維生素K2高產菌株的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化

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(1.石河子大學生命科學學院,新疆石河子 832003; 2.新疆阜豐生物科技有限公司,新疆烏魯木齊 830001)

自然界中已發(fā)現(xiàn)的維生素K有兩種,即維生素K1(葉綠醌)和維生素K2(甲萘醌),所有維生素K都具有2-甲基-1,4-萘醌母環(huán),區(qū)別僅在于3位的側鏈不同(圖1所示)[1]。維生素K2結構是由一個甲基萘醌母環(huán)和一條位于母環(huán)C3位置上的異戊二烯側鏈組成,根據(jù)側鏈上異戊二烯單元個數(shù)差異,維生素K2共分為l4種,以MK-n表示,MK-7即側鏈上含有7個異戊二烯單元[2]。維生素K的生理功能一直以來被認為與凝血有關,近年來發(fā)現(xiàn)維生素K2可以激活骨鈣素,促使血液中的鈣質沉積到骨骼,對于預防和治療骨質疏松有重要作用;同時,維生素K2可以活化血管中的蛋白質鈣化抑制蛋白基質γ-羧基谷氨酸蛋白,因而會阻礙鈣質沉淀于動脈血管,防止動脈硬化,降低心血管疾病的發(fā)病率[3]。

圖1 維生素K1(a)和K2(b)的分子結構Fig.1 Molecular structure of vitamin K1(a)and K2(b)

維生素K2可以由芽孢桿菌、乳酸菌、黃桿菌等多種細菌合成[4],在細菌的氧化磷酸化過程中作為電子傳遞鏈的組分[5-6],國內外研究中,用于合成維生素K2的主要微生物是芽孢桿菌屬微生物和黃桿菌。黃桿菌合成的維生素K2主要以MK-4和MK-6兩種形式存在,芽孢桿菌發(fā)酵生成的維生素K2主要是MK-7。在維生素K2的十四個同系物中,MK-7的生理活性好,且半衰期比其他同系物都長,因此所需的服用劑量小,是最佳的維生素K2補充物[3]。2006年,維生素K2(MK-7)已經被FDA和歐洲食品安全管理局批準使用,日本也有維生素K2藥品上市。維生素K2已經成為國際上新興的功能性保健食品。國家衛(wèi)計委2016年發(fā)布公告批準發(fā)酵型維生素K2作為食品營養(yǎng)強化劑新品種,并擬將發(fā)酵法生產的維生素K2作為營養(yǎng)強化劑加入調制乳粉、固體飲料、風味發(fā)酵乳和含乳飲料中。

維生素K2作為新興功能性保健食品,正越來越受到關注。但利用微生物發(fā)酵方法生產維生素K2還處于起步階段,最大制約是菌株的產量較低。土壤中芽孢桿菌資源豐富,本研究從土壤中篩選能夠高產維生素K2的菌株,對該菌株進行鑒定,并對其提取方法和菌株的發(fā)酵特性進行初步研究,為工業(yè)化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 取自新疆石河子市郊區(qū);維生素K1、K2(MK-7)標準品 日本和光純藥工業(yè)株式會社(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.);二氯甲烷、正己烷、異丙醇、甲醇 美國賽默飛世爾公司(Thermo Fisher Scientific Inc.);酵母粉 英國Oxoid公司;大豆蛋白胨 北京奧博星生物技術有限公司;其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司;種子培養(yǎng)基(g/L) 牛肉膏5,蛋白胨10,葡萄糖10,NaCl 5;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 甘油50,大豆蛋白胨100,酵母粉0.6,K2HPO40.3,CaCl2·2H2O 0.1,MgSO4·7H2O 0.3;菌種傳代保藏培養(yǎng)基(g/L) 蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10,瓊脂粉15。

1200型高效液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器及色譜工作站) 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選方法 將采集的土壤樣品用無菌水稀釋后在95 ℃水浴30 min,然后在種子培養(yǎng)基上劃線分離純化獲得單菌落。挑取單菌落連續(xù)劃線分離三次后進行初篩。初篩時將單菌落進行斜面培養(yǎng)后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵,發(fā)酵結束檢測其MK-7的含量。將含量較高的菌株斜面保存于4 ℃冰箱,再次傳斜面活化后進行復篩。復篩時首先將斜面菌種接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng),種子培養(yǎng)成熟后接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng),發(fā)酵結束檢測其MK-7的含量,保留產量穩(wěn)定的菌株制備甘油冷凍管(菌液添加20%甘油)保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 培養(yǎng)方法 平板與斜面培養(yǎng):將篩選獲得的菌種在種子培養(yǎng)基斜面上劃線并放在恒溫箱中37 ℃條件下培養(yǎng)8～12 h。

