結(jié)合基因芯片和生物信息學(xué)工具構(gòu)建D-半乳糖致衰老小鼠模型的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

王 晶，趙 翊，王 勇，陳 徹，李海龍*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000)

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結(jié)合基因芯片和生物信息學(xué)工具構(gòu)建D-半乳糖致衰老小鼠模型的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

王 晶1,2，趙 翊1，王 勇1，陳 徹1，李海龍1,2*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000)

為構(gòu)建衰老模型的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究以D-半乳糖致衰老小鼠為模型，利用小鼠全基因組表達(dá)譜芯片和生物信息學(xué)工具分析模型小鼠腎臟組織的分子變化.衰老模型與對照組相比，小鼠腎小球體積增大，系膜細(xì)胞數(shù)量相對減少；差異表達(dá)的基因有232個(變化倍數(shù)≥2)；GO和信號通路分析顯示差異表達(dá)基因主要參與生物節(jié)律、藥物代謝和PPAR信號通路等，其構(gòu)成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，主要有四個核心調(diào)控分子，即Arnt1、Cidea、Hspa1b和Anxa13.這些基因?qū)⑹茄芯克ダ蠙C(jī)制的潛在靶點(diǎn)，有助于抗衰老藥物篩選及治療研究.

基因芯片；生物信息學(xué)；衰老模型；分子網(wǎng)絡(luò)

衰老涉及遺傳和環(huán)境等多個復(fù)雜因素，表現(xiàn)為各個組織器官功能的衰退和紊亂，是一個不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象.揭示衰老的發(fā)生機(jī)制，干預(yù)這一過程，從而提高人民生活質(zhì)量，一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[1].給小鼠注射過量D-半乳糖，會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物半乳糖醇過量堆積，造成代謝紊亂，使體內(nèi)自由基增加，抗氧化酶活性降低，重要臟器出現(xiàn)形態(tài)和功能異常，是目前研究衰老最常用的模型之一[2].然而，由于衰老的復(fù)雜性，從系統(tǒng)生物學(xué)的水平研究D-半乳糖致衰老小鼠模型的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)卻鮮有報道.鑒于此，本研究結(jié)合生物芯片和生物信息學(xué)工具分析構(gòu)建了D-半乳糖致衰老小鼠腎組織的分子調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步篩選抗衰老藥物提供重要資料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模

SPF級昆明種小鼠40只(2月齡)(購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK(甘)2011-0001)，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2)g.適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，分籠群養(yǎng)，自由飲水、攝食，自然光照，室溫20～25 ℃.40只小鼠隨機(jī)分為對照組、衰老模型組，每組20只，雌雄各半.參考龔國慶等的方法[3]，衰老模型組每日每只小鼠頸背部皮下注射50 g·L-1的D-半乳糖(Sigma，USA)溶液，對照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)造模42 d，以行為變化和組織形態(tài)學(xué)改變?yōu)樵炷３晒Φ臉?biāo)志[4].

1.2 標(biāo)本取材與組織光鏡觀察

末次給藥2 h后，用10%水合氯醛麻醉動物，剪開腹腔迅速剖取腎臟用預(yù)冷的4 ℃生理鹽水沖洗表面.將取得的一側(cè)腎臟組織置于4%多聚甲醛

(索萊寶，北京)溶液中固定48 h，常規(guī)組織脫水、透明浸蠟、包埋，石蠟切片行伊紅-蘇木精染色(中杉金橋，北京)，封片后光鏡觀察.另一側(cè)腎組織快速液氮冷凍，備用.

1.3 基因芯片檢測

采用Affymetrix公司的Mouse Gene 2.1 ST Array Strip(生物芯片北京國家工程研究中心提供)，覆蓋約35 000個編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄本及2 000個lncRNA，平均每個轉(zhuǎn)錄本有22個探針.整個實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照博奧Affymetrix Mouse Gene 2.1 ST Array Strip微陣列芯片實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行.雜交完成的芯片采用掃描儀進(jìn)行掃描，再用AGCC 軟件(Affymetrix?GeneChip?Command Console?Software)對掃描得到的芯片圖像進(jìn)行分析，經(jīng)過歸一化和“壞點(diǎn)”剔除，選擇熒光信號值在1 000以上，Cy5/Cy3≥2.0或≤0.5以上的mRNA為表達(dá)差異mRNA.

1.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測

取2 μg純化RNA，用200 U·μL-1M-MLV(Promega)和Oligo(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA.再利用SuperGreen實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(CapitalBio)和特異的PCR引物(表1)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增檢測，反應(yīng)體系和條件參照試劑盒說明書.目的基因的相對表達(dá)量=目的基因的Ct值/Actin的Ct值(Actin為內(nèi)參基因，Ct值是指反應(yīng)管中熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)).

1.5 生物信息學(xué)分析

利用博奧晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)MAS V4.0(http://bioinfo.capitalbio.com/mas/)分析芯片中差異表達(dá)基因的GO和信號通路[5].

