白菜型油菜RAV基因的克隆及表達分析

張騰國，李 萍，寇明剛，王 娟，鄭 晟

(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州 730070)

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白菜型油菜RAV基因的克隆及表達分析

張騰國，李 萍，寇明剛，王 娟，鄭 晟

(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州 730070)

基于擬南芥RAV類轉(zhuǎn)錄因子的序列，通過RACE方法獲得白菜型油菜RAV基因的cDNA序列，全長1 306 bp，其中包括5′-UTR109 bp，3′-UTR171 bp，開放閱讀框1 026 bp，編碼341個氨基酸，預測蛋白分子量為38.03 u，理論等電點為9.2，含有相對保守的AP2和B3結(jié)構(gòu)域.多序列比對和系統(tǒng)進化分析表明，油菜RAV與擬南芥RAV1具有很高的一致性，為88.0%.實時熒光定量PCR結(jié)果表明，油菜RAV基因受低溫和鹽脅迫的誘導，推測該基因在響應非生物脅迫中發(fā)揮重要作用.

油菜；RAV轉(zhuǎn)錄因子；克??；表達分析

植物體內(nèi)的一些基因能夠?qū)Ω鞣N生物和非生物脅迫做出快速的應答，從而使植物適應逆境帶來的傷害，其中轉(zhuǎn)錄因子就是重要的調(diào)節(jié)因子[1].轉(zhuǎn)錄因子也稱之為反式作用因子，是和專一性DNA序列結(jié)合并能激活或抑制其他基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子.根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子保守DNA結(jié)合域的不同可分為WRKY家族、bZIP家族、MYB家族、AP2/ERF家族等.RAV是AP2/ERF家族的RAV亞家族類[2]，該類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點是其N末端含有AP2結(jié)構(gòu)域，可以特異地結(jié)合GCC-box的區(qū)域；C端含有B3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域同樣存在于ARFs以及VP1/AB13家族，能結(jié)合CACCTG[3]，主要調(diào)控植物對ABA和生長素的反應[4].

研究發(fā)現(xiàn)，AP2/EREBF基因參與了由逆境脅迫所引起的一系列反應[5-8].Sohn等在胡椒中分離出CaRAV1，研究結(jié)果表明病原菌、ABA和SA脅迫均可誘導CaRAV1的表達[9].另外，胡椒的一個氧化還原酶CaOXR1可以與轉(zhuǎn)錄因子CaRAV1的N端AP2結(jié)構(gòu)域結(jié)直接相互作用，通過調(diào)控一系列與脅迫相關(guān)基因的表達來提高過表達CaRAV1轉(zhuǎn)基因擬南芥對于非生物和生物脅迫的抗性[10].目前RAV基因也在擬南芥、煙草、蓖麻等多種植物中得到了克隆.但是關(guān)于RAV基因在白菜型油菜中的調(diào)控作用還未見報道.

油菜屬于十字花科植物，是全世界種植比較廣泛的一種油料作物，也是我國的第五大作物[11].本實驗以抗寒性強的隴油6號和抗寒性弱的天油2號油菜為研究材料，通過RACE方法克隆白菜型油菜RAV基因，用實時熒光定量PCR方法分析其在低溫、鹽脅迫過程中的表達情況，為研究RAV基因在白菜型油菜抗寒、抗鹽分子機理中的作用提供一定的理論依據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)與處理

挑選籽粒飽滿的隴油6號和天油2號兩種油菜種子若干，用1% NaClO消毒15 min，自來水沖洗3次后，播種到盛有營養(yǎng)土的塑料盆內(nèi)，置于14 h/10 h(光照/黑暗)和130 μmol·m-2·s-1的光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)30 d左右后分別進行以下兩種處理：① 在4 ℃條件下進行0,12,24,36和48 h不同時段的低溫脅迫；② 0,50,100,150和200 mmol·L-1NaCl的Hoagland營養(yǎng)液對油菜幼苗進行24 h鹽脅迫；分別剪取上述處理的油菜葉片，用錫箔紙包好，液氮冷凍20 min左右，于-80 ℃冰箱保存，用于總RNA的提取.