種子培養(yǎng):取30 mL種子培養(yǎng)基置于250 mL錐形瓶,將斜面培養(yǎng)后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中,放置在搖床中37 ℃下200 r/min培養(yǎng)16～18 h。

發(fā)酵培養(yǎng):取30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基置于250 mL錐形瓶,按10%的接種量,用移液管將培養(yǎng)好的種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,放置在搖床中37 ℃下200 r/min培養(yǎng)4 d。

1.2.3 菌種鑒定方法 對篩選獲得的菌株分別采用16S rRNA基因和gyrB基因序列進行分子生物學鑒定。將菌株采用CTAB法提取基因組DNA,以其為模板,設計正向引物和反向引物,進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增,擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工生物工程完成測序。將測得的基因序列在GenBank中進行搜索Blast比對,尋找與其同源性最高且已知分類地位的菌種,并采用MEGA6.0軟件以鄰接(Neighbor Joining)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。PCR擴增引物采用Prime premier 6軟件設計。擴增16S rRNA基因所用引物為細菌通用引物,引物序列為:27F:AGAG TTTGATCCTGGCTCAG,1492R:GGTTACCTTGTTA CGACTT。擴增gyrB基因所用引物為:F:CCCAA GCTTAACTGCACTGGGAAATYGTHGAYAAYAG,R:CGGAATTCGGATCC ACRTCGGCRTCBGTCATRAT。擴增條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;34個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR擴增片段回收后送上海生工生物工程有限公司測序。將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫對比,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 發(fā)酵樣品中MK-7提取方法 按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)方法進行發(fā)酵,采用有機溶劑液液萃取方式從發(fā)酵液中提取MK-7,選取正己烷與異丙醇(體積比為2∶1)作為萃取液,通過改變水相(發(fā)酵液)與有機相(萃取液)的比例,按水相:有機相體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進行提取,確定最佳比例,后續(xù)提取均采用最佳比例進行。萃取時將混合物置于渦旋振蕩儀上振蕩5 min,再將混合物3000 r/min離心10 min,吸取上層液體進行濃縮。利用旋轉蒸發(fā)儀對有機相進行濃縮5 min,用錫箔紙包裹蒸發(fā)瓶進行操作,濃縮后得到黃色油狀液體,加2 mL異丙醇溶解,放于1.5 mL離心管中,用錫箔紙包裹進行避光保存,用于HPLC分析[8]。

1.2.5 樣品中MK-7的分析方法 采用高效液相色譜(HPLC)法對MK-7含量進行測定。色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18;流動相為甲醇∶二氯甲烷(9∶1);流速:1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL;紫外檢測波長:248 nm。將按照上所述提取方法得到的提取液經微孔濾過膜(0.45 nm)過濾后進樣。所有操作避光進行[9]。

標準品的配制:準確稱取10 mg MK7標準品于50 mL棕色容量瓶中,加入30 mL異丙醇充分溶解定容,并在恒溫水浴鍋振蕩1 h。然后按梯度稀釋成濃度分別為1、4、8、16和32 μg/mL的標準液,用0.45 μm微孔濾膜過濾,液相色譜測定,以峰面積和標準品濃度制作標準曲線。

發(fā)酵液中的MK-7用1.2.4方法提取后用液相色譜測定,發(fā)酵液的MK-7濃度用標準曲線計算獲得。

圖2 基于16S rRNA和gyrB基因的菌株ND系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rRNA and gyrB gene sequence based phylogenetic tree for strain ND

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化方法 對高產菌種的碳源、氮源和無機鹽進行單因素優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同種類的碳源甘油5%、蔗糖5%、葡萄糖5%和可溶性淀粉(5%),根據(jù)最終發(fā)酵液中MK-7的濃度確定最佳碳源種類,并對最佳碳源的使用濃度進行考察,添加量設為5%、10%、15%、20%進行發(fā)酵,確定最佳碳源濃度。

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加8%、10%、12%、14%、16%大豆蛋白胨,根據(jù)發(fā)酵后MK-7的產量確定最佳氮源。

在添加最優(yōu)濃度的碳源和氮源條件下,對發(fā)酵培養(yǎng)基中的K2HPO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O三種無機鹽的濃度進行優(yōu)化。K2HPO4的濃度梯度設置為0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 g/L,CaCl2·2H2O的濃度設置為0、0.1、0.2、0.3和0.4 g/L,MgSO4·7H2O的濃度設置為0.1、0.3、0.5和0.7 g/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復三次,取三次實驗的平均值,采用Excel(Microsoft office 2010)軟件計算標準誤并作圖。