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件，P<0.05為差異顯著.

表1 基因擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 衰老模型的構(gòu)建

造模4周后，對照組小鼠活潑好動，皮毛順滑有光澤，無明顯脫毛現(xiàn)象，組織學(xué)切片顯示腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球體積及細(xì)胞數(shù)目正常；而模型小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、倦怠少動、食量下降、皮毛疏松欠光澤等一系列癥狀，腎臟組織形態(tài)異常，部分腎小球體積增大，系膜細(xì)胞數(shù)量相對減少，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹(圖1).根據(jù)文獻(xiàn)報道[4]，模型組動物活動能力下降和重要臟器形態(tài)改變表明造模成功.

圖1 正常小鼠與D-半乳糖致衰老模型小鼠腎組織形態(tài)比較

A．對照組小鼠腎組織光鏡結(jié)構(gòu)；B.衰老模型組小鼠腎組織光鏡結(jié)構(gòu)；標(biāo)尺=20 μm.

A.Light microscope structure of kidney in normal control group mice;B.Light microscope structure of kidney in aging modeling group mice;bar=20 μm.

2.2 基因芯片篩選衰老相關(guān)的差異表達(dá)基因

在建立D-半乳糖致衰老模型的基礎(chǔ)上，利用小鼠的全基因組表達(dá)譜芯片檢測衰老相關(guān)的差異表達(dá)基因.與對照組相比，衰老模型組有232個基因表達(dá)發(fā)生變化(篩選閾值2.0)，其中表達(dá)上調(diào)基因有172個，表達(dá)下調(diào)基因有59個.以對照組和衰老模型組的熒光強(qiáng)度值做圖，每一個數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個基因的雜交信號(即Cy5/Cy3的比值)，如圖2所示，紅色表示表達(dá)上調(diào)的基因，綠色表示表達(dá)下調(diào)的基因，黑色表示表達(dá)無明顯差異的基因.通過基因分類分析，將部分差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能總結(jié)于表2.

2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測對芯片結(jié)果的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證芯片分析結(jié)果的可靠性，隨機(jī)檢測表2中的5個基因，利用實(shí)時熒光定量PCR檢測這些基因在D-半乳糖致衰老過程中的表達(dá)變化.通過比較發(fā)現(xiàn)，這5個基因的PCR檢測結(jié)果同芯片結(jié)果的變化趨勢一致(表3).

2.4 差異表達(dá)基因顯著富集的GO與信號通路分析

利用MAS分析工具，本研究發(fā)現(xiàn)在衰老過程中差異表達(dá)基因的功能主要富集于10個GO(P<0.01，圖3A).通路顯著性分析顯示差異表達(dá)基因明顯富集于15條信號通路(P<0.01，圖3B)，分別為生物節(jié)律、藥物代謝通路、PPAR信號通路等.

圖2 基因芯片雜交信號散點(diǎn)圖

表2 部分差異表達(dá)基因的功能分類

表3 實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果與芯片分析結(jié)果比較

2.5 差異表達(dá)基因的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)已有的數(shù)據(jù)資料，利用MAS信息分析工具，構(gòu)建出D-半乳糖致衰老模型中差異表達(dá)基因之間的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果顯示，有四個核心調(diào)控分子，分別是Arnt1、Cidea、Hspa1b和Anxa13，各有4個以上基因圍繞這4個基因構(gòu)成調(diào)控關(guān)系(圖4).圖中圓圈表示基因名稱，線上的數(shù)字表示連接的兩個基因同時出現(xiàn)在同一個信號通路上的次數(shù)，連線的顏色表示來自不同的數(shù)據(jù)庫，紅色代表GENMAPP數(shù)據(jù)庫，藍(lán)色代表KEGG數(shù)據(jù)庫.基因Arnt1與基因Clock在GENMAPP數(shù)據(jù)庫里同時存在于9個通路中，在KEGG數(shù)據(jù)庫里同時存在于2個通路中.

3 討論

實(shí)驗(yàn)動物模型在現(xiàn)代疾病研究中扮演著非常重要的角色，了解清楚模型的細(xì)胞和分子變化，對下一步的藥物篩選至關(guān)重要.本研究運(yùn)用基因芯片和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法構(gòu)建了D-半乳糖致衰老小鼠模型的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò).目前人們通過這種方法已經(jīng)為研究很多常見疾病，如心血管、癌癥和不孕育等，提供了大量有用的信息[6].本研究使用的芯片是小鼠Gene 2.1 ST Array Strip的全基因組表達(dá)譜芯片，因其通量高、靈敏性強(qiáng)的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在動物疾病模型和疾病藥物篩選中[7].在研究中，數(shù)據(jù)深度挖掘所用到的工具是MAS系統(tǒng)，這是一個綜合多項常用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫開發(fā)的生物分析平臺，可以對芯片分析得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類和信號通路分析，并對分子之間調(diào)控關(guān)系進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示和編輯，以節(jié)點(diǎn)、節(jié)點(diǎn)間距離、路徑和拓?fù)鋵傩苑从吵龇肿又g的調(diào)控關(guān)系[5].

