響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化末水壇紫菜多糖除蛋白工藝及其抗氧化活性

謝 飛，曹純潔，陳美珍*，葉天文

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，廣東 汕頭 515063）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化末水壇紫菜多糖除蛋白工藝及其抗氧化活性

謝 飛，曹純潔，陳美珍*，葉天文

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，廣東 汕頭 515063）

目的：研究末水壇紫菜多糖的除蛋白方法及所制備多糖在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用。方法：響應(yīng)面法優(yōu)化末水壇紫菜多糖酶法除蛋白工藝條件；建立H2O2誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞氧化損傷模型，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果：樣品液中末水壇紫菜多糖酶法除蛋白最佳工藝條件為木瓜蛋白酶用量0.7 mg/mL、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間55 min，此時(shí)蛋白清除率為61.28%；在此基礎(chǔ)上，用4%三氯乙酸繼續(xù)除蛋白，蛋白清除率可達(dá)80.73%，多糖保留率為79.7%。與模型組相比，經(jīng)末水壇紫菜多糖處理的損傷細(xì)胞存活率顯著提高（P＜0.01），且細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論：木瓜蛋白酶-三氯乙酸聯(lián)用可有效除去末水壇紫菜多糖中的蛋白。末水壇紫菜多糖有較強(qiáng)的抗氧化能力，能清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的活性氧，修復(fù)H2O2對(duì)HeLa細(xì)胞的氧化損傷。

末水壇紫菜多糖；除蛋白；抗氧化；HeLa細(xì)胞；活性氧

壇紫菜（Porphyra haitanensis）是我國(guó)南方大規(guī)模養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)海藻之一。紫菜可分多次采收，第一次采割收獲的俗稱(chēng)為頭水紫菜，以后依次采收的分二水、三水、四水紫菜等，四水以下的越往后口感越差因而較少食用[1]。由于末水壇紫菜（一般是六水）色澤差、口感粗糙、售價(jià)低、獲利少，菜農(nóng)常放棄對(duì)其采收，使之腐爛在海里，造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。因此開(kāi)展對(duì)末水壇紫菜的利用研究其意義重要。

紫菜多糖作為一種天然活性物質(zhì)，其抗氧化及抗腫瘤等活性已有大量報(bào)道[2-4]，但針對(duì)末水壇紫菜多糖的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。陳美珍等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，壇紫菜藻體多糖和蛋白質(zhì)含量隨生長(zhǎng)期而變化，即多糖減少，蛋白質(zhì)增多，如三水壇紫菜含多糖30.56%、蛋白質(zhì)30.49%，而末水壇紫菜多糖和蛋白質(zhì)含量分別為20.67%和35.30%。末水壇紫菜蛋白質(zhì)多于多糖，使提取的多糖采用常規(guī)方法難于清除蛋白，且多糖損失量大。因此，有必要研究末水壇紫菜多糖除蛋白工藝。此外，目前關(guān)于多糖抗氧化活性的研究，大多數(shù)以體外化學(xué)法進(jìn)行，這些方法測(cè)定結(jié)果不能客觀地評(píng)價(jià)活性物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的作用，其生物相關(guān)性較差。因此，以細(xì)胞為模型的抗氧化活性測(cè)試方法在生物活性物質(zhì)抗氧化活性評(píng)價(jià)中受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

本研究以末水壇紫菜為材料提取多糖，對(duì)多糖的除蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，并在細(xì)胞水平上探討除蛋白后的多糖抗氧化活性，以期為末水壇紫菜多糖的深入研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

末水壇紫菜 廣東省南澳縣金山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；透析袋MD16 美國(guó)Spectrum公司。

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株 汕頭大學(xué)多學(xué)科中心；正常狗腎細(xì)胞MDCK 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、苯酚、無(wú)水乙醇、濃硫酸（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白（均為分析純）美國(guó)Sigma公司；半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)食品藥品檢定研究院；DMEM高糖培養(yǎng)基 美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清 杭州四季青科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Amresco公司；陽(yáng)性藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu） 上海源葉生物科技有限公司；胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液、活性氧檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2100C型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；3111二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；CK30倒置顯微鏡 美國(guó)Olympus公司；倒置熒光顯微鏡日本Nikon公司；全波段掃描酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 末水壇紫菜精多糖的制備