2 結果與分析

2.1 產維生素K2菌株的篩選與鑒定

由于合成MK-7的主要菌種為芽孢桿菌屬微生物,本研究以芽孢桿菌屬微生物為篩選目標[10-11],經過初篩和復篩,獲得產量較高的5株菌(表1)。后續(xù)實驗選定產量最高的菌株ND,并對其進行分子生物學方法進行鑒定。

表1 篩選出的菌株及其MK-7產量Table 1 Selected strains and its MK-7 yield

因為16S rRNA的高度保守性,對相似率極高的近緣種無法做進一步區(qū)分,而gyrB基因相對于16S rRNA基因具有較高的堿基替換率,因此比較適合親緣關系較近的菌種的區(qū)別和鑒定[12]。本研究采用兩種基因序列比對進行菌種的鑒定。通過PCR擴增分別獲得兩個基因序列,測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫的序列進行Blast比對,并構建系統(tǒng)進化樹。以16S rRNA序列構建的進化樹結果如圖2。從這兩種鑒定方法所獲得的結果來看,本實驗所獲得的菌株ND屬于芽孢桿菌屬的一個分支,且與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株同屬于一個類群。

2.2 樣品中MK-7的定性與定量測定

采用高效液相色譜對發(fā)酵液的提取物進行定性和定量。取菌株ND的發(fā)酵液,按1.2.4所描述的方法對發(fā)酵液進行提取,并利用高效液相色譜檢測提取物中的MK-7,結果見圖3,圖中發(fā)酵產物特征峰保留時間在14.1 min,與MK-7標準品的液相色譜圖對比,兩峰保留時間相同,發(fā)酵產物特征峰為目標產物MK-7。

圖3 發(fā)酵提取物和MK-7標準品的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of fermented extracts and MK-7 standard

按1.2.5的方法對MK-7進行液相色譜測定,以MK-7標準品濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標制作標準曲線,結果見圖4。MK-7與峰面積具有良好的線性關系,其線性回歸方程為y=34.051x+8.7149,R2為0.9994。該線性方程可用來計算樣品中的MK-7濃度。

圖4 MK-7標準曲線Fig.4 Standard calibration curve of MK-7

2.3 萃取液比例對MK-7提取的影響

MK-7是一種脂溶性維生素,所以提取MK-7主要通過使用有機溶劑液-液萃取的方式。常用的有機溶劑為異丙醇與正己烷的混合液[13-14]。為了確定萃取時最佳的萃取液與發(fā)酵液的比例,測定了不同比例下萃取效果,結果如圖5所示。在1∶1～1∶2時，隨著有機相體積比例增加,MK-7在有機相中的萃取效果逐漸提高,水相與有機相比例為1∶2時MK-7萃取效果最好,在水相∶有機相=1∶4時萃取效果最差,增大有機溶劑體積并不能提高MK-7的萃取效果。萃取時需要對反應液進行強烈渦旋震蕩,而添加過多的有機溶劑可能不利于震蕩時與發(fā)酵液及菌體充分混合和接觸,后續(xù)實驗選擇萃取比例為水相與有機相比例為1∶2。

圖5 萃取過程中不同的水相 和有機相比例對MK-7提取的影響Fig.5 Effects of different proportion of water and organic on extraction of MK-7 phase

2.4 MK-7在菌體胞內和胞外的分布

將發(fā)酵液離心分離菌體,將菌體和上清液分別進行萃取和測定MK-7含量,確定MK-7在菌體胞內外的分布,結果見圖6。MK-7大部分存在于細胞外,少量存在于細胞內。將發(fā)酵液直接萃取獲得的MK-7產量比將菌體和發(fā)酵上清液分別萃取略低。上述結果提示大部分MK-7合成后分泌到細胞外。Sato等[15]在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)40%～65%的MK-7分泌到了細胞外,周子民等[16]也在納豆芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)有MK-7在發(fā)酵過程中有68%的分泌率,本研究的結果與其報道一致。

圖6 菌體胞內和胞外MK-7的含量Fig.6 Concentration of MK-7 in intracellular and extracellular

2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 碳源對解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 比較了5%添加量的甘油、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉幾種解淀粉芽孢桿菌的常用碳源對MK-7產量的影響,比較結果見圖7。使用甘油作為碳源其效果最為理想。部分文獻報道甘油是合成MK-7的最佳碳源,本論文結果與文獻報道一致[14-16]。根據(jù)對解淀粉芽孢桿菌和MK-7的代謝途徑分析推測,甘油分解后產生的3-磷酸甘油醛可以與丙酮酸通過DXP途徑合成MK-7的異戊二烯側鏈部分[17-18],因此推測甘油除了供微生物生長之外,還為MK-7的合成提供前體,促進菌體合成MK-7,故選擇甘油作為最佳碳源。