1.2 白菜型油菜RAV基因的克隆

按照Trizol試劑說明書(TaKaRa公司)提取隴油6號油菜葉片總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

從NCBI網(wǎng)站下載已經(jīng)克隆得到的擬南芥RAV1(AB013886)、擬南芥RAV2(AB013887)、大豆RAV(NM_001250671)等植物的RAV基因序列，通過DNAStar的Clustal W模塊進行多序列比對，并設計三對簡并引物，分別為RAV-U1和RAV-D1、RAV-U2和RAV-D2、RAV-U3和RAV-D3(表1).根據(jù)寶生物工程大連有限公司的Premix Ex Taq DNA Polymerase操作說明書，以上述三對引物為引物，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進 行PCR擴增從而獲得中間片段.PCR反應體系為20 μL，其中包括Ex Taq酶9.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，去離子水7.5 μL.擴增反應條件為 94 ℃預變性3 min；然后按照95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.

利用TakaRa公司3′Full RACE試劑盒和Invitrogen公司5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒操作方法進行RACE擴增，從而獲得油菜RAV基因的3′端序列和5′端序列.3′RACE根據(jù)已得到的油菜RAV的中間片段序列設計兩個特異性引物3′RACEOUT和3′RACEIN(表1)，試劑盒中自帶的引物3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer(表1)分別作為匹配的下游引物.反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，用引物3′RACEOUT和3′RACE Outer Primer進行PCR擴增，以PCR產(chǎn)物為模板，用引物3′RACEIN和3′RACE Inner Primer再進行PCR擴增.5′RACE根據(jù)已得到的油菜RAV的中間片段序列設計兩個特異性引物5′RACEOUT和5′RACEIN(表1)，試劑盒中自帶的引物AAP和AUAP(表1)分別作為匹配的上游引物.按照試劑盒操作說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用引物5′RACEOUT和AAP進行PCR擴增，以PCR產(chǎn)物為模板，用引物5′RACEIN和AUAP再進行擴增PCR.

中間片段、3′RACE和5′RACE的PCR產(chǎn)物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，在凝膠成像儀下對電泳條帶的大小進行檢測，用甘肅智信達公司的Bioteke Corporation回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，將產(chǎn)物與pTG19-T載體連接.反應體系與反應條件為緩沖液1 μL、回收產(chǎn)物7 μL、pTG19-T載體1 μL和T4 DNA連接酶1 μL，4 ℃過夜連接.連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans 5α，在涂有IPTG和X-gal的LB(Amp+)固體培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)，藍白斑篩選后，在LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，進行菌液PCR，選取陽性克隆，送華大基因公司測序.

表1 用于白菜型油菜RAV基因克隆的引物

1.3 白菜型油菜RAV蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST檢索油菜RAV的同源蛋白序列，并利用DNAStar軟件將油菜RAV的蛋白質(zhì)序列與其他植物的RAV蛋白質(zhì)序列進行比對從而分析同源性；同時用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用TopPred分析油菜RAV蛋白的基本理化性質(zhì)；用信號肽預測網(wǎng)站SingalP分析油菜RAV蛋白的信號肽；用跨膜螺旋預測網(wǎng)站TMHMM預測油菜RAV蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；用SOPMA和SWISS-MODEL分別對油菜RAV蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)進行預測.

1.4 白菜型油菜RAV基因的表達分析

對生長良好的油菜幼苗進行低溫和鹽兩種處理，采用實時熒光定量PCR的方法對RAV基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達特征進行研究.提取經(jīng)兩種處理后的油菜幼苗葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，按照操作說明進行定量分析.以Actin-U和Actin-D(表1)為管家基因引物，RAV-U和RAV-D為RAV基因引物，在Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀上進行定量PCR.定量PCR的擴增體系為25 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL.擴增程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火20 s，循環(huán)40次；55～95 ℃每30 s升高0.5 ℃，81個循環(huán).每個樣品均重復3次，按照文獻[12]的方法確定基因相對表達量.