末水壇紫菜用水洗凈后于60 ℃條件下烘干，粉碎過(guò)40 目篩，于105 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量，置于試劑瓶中密閉保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取紫菜粉，液料比為50∶1，用80%乙醇溶液回流2 h，離心棄上清液，加入等量蒸餾水，80 ℃提取5 h，離心，取上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/3，得樣品液，4 ℃冷藏備用。取樣品液按優(yōu)化后的工藝除蛋白，自來(lái)水透析2 d，蒸餾水透析1 d，濃縮透析液，冷凍干燥后得精多糖。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定

1.3.2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

采用苯酚-硫酸法[5]，以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。經(jīng)測(cè)定得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y=0.007 05x+ 0.003 67，R2=0.999 17（y表示吸光度，x表示多糖質(zhì)量）。

1.3.2.2 樣品多糖含量測(cè)定

樣品液適當(dāng)稀釋后，測(cè)其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算多糖含量。多糖保留率按式（1）計(jì)算：

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1.3.3.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

采用改良考馬斯亮藍(lán)法：精密稱(chēng)取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，配成

200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液100、200、300、400、500、600 μL，并用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，以同體積蒸餾水為空白，加入考馬斯亮藍(lán)溶液5.0 mL，充分振蕩、混勻，然后迅速于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)量（μg），縱坐標(biāo)為吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y=0.004 6x-0.003 9，R2=0.999 4。

1.3.3.2 多糖液中蛋白含量的測(cè)定

取多糖液1 mL，按上述操作測(cè)吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)量。蛋白清除率按式（2）計(jì)算：

1.3.4 末水壇紫菜多糖除蛋白方法

1.3.4.1 TCA法

取適量樣品液，加入4% TCA溶液，80 ℃條件下反應(yīng)30 min。離心，取上清液，測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量[6]。

1.3.4.2 木瓜蛋白酶法

取適量樣品液，加入活化的木瓜蛋白酶至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，于80 ℃條件下反應(yīng)3 h，離心，取上清液，測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量[7]。

1.3.4.3 木瓜蛋白酶結(jié)合TCA法

先用木瓜蛋白酶法除蛋白，然后用TCA法進(jìn)一步除蛋白。

1.3.5 木瓜蛋白酶法除蛋白工藝優(yōu)化

1.3.5.1 單因素試驗(yàn)

選擇對(duì)蛋白質(zhì)脫除率有顯著影響的3個(gè)因素作為考察對(duì)象，實(shí)驗(yàn)方法如下：1）酶用量對(duì)脫蛋白效果的影響：取樣品液5 mL，分別加入0.5、2.5、5、10、15 mg木瓜蛋白酶，65 ℃反應(yīng)3 h，離心，取上清液測(cè)其蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算各組別蛋白清除率。2）酶解溫度對(duì)脫蛋白效果的影響：取5 mL樣品液，加入2.5 mg木瓜蛋白酶，分別于40、50、60、65、70、80 ℃條件下反應(yīng)1 h，離心，取上清液測(cè)其蛋白質(zhì)含量。3）酶解時(shí)間對(duì)脫蛋白效果的影響：取5 mL樣品液，加入2.5 mg木瓜蛋白酶，溶液于60 ℃條件下，分別反應(yīng)0.5、1、2、3、4、5 h，離心，取上清液測(cè)其蛋白質(zhì)含量。

1.3.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平安排試驗(yàn)。因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken design

1.3.6 HeLa細(xì)胞氧化損傷模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，吸出上清液，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸出上清液，加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度（100、200、300、400、600、800、1 000 μmol/L）的H2O2處理細(xì)胞。陰性對(duì)照組加入相同體積的不含H2O2的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，移除上清液加入MTT孵育4 h，吸出上清液，加入DMSO，振蕩混勻。酶標(biāo)儀作雙波長(zhǎng)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm，參考波長(zhǎng)570 nm，測(cè)其吸光度，按式（3）計(jì)算各組別的細(xì)胞抑制率。同時(shí)，倒置顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞的形態(tài)變化，并拍照[8-12]。

式中：A0為對(duì)陰性對(duì)照組吸光度；A1為給藥組吸光度。

1.3.7 末水壇紫菜多糖給藥劑量篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。隨機(jī)分組：空白對(duì)照組（只加相同體積的完全培養(yǎng)基），陽(yáng)性對(duì)照組（25 μg/mL 5-Fu），實(shí)驗(yàn)組（分別加入用完全培養(yǎng)基稀釋的100、200、400、600、800、1 000、1 200、2 000 μg/mL的多糖作用液），按分組情況分別給予處理，培養(yǎng)48 h后移除上清液，MTT法測(cè)其吸光度，計(jì)算各組別的細(xì)胞抑制率。選擇末水壇紫菜多糖對(duì)細(xì)胞無(wú)毒劑量范圍，觀察其對(duì)氧化損傷HeLa細(xì)胞是否有保護(hù)作用。