圖3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG通路分析

A.D-半乳糖致衰老過程中差異基因主要富集的10個GO條目；B.D-半乳糖致衰老過程中差異表達(dá)基因主要富集的15條KEGG通路.-lgP是P值的負(fù)倒數(shù).

A.10 GO terms enriched in aging induced by D-galactose;B.15 KEGG pathways enriched in aging induced by D- galactose.The -lgPis the negative logarithm of theP-value.

本論文篩選的基因中，有相當(dāng)一部分基因參與免疫、發(fā)育和代謝等生理活動.Cd36是一種跨膜糖蛋白，是人體內(nèi)的清道夫受體，參與脂質(zhì)代謝，研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)是糖尿病和動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素[8];內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子Esm1基因的高表達(dá)與各種類型的肝病，尤其是肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系[9]；纖維連接蛋白Fn1是一種糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它能夠全面修復(fù)各類細(xì)胞，激發(fā)細(xì)胞活力，提升細(xì)胞自體代謝功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)之間的動態(tài)平衡，改善細(xì)胞內(nèi)外微循環(huán)，具有明顯的抗衰老作用[10]，在本實(shí)驗(yàn)中，其表達(dá)受到了明顯抑制.通過進(jìn)一步的GO和信號通路分析，發(fā)現(xiàn)各類生物代謝在D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老過程中發(fā)生了顯著改變，這與其致衰老作用的機(jī)制有關(guān).研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞粘連和PPAR信號通路也參與這一過程，這與之前的研究報道一致[11,12]，涉及這些通路的差異表達(dá)基因有Cyp4a12b、Cd36和Sdc2等.除此以外，本研究還發(fā)現(xiàn)生物節(jié)律、藥物代謝通路和ECM受體相互作用等通路與D-半乳糖致小鼠衰老也有密切關(guān)系，這在之前的研究中還未被報道過.通過網(wǎng)絡(luò)分析，本研究發(fā)現(xiàn)Arnt1、Cidea、Hspa1b和Anxa13基因在D-半乳糖致衰老過程中起到核心調(diào)控分子的作用，與此聯(lián)系的基因有Shc1、Per2、Hif1a、Acta1、Traf6和Prkab1等.Arnt1和Per2都是轉(zhuǎn)錄因子，Shc1基因與細(xì)胞周期、衰老有關(guān)，Hif1a基因參與炎癥發(fā)展及腫瘤生長，Acta1編碼細(xì)胞骨架蛋白，與細(xì)胞發(fā)育分化有關(guān)[13-15].Traf6是激活NF-κB通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的交叉點(diǎn)，調(diào)解細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和死亡[16].這些基因有可能是D-半乳糖致衰老過程的重要靶點(diǎn)，可作為抗衰老藥物篩選的關(guān)鍵分子.

綜上所述，基因芯片結(jié)合生物信息學(xué)工具是衰老模型研究的有效手段，本研究結(jié)果為研究衰老機(jī)制提供較大的信息量，有助于下一步的抗衰老藥物篩選及治療研究.

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(責(zé)任編輯 俞詩源)

Analyzing the molecular regulatory networks in aging mouse induced by D-galactose using microarray combined with the MAS tool

WANG Jing1,2,ZHAO Yi1,WANG Yong1,CHEN Che1,LI Hai-long1,2

(1.School of Medical Examination,Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China;2.Labortory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province,Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China)

To explore the target genes related with aging and construct the molecular regulatory network in aging model,the aging mice induce by D-galactose are used.The genome-wide oligonucleotide microarray and MAS tool are used to analyze the network which the regulated genes are involved in aging model.The morphology of kidney of aging mice are abnormal adversely compared with normal mice.There are 232 significantly regulated genes(fold changes≥2) in aging mice verse normal mice.These differentially expresse genes participate in many important biological processes,including circadian rhythm,metabolism,and PPAR signaling pathway.There are four core genes in the network related with differentially expresse genes,includingArnt1,Cidea,Hspa1b,andAnxa13,which are potential targets of aging mechanism,and useful for drug screening.

microarray;bioinformatics;aging model;molecular regulatory networks

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.06.017

2016-05-11;修改稿收到日期:2016-7-25

甘肅省高等學(xué)校科研項目(2013A-087)；甘肅省財政廳項目(BH-2013-24);甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年科研基金資助項目(ZQ2015-20)

王晶(1982—)，女，甘肅天水人，副教授，博士.主要研究方向?yàn)橛蒙镄酒M(jìn)行藥物的篩選和疾病機(jī)理研究.E-mail:wangjing@gszy.edu.cn

*通訊聯(lián)系人，男，副教授，博士.主要研究方向?yàn)槟[瘤分子診斷.E-mail:gslz860931@163.com

R 339

A

1001-988Ⅹ(2016)06-0092-06