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜型油菜轉(zhuǎn)錄因子RAV基因的克隆

2.1.1 白菜型油菜總RNA的提取 以隴油6號油菜為材料提取總RAN，提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)有28 S和18 S兩條明亮的條帶，而且28 S條帶的亮度約是18 S的2倍，由此說明提取的RNA比較完整，可以用作后續(xù)試驗.

③企業(yè)所得稅研發(fā)費用加計扣除規(guī)定：“企業(yè)發(fā)生的研究開發(fā)費用，未形成無形資產(chǎn)計入當期損益的，在按照規(guī)定據(jù)實扣除的基礎(chǔ)上，按照研究開發(fā)費用的50%加計扣除，形成無形資產(chǎn)的，按照無形資產(chǎn)成本的150%攤銷?！?/p>

2.1.2 白菜型油菜轉(zhuǎn)錄因子RAV基因中間片段的克隆 以隴油6號油菜中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用三對簡并引物RAV-U1和RAV-D1、RAV-U2和RAV-D2、RAV-U3和RAV-D3分別進行PCR擴增，得到了3條大小分別為476 bp、471 bp、364 bp的條帶(圖1)，測序后經(jīng)過核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)這三條片段重疊部分的核苷酸序列完全相同，用序列拼接軟件進行拼接得到一條長度為908 bp的中間片段，將測序結(jié)果和其他植物的RAV基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)與AtRAV1有較高的同源性，所以，初步判斷該擴增產(chǎn)物是油菜RAV基因片段.

圖1 白菜型油菜RAV基因部分中間片段的獲得

M.DL2000 Marker;1～3.目的條帶(cDNA fragment ofRAVgene)

2.1.3 白菜型油菜轉(zhuǎn)錄因子RAV基因3′RACE和5′RACE的克隆 根據(jù)擴增得到的油菜RAV基因的部分序列，以隴油6號油菜的cDNA為模板，分別設計引物進行5′RACE和3′RACE的克隆，獲得的5′RACE和3′RACE擴增產(chǎn)物大小約為350 bp和300 bp(圖2).測序結(jié)果與擴增得到的RAV基因片段進行序列比對，核苷酸序列的重疊部分相同，由此說明5′RACE和3′RACE得到的序列屬于油菜RAV基因序列.

圖2 白菜型油菜RAV基因5′RACE和3′RACE的擴增

M.DL2000 Marker；1.5′RACE產(chǎn)物(5′RACE product)；2.3′RACE產(chǎn)物(3′RACE produce)

2.1.4 白菜型油菜轉(zhuǎn)錄因子RAV基因全長的拼接 將擴增得到的油菜中間序列、3′RACE和5′RACE序列進行拼接，得到全長為1 306 bp的cDNA全長序列，其編碼區(qū)為1 026 bp，編碼341個氨基酸(圖3).起始密碼子ATG前有一段109 bp的5′非翻譯區(qū)，終止密碼子TAA后面有一段171 bp的3′非翻譯區(qū)，包含11 bp的polyA尾巴.

圖3 油菜RAV的cDNA序列和編碼氨基酸序列

2.2 白菜型油菜RAV與其他RAV蛋白的氨基酸比對

利用DNAStar軟件分析白菜型油菜RAV的保守域，結(jié)果顯示(圖4)，白菜型油菜的RAV轉(zhuǎn)錄因子在氨基酸序列N端具有AP2核心結(jié)合域，在氨基酸序列C端有另外一個保守序列B3結(jié)構(gòu)域，具有AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子中RAV亞族的典型特征.氨基酸序列比對分析表明，白菜型油菜RAV與擬南芥RAV1(GeneBank登錄號：BAA34250)、擬南芥RAV2(GeneBank登錄號：BAA34251)、棉花RAV(GeneBank登錄號：AFH57270)、胡椒RAV(GeneBank登錄號：AAW83473)同源性分別為88.0%,62.5%,64.2%,61.0%.