1.3.8 末水壇紫菜多糖對(duì)氧化損傷HeLa細(xì)胞的保護(hù)作用

細(xì)胞懸液貼壁18 h后，用篩選出的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的末水壇紫菜多糖作用24 h，吸出上清液，加入H2O2損傷處理24 h后，MTT法測(cè)其吸光度，計(jì)算各組別的細(xì)胞抑制率。

1.3.9 細(xì)胞內(nèi)活性氧的測(cè)定

本身沒(méi)有熒光的2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dic hlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA）可自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成 DCFH，而DCFH不能透過(guò)細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)，在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成綠色熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平成正比，因此通過(guò)檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度，可反映細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

采用細(xì)胞活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光值，并于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。用單因素方

差分析組間差異的顯著性，結(jié)果采用x±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 末水壇紫菜多糖除蛋白方法優(yōu)選

表2 不同方法除蛋白效果Table2 Efficiencies of different deproteinization methods

由表2可知，木瓜蛋白酶法除蛋白效果顯著優(yōu)于TCA法；木瓜蛋白酶-TCA法聯(lián)用其脫蛋白效果有明顯提高，但多糖保留率有所下降。綜合考慮，選用木瓜蛋白酶-TCA法作為多糖除蛋白質(zhì)方法。同時(shí)，以蛋白清除率作為考察指標(biāo)[13-16]，對(duì)木瓜蛋白酶除蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 木瓜蛋白酶法工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 酶用量對(duì)脫蛋白效果的影響

圖1 酶用量對(duì)蛋白清除率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on deproteinization efficiency

由圖1可見(jiàn)，隨著酶用量的增加，其蛋白清除率呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶用量為0.5 mg/mL時(shí)，蛋白清除率達(dá)到最大值。這是因?yàn)?，酶用量太低，反?yīng)進(jìn)行的不夠充分；酶用量太高時(shí)導(dǎo)致體系中蛋白質(zhì)總體含量升高，表現(xiàn)出蛋白清除率下降。因此，確定酶用量以0.5 mg/mL為宜。

2.2.1.2 酶解溫度對(duì)脫蛋白效果的影響

圖2 酶解溫度對(duì)蛋白清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on deproteinization efficiency

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白清除率先上升后下降，60 ℃時(shí)蛋白脫除率最高。表明60 ℃可能是木瓜蛋白酶作用的最適溫度。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on deproteinization efficiency

2.2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)脫蛋白效果的影響由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白清除率先增加后下降，最后趨于穩(wěn)定。原因可能是，酶解時(shí)間太短反應(yīng)進(jìn)行不徹底導(dǎo)致蛋白清除率不高，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使木瓜蛋白酶變性失活，導(dǎo)致蛋白清除率下降。因此酶解時(shí)間以1 h為宜。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table3 The Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design-Exepert 8.0.5b統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（表4）。以蛋白清除率為響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得相應(yīng)回歸方程。建立的數(shù)學(xué)模型為：

表4 回歸方程方差分析Table4 Analysis of variance for the fitted regression equation

表4方差分析表明，該模型回歸極顯著（P=0.001 2＜0.01），失擬項(xiàng)（P=0.132 1＞0.05）不顯著，表明二次多項(xiàng)式回歸模型正確；R2=94.63%，表明響應(yīng)值蛋白清除率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，因此該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值的實(shí)際情況。F值可以反映出各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的重要性，由表4可知，各因素的貢獻(xiàn)率為：X1＞X3＞X2，即酶用量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。

對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到模型一次項(xiàng)X1、二次項(xiàng)X12及交互作用項(xiàng)X1X2差異顯著（P＜0.01），表明酶用量以及酶用量與酶解溫度的交互作用對(duì)蛋白清除率有顯著影響，且各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

圖4 各因素交互作用對(duì)蛋白清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Three-dimensional response surface diagram showing interactive effects of different factors on deproteinization efficiency