圖7 不同碳源對菌株ND合成MK-7的影響Fig.7 Effects of different carbon source on the yield of MK-7 production by ND

對甘油的使用濃度進行了考察,從圖8可以看出,當甘油濃度為5%時,MK-7產量最高,因此選擇5%濃度的甘油作為發(fā)酵碳源。甘油濃度較高并不利于MK-7合成,可能高濃度甘油對細菌的生長有一定的抑制作用,在其他種類微生物中已有報道[19-20],碳源最終選擇濃度為濃度為5%。

圖8 碳源濃度對菌株ND合成MK-7的影響Fig.8 Effects of carbon source concentration on the yield of MK-7 production by ND

2.5.2 氮源濃度對解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 一些MK-7含量較豐富的發(fā)酵食品,例如日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆[21-22],通常以大豆作為原料進行固態(tài)發(fā)酵,而在大多數(shù)文獻中,大豆蛋白胨是合成 MK-7的最佳氮源[13-16],因此選用大豆蛋白胨作為氮源,研究了不同的大豆蛋白胨濃度對菌體合成MK-7產量的影響,結果見圖9。12%的大豆蛋白胨作為氮源,MK-7產量最高,達到了63 mg/L。大豆蛋白胨中含有豐富的蛋白質、氨基酸、生長因子,作為氮源能促進微生物生長,但氮源濃度過高,導致碳氮比失衡菌體過度生長,其他養(yǎng)分被過早耗盡,菌體衰老而不利于產物的合成[23],因此MK-7產量隨之下降。

圖9 氮源濃度對菌株ND合成MK-7的影響Fig.9 Effects of carbon source concentration on the yield of MK-7 production by ND

2.5.3 無機鹽濃度對解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 在獲得最佳碳源和氮源的基礎上,進一步考察了無機鹽對維生素K2合成的影響，結果見圖10～圖12。結果表明三種無機鹽均對MK-7的合成具有一定的影響,最佳的添加濃度分別是K2HPO4濃度為0.7 g/L,CaCl2·2H2O濃度為0.2 g/L,MgSO4·7H2O濃度為0.5 g/L。適當濃度的鈣離子和鎂離子都對MK-7合成具有一定的促進作用。添加0.2 g/L CaCl2·2H2O,菌株ND合成MK-7的產量達到70 mg/L以上,高于多數(shù)被報道過的芽孢桿菌屬微生物[24-25]。磷酸鹽是菌體生長的主要營養(yǎng)成分之一,適量的磷酸鹽在發(fā)酵過程中可以促進菌體生長,也能夠直接或間接影響代謝物的合成。金屬離子一般通過影響某些酶的活性而影響產物的合成[23]。有不少文獻報道了金屬離子對微生物發(fā)酵的影響,無機鹽一般在低濃度是對微生物生長有促進作用,在高濃度時有抑制作用,不同微生物對無機鹽的需求范圍不同[26-27]。

圖10 K2HPO4濃度對MK-7產量的影響Fig.10 Effects of K2HPO4 concentration on the yield of MK-7

圖11 CaCl2·2H2O濃度對MK-7產量的影響Fig.11 Effects of CaCl2·2H2O concentration on the yield of MK-7

圖12 MgSO4·7H2O濃度對MK-7產量的影響Fig.12 Effects of MgSO4·7H2O concentration on the yield of MK-7

3 結論

本研究通過篩選獲得一株高產MK-7的微生物,將該菌的gyrB基因和16S rRNA與其他微生物的基因進行比對,確定該菌株屬于芽孢桿菌屬,且與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株同屬于一個類群。對該MK-7高產菌株的產物提取進行優(yōu)化,最優(yōu)提取溶劑比例為有機相(正己烷∶異丙醇=2∶1):水相(發(fā)酵液)=2∶1。將發(fā)酵液的菌體和上清液分別進行萃取和測定MK-7含量,確定MK-7大部分分泌到胞外。對培養(yǎng)基中的幾個重要組分(碳源、氮源和無機鹽)及使用濃度進行單因素優(yōu)化,甘油是MK-7合成的最佳碳源,添加的最適濃度為5%;大豆蛋白胨最適濃度為12%。適當濃度的磷酸鹽和金屬離子Ca2+、Mg2+對MK-7合成有促進作用,添加的最適濃度分別是K2HPO40.7 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng),最終該菌株合成MK-7的最高產量達到70 mg/L以上。