圖4 白菜型油菜RAV蛋白與其他同源蛋白序列的比對

注：AP2和B3結(jié)構(gòu)域分別用下劃線和下劃點標出(AP2 and B3 domains are underlined with lines and dots，respectively)

2.3 白菜型油菜RAV系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為確定白菜型油菜與已經(jīng)報道的擬南芥、胡椒、棉花、大豆、煙草、番茄等中RAV蛋白的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，利用MEGA4軟件對RAV蛋白質(zhì)序列進行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.結(jié)果顯示(圖5)，在進化上白菜型油菜RAV與AtRAV1的親緣關(guān)系最近.

2.4 白菜型油菜RAV的生物信息學分析

應用DNAStar軟件，預測油菜RAV蛋白分子量為38.03 u，等電點pI為9.2；含有酸性氨基酸(D，E)41個，堿性氨基酸(K，R)48個，疏水氨基酸(A，I，L，F(xiàn)，W，V)100個，極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)101個，帶電荷氨基酸(R，K，H，Y，C，D，E)108個.

應用在線預測網(wǎng)站TopPred、SingalP和TMHMM分別對油菜RAV預測蛋白的疏水性、信號肽以及跨膜螺旋進行預測，結(jié)果顯示油菜RAV預測蛋白為親水性蛋白，屬于膜外蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，不含跨膜螺旋，沒有信號肽序列.而信號肽是引導前體蛋白通過細胞膜分泌到胞外的一段序列，這說明油菜RAV預測蛋白為非分泌性蛋白.用SOPMA對油菜RAV預測蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果顯示油菜RAV預測蛋白包含25.51%的α-螺旋、26.69%的β-折疊、9.09%的β-轉(zhuǎn)角和38.71%的無規(guī)則卷曲.由此可以看出油菜RAV預測蛋白主要由α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成.SWISS-MODEL只預測了油菜RAV蛋白的179～294之間的氨基酸序列模型，預測結(jié)果顯示RAV是一種DNA結(jié)合蛋白.

圖5 白菜型油菜RAV與其他植物RAV蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

AtRAV 擬南芥(A.thaliana);GmRAV 大豆(Ricinuscommunis);MtRAV 苜蓿(Medicagotruncatula);MdRAV 蘋果(Malusdomestica);PtRAV 楊樹(Populustrichocarpa);RcRAV 蓖麻(Ricinuscommunis);TcRAV 可可(Theobromacacao);GhRAV 棉花(Gossypiumhirsutum);VvRAV 葡萄(Vitisvinifera);CaRAV 胡椒(Capsicumannuum);SlRAV 番茄(Solanumlycopersicum);NtRAV 煙草(Nicotianatabacum)

2.5 逆境脅迫下白菜型油菜RAV基因的表達

采用不同時段(0,12,24,36,48 h)的4 ℃低溫處理兩種油菜，研究RAV基因?qū)涿{迫的響應情況.由圖6可知，隨著處理時間的增長，兩種油菜中RAV基因的相對表達量提高幅度不同，且在隴油6號油菜中增長幅度比天油2號油菜中更顯著，其表達量分別在冷處理12 h和24 h時達到最大值，分別為對照的5.871和4.982倍.以上結(jié)果說明，在冷處理過程中，RAV基因在隴油6號和天油2號油菜的抗寒機制中發(fā)揮了一定作用.

鹽脅迫是植物由于生長在高鹽度壞境而受到高滲透勢的影響，會對植物造成多方面的傷害.由圖7可知，兩種油菜經(jīng)不同濃度的NaCl溶液(50,100,150和200 mmol·L-1)處理24 h后，RAV基因的表達明顯受到NaCl脅迫的誘導，各個濃度的NaCl處理條件下RAV基因的相對表達量較對照都有大幅度提高，且在100 mmol·L-1處理條件下達到最大.在隴油6號油菜中，處理組RAV基因相對表達量分別為對照的4.563,17.569,4.812和2.799倍，高于天油2號油菜.說明油菜RAV基因在油菜適應鹽脅迫的過程中發(fā)揮作用.