由圖4可知，酶用量對(duì)蛋白清除率的影響極顯著，可看出其繪制的曲線(xiàn)最為陡峭；酶解時(shí)間對(duì)蛋白清除率的影響次之，而影響最小的則是酶解溫度，與酶解時(shí)間相比，其曲線(xiàn)較為平滑一些。通過(guò)響應(yīng)面法預(yù)測(cè)得到的回歸模型分析[17-18]，可預(yù)測(cè)得到紫菜多糖的最佳除蛋白工藝條件為：酶用量0.71 mg/mL、酶解溫度50.76℃、酶解時(shí)間55.8 min，預(yù)測(cè)蛋白清除率為62.01%。

根據(jù)實(shí)際情況，結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)定驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)工藝條件為：酶用量0.7 mg/mL、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間55 min。在該工藝條件下，做3 組平行實(shí)驗(yàn)，平均蛋白清除率為（61.28±1.58）%，與預(yù)測(cè)值62.01%接近，多糖保留率為（84.4±0.78）%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用響應(yīng)面法優(yōu)化紫菜多糖除蛋白回歸模型較可靠。

2.2.3 木瓜蛋白酶結(jié)合TCA法除蛋白效果

利用相應(yīng)面優(yōu)化的酶法除蛋白最佳工藝條件對(duì)樣品液除蛋白處理后，離心、收集上清液，再以TCA法進(jìn)一步除蛋白，其蛋白清除率顯著提高，達(dá)（80.73±1.82）%，多糖保留率為（79.7±0.73）%。較單純木瓜蛋白酶法效果更佳，由此得最終蛋白清除工藝為：木瓜蛋白酶（酶用量0.7 mg/mL、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間55 min）與TCA（4% TCA、80 ℃、30 min）聯(lián)用法。

2.3 HeLa細(xì)胞氧化損傷模型的建立

2.3.1 不同濃度H2O2對(duì)HeLa細(xì)胞的影響

表5 不同濃度H2O2對(duì)HeLa細(xì)胞抑制率的影響Table5 Inhibitory effect of different H2O2concentrations on HeLa cells

由表5可知，細(xì)胞抑制率隨著H2O2濃度的增大而升高，具有明顯的濃度依賴(lài)性。根據(jù)細(xì)胞半數(shù)抑制率為

633.06 μmol/L，認(rèn)為誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞損傷及凋亡模型的條件為：H2O2濃度633.06 μmol/L、作用時(shí)間24 h。為方便操作，選擇630 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的損傷濃度。

2.3.2 不同濃度H2O2對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

圖5 H2O2處理24 h對(duì)HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（10×20）Fig.5 Morphological observation of HeLa cells treated with H2O2for 24 h (10 × 20)

倒置顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞形態(tài)變化，由圖5可見(jiàn)，空白組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞排列較緊密，胞體邊緣清晰；給藥組隨著H2O2濃度的增大，貼壁細(xì)胞逐漸減少，當(dāng)H2O2濃度超過(guò)300 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)量急劇減少，細(xì)胞碎片大量增加。結(jié)果顯示，H2O2能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.4 末水壇紫菜多糖無(wú)毒質(zhì)量濃度范圍的篩選

表6 末水壇紫菜多糖對(duì)HeLa及MDCK細(xì)胞的影響Table6 Effect of PHP on HeLa and MDCK cells

由表6可知，整體來(lái)看，末水壇紫菜多糖能抑制HeLa細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常細(xì)胞MDCK的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。對(duì)兩種細(xì)胞的抑制（促進(jìn)）作用，均隨著末水壇紫菜多糖質(zhì)量濃度增加而呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，并且均在末水壇紫菜多糖質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，其作用效果最強(qiáng)。

當(dāng)末水壇紫菜多糖質(zhì)量濃度為100 μg/mL，其對(duì)HeLa的抑制率為5.70%，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，末水壇紫菜多糖對(duì)細(xì)胞有作用但尚未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性。當(dāng)末水壇紫菜多糖質(zhì)量濃度增加至200 μg/mL，末水壇紫菜多糖對(duì)細(xì)胞有較大損傷，抑制率達(dá)14.24%。因此，選擇40～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍，作為探究末水壇紫菜多糖對(duì)HeLa細(xì)胞從基本無(wú)毒變?yōu)殚_(kāi)始有較為明顯毒性時(shí)，其對(duì)由H2O2損傷的HeLa細(xì)胞修復(fù)作用的影響。

2.5 末水壇紫菜多糖對(duì)H2O2損傷的HeLa細(xì)胞的修復(fù)作用

表7 末水壇紫菜多糖對(duì)H2O2損傷的HeLa細(xì)胞的修復(fù)作用Table7 Protective effects of PHP on HeLa cells against H2O2-induced injury

