007,445(7129):776-780.

[5]Giatromanolaki A,Sivridis E,Koukourakis MI,et al.Prognostic role of angiogenesis in operable carcinoma of the gallbladder[J]. Am J Clin Oncol,2002,25(1):38-41.

[6]Imamura M,Yamamoto H,Nakamura N,et al.Prognostie signifi?cance of Angiogenesis in gastroiniestinal stromal tumor[J].Mod Pathol,2007,20(5):529-537.

[7]Noguera-Troise I,Daly C,Papadopoulos NJ.Blockade of Dll4 in?hibits tumour growth by promoting non-productive angiogenesis [J].Nature,2006,444(7122):1032-1037.

[8]Ridgway J,Zhang G,Wu Y,et al.Inhibition of Dll4 signalling in?hibits tumour growth by deregulating angiogenesis[J].Nature, 2006,444(7122):1083-1087.

[9]Stewart KS1,Zhou Z,Zweidler-McKay P,et al.Delta-like ligand 4-Notch signaling regulates bone marrow-derived pericyte/vascu?lar smooth muscle cell formation[J].Blood,2011,117(2):719-726.

[10]Kuhnert,F,Kirshner,JR,Thurston G,et al.Dll4-Notch signaling as a therapeutic target in tumor angiogenesis[J].Vasc Cell,2011,3 (1):20.

[11]Funahashi Y,Shawber CJ,Sharma A,et al.Notch modulates VEGF action in endothelial cells by inducing Matrix Metalloprote?ase activity[J].Vasc Cell,2011,3(1):2.

[12]Langers AM,Verspaget HW,Hawinkels LJ,et al.MMP-2 and MMP-9 in normal mucosa are independently associated with out?come of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer,2012,106(9): 1495-1498.

[13]Yoon HA,Noh MH,Kim BG,et al.Clinicopathological signifi?cance of altered Notch signaling in extrahepatic cholangiocarcino?ma and gallbladder carcinoma[J].World J Gastroenterol,2011,17 (35):4023-4030.

[14]Jubb AM,Soilleux EJ,Turley H,et al.Expression of vascular notch ligand delta-like 4 and inflammatory markers in breast can?cer[J].Am J Pathol,2010,176(4):2019-2028.

[15]Chen HT,Cai QC,Zheng JM,et al.High expression of delta-like ligand 4 predicts poor prognosis after curative resection for pancre?atic cancer[J].Ann Surg Oncol,2012,19(Suppl 3):S464-474.

[16]Chang XZ,Li DQ,Hou YF,et al.Identification of the functional role of peroxiredoxin 6 in the progression of breast cancer[J]. Breast Cancer Res,2007,9(6):R76.

[17]Karahan N，Guney M，Baspinar S，et al．Expression of gelatinase and cyclooxygenase-2 in endometrial carcinoma[J].Eur J Gynae?col Oncol,2007,28(3):184-188．

（收稿：2016-02-06修回：2016-04-26）

（責任編輯李 勇屈振亮）

The Expression of Delta Like Ligand-4,Matrix Metalloid Proteinase-2 and Cluster of Differentiation 34 in Colorectal Cancer Tissues and its Correlation with clinicopathologic Feature

WANG Hong-lei, ZHAO Yong-jie,WANG Yu,et al.Department of General Surgery,Tianjin Union Medical Center,Tianjin (300121)，China

ObjectiveTo investigate the expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in colorectal cancer tissues and its correction with clinicopathologic feature.MethodsImmunohistochemical methods were used to detect the expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in 90 cases of clinically diagnosed colorectal cancer tissues and investigate their correlation with clinicopathologic feature.ResultsThe expression level of DLL4 (average 4.91),MMP-2(average 5.34)and CD34(average 5.40)in tumor tissues were significantly higher than in adjacent tissues and normal tissues.Expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in adjacent tissues was sig?nificantly higher than those in normal tissues.The expression level of DLL4 was positively corrected with patho?logical stage of T and N.(correlation index 0.226,0.262),but it was not related with the expression level of MMP-2 and CD34.ConclusionIn colorectal cancer tissues,the expression level of DLL4 was significantly increased and correlated with extent of tumor invasion and lymph node metastasis.

Delta like ligand-4；matrix metalloid proteinase-2；cluster of differentiation 34；colorectal can?cers

R735.3+5

A

1007-6948(2016)03-0211-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.03.001

天津市衛(wèi)生與計劃生育委員會重點項目(2012KR13)

天津市人民醫(yī)院1.普外科;2.肛腸外科;3.病理科（天津 300121）

趙永捷，E-mail:zhaoyongjie@umc.net.cn