圖6 低溫脅迫下油菜RAV基因的表達分析

同色柱形圖中不同字母表示差異顯著P<0.05(下圖同)(Different letters in the same color histogram indicate significant differences(P<0.05)

圖7 鹽脅迫下RAV基因在油菜中的表達分析

3 討論

冷凍和高鹽脅迫是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要災害，不僅對植物生長發(fā)育有重要的影響，而且限制物種的栽種范圍.因此克隆與抗逆相關(guān)的基因、了解植物對非生物逆境脅迫的響應以及信號在植物體內(nèi)的傳導途徑具有重要意義.AP2/ERF是植物特有的一類重要逆境調(diào)節(jié)因子，可能同時參與植物發(fā)育過程和植物逆境調(diào)控過程[13-15].最近的研究發(fā)現(xiàn)，茶樹、胡椒和東方山羊豆中的RAV基因可以提高植物對非生物逆境的抗性[9,16-17].茶樹中CsRAV基因受到乙烯、低溫和NaCl的誘導[16].胡椒CaRAV1基因可被高鹽誘導表達，還可以被水楊酸和乙烯誘導，在ABA脅迫下也會被輕微誘導，但不受低溫和干旱的誘導[9].東方山羊豆中CoRAV基因不僅在低溫、高鹽、干旱條件下表達，而且在ABA、MeJA和SA存在下也會被誘導表達[17].由此說明，不同植物中的RAV基因在非生物脅迫的應答以及信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮著不同的作用，也說明植物逆境調(diào)控的復雜性.

本研究利用RACE技術(shù)從隴油6號油菜中克隆得到一個新RAV基因.通過多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中的RAV類轉(zhuǎn)錄因子AtRAV1氨基酸序列的一致性達到了88.0%，且含有AP2和B3結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/ERF家族的RAV亞家族類.對所克隆得到的RAV基因進行實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，不同時段的低溫處理和不同濃度的鹽脅迫后，隴油6號和天油2號油菜中的RAV基因表達明顯提高，說明RAV基因在兩種油菜處于低溫和鹽等逆境環(huán)境下被誘導表達.該基因在油菜正常生長時沒有明顯的表達，但是當油菜受到逆境脅迫時又能快速的響應，說明該基因參與響應非生物脅迫的網(wǎng)絡調(diào)控.盡管白菜型油菜RAV基因能夠被低溫和鹽脅迫誘導，然而對其功能的進一步研究還需要利用擬南芥進行轉(zhuǎn)基因來驗證，從而為利用RAV基因進行抗逆分子育種提供依據(jù).

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(責任編輯 俞詩源)

Cloning and expression analysis of transcription factorRAVfromBrasseriecampestris

ZHANG Teng-guo,LI Ping,KOU Ming-gang,WANG Juan,ZHENG Sheng

(College of Life Sciences,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,Gansu,China)

The sequences ofRAVgene fromBrassicacampestrisis obtained by RACE method based on theRAVfactor sequence ofArabidopsisthaliana,the full-length cDNA ofRAVis 1036 bp,containing a 5′-UTR of 109 bp,a 3′-UTR of 171 bp,and a 1026 bp opening reading frame.The deduced protein is 341 amino acids with molecular weight 38.03 u and isoelectric point 9.2.The transcription factor of RAV contains two distinct DNA domains,one AP2 domain together with one B3 domain.Comparison of amino acid sequences and phylogenetic analysis indicates that this gene has high identities withArabidopsisthaliana(88.0%).qRT-PCR results indicates thatRAVis induced by cold and NaCl.It shows the expression of theRAVplays an important role during abiotic stress inBrasseriecampestris.

Brassicacampestris;RAVtranscription factor;molecular cloning;expression analysis

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.06.016

2016-04-16;修改稿收到日期:2016-07-20

國家自然科學基金資助項目(31460099,31160089)

張騰國(1971—)，男，甘肅會寧人，教授，博士，碩士研究生導師.主要研究方向為抗逆生理及分子生物學.

E-mail:zhangtengguo@163.com

Q 945.78

A

1001-988Ⅹ(2016)06-0085-07