由表7可知，在40～100 μg/mL范圍內(nèi)，末水壇紫菜多糖對(duì)HeLa細(xì)胞基本無(wú)毒，其對(duì)損傷細(xì)胞的修復(fù)作用隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。末水壇紫菜多糖質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞的存活率為92.96%，與模型組相比，其保護(hù)作用極為突出。當(dāng)末水壇紫菜多糖質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加時(shí)，末水壇紫菜多糖的細(xì)胞毒性開(kāi)始凸顯，其對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用開(kāi)始下降。

2.6 末水壇紫菜多糖對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

圖6 末水壇紫菜多糖對(duì)H2O2損傷的HeLa細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響Fig.6 Effects of PHP on ROS level in HeLa cells with injury induced by H2O2

酶標(biāo)儀檢測(cè)DCFH-DA處理細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，與空白組相比，模型組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明模型組細(xì)胞內(nèi)

活性氧含量增加；與模型組相比，末水壇紫菜多糖各處理組熒光強(qiáng)度均降低，說(shuō)明末水壇紫菜多糖能降低H2O2損傷細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。末水壇紫菜多糖低劑量組熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)低于高劑量組，說(shuō)明低質(zhì)量濃度的末水壇紫菜多糖能高效的清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的活性氧，隨著質(zhì)量濃度的增加其清除能力會(huì)降低；結(jié)合表7實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明在一定范圍內(nèi)較高的活性氧水平有利于HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖7 DCFH-DA染色觀察末水壇紫菜多糖處理后H2O2損傷HeLa細(xì)胞內(nèi)活性氧水平（10×40）Fig.7 Effects of PHP treatment on ROS level of HeLa cells with H2O2-induced injury observed by DCFH-DA staining (10 × 40)

由圖7可知，倒置熒光顯微鏡觀察不同處理組的熒光強(qiáng)度，模型組的熒光強(qiáng)度明顯高于其他組，進(jìn)一步證明末水壇紫菜多糖能清除HeLa細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的活性氧。

3 討 論

與傳統(tǒng)Sevag法除蛋白相比，本研究得到的除蛋白工藝更易于操作，結(jié)合超濾技術(shù)，可進(jìn)行多糖大量制備。為了簡(jiǎn)化末水壇紫菜多糖的制備工藝，本研究省略了常規(guī)多糖制備方法中的醇沉步驟，直接對(duì)多糖濃縮液進(jìn)行除蛋白處理，這可能是導(dǎo)致蛋白清除率（80.73%）偏低的原因。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，中等分子質(zhì)量的紫菜多糖其相關(guān)生物活性最強(qiáng)，雖然TCA除蛋白會(huì)使部分多糖降解，但并不影響后面對(duì)多糖活性的研究。

在正常的生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平是不斷產(chǎn)生和清除的，維持細(xì)胞內(nèi)適合的活性氧水平對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖極為重要[19]?；钚匝鯇?duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有雙重角色：一方面，活性氧能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，活性氧含量過(guò)低，不利于細(xì)胞增殖；另一方面，活性氧含量過(guò)多，則會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死[20-22]。研究顯示，活性氧幾乎和人類(lèi)大部分常見(jiàn)的疾病都有關(guān)系；很多致癌物必須在體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝活化形成自由基（主要是活性氧），并攻擊DNA才能致癌，而許多抗癌劑也是通過(guò)活性氧形式去殺死癌細(xì)胞，可以說(shuō)活性氧介入了致癌、促癌和抗癌諸過(guò)程。

H2O2是一種重要的非自由基活性物，它可以穿透大部分細(xì)胞膜，這增加了H2O2的細(xì)胞毒性，當(dāng)它穿透細(xì)胞膜后就可以與細(xì)胞內(nèi)的鐵反應(yīng)產(chǎn)生·OH（Fenton反應(yīng)），從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[23]。H2O2極易獲得、性質(zhì)穩(wěn)定且容易操作，因此被廣泛用于誘導(dǎo)不同類(lèi)型的細(xì)胞凋亡和氧化損傷，是體外氧化應(yīng)激模型理想的誘導(dǎo)劑。本研究通過(guò)H2O2刺激HeLa細(xì)胞，建立體外氧化應(yīng)激模型，探究末水壇紫菜多糖對(duì)損傷HeLa細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，對(duì)H2O2損傷的HeLa細(xì)胞，末水壇紫菜多糖能提高細(xì)胞存活率，有顯著的保護(hù)作用（P＜0.01）；活性氧測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)末水壇紫菜多糖處理后，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著下降（P＜0.01），證明末水壇紫菜多糖能清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)?；钚匝酢Ｈ欢?，低質(zhì)量濃度（40 μg/mL）末水壇紫菜多糖對(duì)活性氧清除能力較高質(zhì)量濃度（100 μg/mL）末水壇紫菜多糖更強(qiáng)，其原因尚待進(jìn)一步探討分析。

游如旭等[24]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖能誘導(dǎo)鼠肝癌細(xì)胞H22內(nèi)活性氧含量升高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。越來(lái)越多的證據(jù)表明，對(duì)比正常細(xì)胞，其對(duì)應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平更高[25]。結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)合理的推測(cè)是：末水壇紫菜多糖對(duì)活性氧的作用除了能直接清除一部分活性氧外，還能通過(guò)激活或抑制相關(guān)抗氧化機(jī)制（如提高或抑制相關(guān)抗氧化酶活力等），間接降低或提高活性氧含量。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，末水壇紫菜多糖能激活相關(guān)抗氧化機(jī)制，表現(xiàn)為較強(qiáng)的活性氧清除能力（清除能力與末水壇紫菜多糖濃度相關(guān)）；當(dāng)末水壇紫菜多糖作用于非應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞時(shí)，較高質(zhì)量濃度的末水壇紫菜多糖則會(huì)抑制相關(guān)抗氧化機(jī)制，最終表現(xiàn)為提高活性氧含量。所以末水壇紫菜多糖作用于HeLa和MDCK細(xì)胞時(shí)，表現(xiàn)出明顯的差異性。由于HeLa細(xì)胞內(nèi)活性氧含量處于較高水平，當(dāng)活性氧水平進(jìn)一步提高超過(guò)其耐受能力時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而正常MDCK細(xì)胞活性氧含量較低，適當(dāng)提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平有利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。

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Optimization of Deproteinization Process of Polysaccharides Extracted from Abandoned Porphyra haitanensis and Their Antioxidant Activity

XIE Fei, CAO Chunjie, CHEN Meizhen*, YE Tianwen
(College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)

Objective: This study aimed to investigate the deproteinization process of polysaccharides extracted from abandoned Porphyra haitanensis and to evaluate their cellular antioxidant activity. Methods: Response surface methodology was used to optimize the process conditions for the enzymatic deproteinization of P. haitanensis polysaccharides with papain. An oxidative stress model was built by stimulating HeLa cells with H2O2and the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to determine the cell survival rate. The level of cellular reactive oxygen species (ROS) was also measured by 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA). Results: The optimized deproteinization conditions were determined as follows: hydrolysis time, 55 min; temperature, 50 ℃; and papain concentration, 0.7 mg/mL; giving a percentage of deproteinization of 61.28%. After further deproteinization with 4% trichloroacetic acid (TCA), the deproteinization rate increased up to 80.73%, and the retention rate of polysaccharide was 79.7%. Compared with the model group, the survival rate of cells treated with the purified polysaccharides from P. haitanensis was significantly increased (P ＜ 0.01), and the level of ROS was significantly decreased (P ＜ 0.01). Conclusions: The combination of papain hydrolysis and TCA treatment was an effective method for the removal of protein from Porphyra haitanensis polysaccharides. Porphyra haitanensis polysaccharides had significant antioxidant activity and could relieve the H2O2-induced injury in HeLa cells by eliminating redundant ROS.

polysaccharides extracted from abandoned Porphyra haitanensis; deproteinization; antioxidant activity; HeLa; reactive oxygen species

10.7506/spkx1002-6630-201622011

R931

A

1002-6630（2016）22-0077-08

謝飛, 曹純潔, 陳美珍, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化末水壇紫菜多糖除蛋白工藝及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 77-84. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622011. http://www.spkx.net.cn

XIE Fei, CAO Chunjie, CHEN Meizhen, et al. Optimization of deproteinization process of polysaccharides extracted from abandoned Porphyra haitanensis and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2016, 37(22): 77-84. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622011. http://www.spkx.net.cn

2016-04-13

廣東省高水平大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

謝飛（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榛钚晕镔|(zhì)研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：14fxie@stu.edu.cn

*通信作者：陳美珍（1956—），女，教授，本科，研究方向?yàn)榛钚晕镔|(zhì)研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：chenmz@stu.edu.cn