血清miR-146a、miR-663的表達(dá)變化與不穩(wěn)定型心絞痛的相關(guān)性

尚丹　劉曉鵬　丁紅玉　黃晶　孫紹光

1.北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站,河北石家莊050000；2.河北省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北石家莊050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,河北石家莊050017

血清miR-146a、miR-663的表達(dá)變化與不穩(wěn)定型心絞痛的相關(guān)性

尚丹1劉曉鵬1丁紅玉1黃晶2孫紹光3

1.北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站,河北石家莊050000；2.河北省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北石家莊050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,河北石家莊050017

目的檢測(cè)不穩(wěn)定型心絞痛患者與健康人血清中miR-146a和miR-663表達(dá)水平差異,探討miR-146a和miR-663與不穩(wěn)定型心絞痛的相關(guān)性。方法隨機(jī)選擇2014年8～12月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院不穩(wěn)定型心絞痛15例作為觀察組,選取2014年3～5月北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站體檢中心的健康體檢者15名作為對(duì)照組。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)兩組血清miR-146a和miR-663的表達(dá)水平。結(jié)果觀察組患者血清中miR-146a濃度較對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；觀察組患者血清miR-663濃度較對(duì)照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論血清miR-146a、miR-663表達(dá)水平的變化對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛的輔助診斷具有潛在的指導(dǎo)意義。

不穩(wěn)定型心絞痛曰microRNA曰miR-146a曰miR-663

不穩(wěn)定型心絞痛（Unstable angina,UA)是急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome,ACS)的常見(jiàn)類(lèi)型之一,其病理基礎(chǔ)為冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈血流減少和心肌供血不足。目前治療手段有限,治療效果也不理想,因此有效的早期診斷、干預(yù)對(duì)于改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后具有重要的意義。

microRNA（miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源的、長(zhǎng)約22nt的非編碼RNA。miRNA通過(guò)不完全堿基配對(duì)的方式與靶mRNA的3'UTR結(jié)合,降解mRNA或抑制靶基因的翻譯[1]。研究表明[2-10],miRNA在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。miRNA在進(jìn)化上高度保守,具有組織、細(xì)胞或病理特異性。由于囊泡和蛋白的保護(hù),血清、尿液、唾液等體液中的miRNA非常穩(wěn)定,是一類(lèi)理想的新型疾病診斷生物標(biāo)志物[11-12]。

血管平滑肌細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化并獲得增殖能力,是動(dòng)脈硬化、高血壓等血管重塑性疾病的重要病理學(xué)事件。Ji等[13]和本課題組[14]的研究均表明,miR-146a在增殖型血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)升高,能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖,在血管重塑中起到重要調(diào)控作用。Li等[15-16]研究發(fā)現(xiàn),miR-663在增殖型血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)水平比分化血管平滑肌細(xì)胞顯著降低,能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜的形成?；谝陨弦罁?jù),本研究組提出,血管重塑疾病患者血清miR-146a、miR-663能否作為生物標(biāo)志物用于臨床診斷?在本次研究中使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),檢測(cè)了不穩(wěn)定型心絞痛患者和健康人血清中miR-146a、miR-663表達(dá)水平,以期為miR-146a、miR-663作為生物標(biāo)志物用于輔助診斷不穩(wěn)定型心絞痛提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2014年8～12月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院不穩(wěn)定型心絞痛15例作為觀察組,其中男10例,女5例,年齡35～73歲,平均（51.34±8.75)歲。選取2014年3～5月北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站體檢中心的健康體檢者15名作為對(duì)照組,其中男8例,女7例,年齡32～68歲,平均（44.76±9.52)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):無(wú)血緣關(guān)系,無(wú)急慢性感染、血液系統(tǒng)疾病、肝腎疾病、惡性腫瘤、高血壓等。兩組年齡、性別、血壓、體重指數(shù)（BMI)、總膽固醇（TC)、三酰甘油（TG)、HDL-C（高密度脂蛋白膽固醇)、LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇)、白細(xì)胞比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05),具有可比性。見(jiàn)表1。

表1　兩組一般資料比較情況（依s)

表1　兩組一般資料比較情況（依s)

注:BMI:體重指數(shù)；TC:總膽固醇；TG:三酰甘油；HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇

組別年齡（歲)性別收縮壓舒張壓BMITCTGHDL-CLDL-C白細(xì)胞（例,男/女)（mmHg)（mmHg)（kg/m2)（mmol/L)（mmol/L)（mmol/L)（mmol/L)（109/L)觀察組（n=15)51.34±8.75（10/5)132.24±12.3782.64±15.3923.27±3.614.26±0.911.24±0.341.07±0.282.03±0.817.84±2.5對(duì)照組（n=15)44.76±9.52（8/7)122.62±21.3876.83±8.7624.56±2.834.09±0.821.36±0.571.12±0.232.46±0.686.67±1.9

1.2主要儀器與試劑

實(shí)時(shí)定量PCR儀型號(hào)為ABI7300。miRcute血清/血漿miRNA提取試劑盒（貨號(hào):DP503)、miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRcute Plus miRNA定量PCR檢測(cè)試劑盒（SYBR Green)（貨號(hào):FP411)、miRNA外參（貨號(hào):CR100-01)、miR-146a正向引物（貨號(hào):CD201-0013)、miR-191正向引物（貨號(hào):CD201-0019)和miRNA外參正向引物（貨號(hào):CD200-01)均購(gòu)自天根生化科技（北京)有限公司,miR-663正向引物購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.3血清中miRNA的提取

每200 μL血清加入900 μL裂解液,振蕩器振蕩混勻30 s至完全勻漿,加入4 μL 2.5 nmol/L的檢測(cè)外參,顛倒混勻。室溫靜置5 min,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入200 μL氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫靜置5 min。12 000 r/min,4℃,離心15 min,把水相轉(zhuǎn)移到新管中。緩慢加入轉(zhuǎn)移液2倍體積的無(wú)水乙醇,混勻。轉(zhuǎn)入吸附柱,室溫放置2 min,室溫12 000 r/min離心30 s,離心后棄掉流出液,保留吸附柱。加入700 μL去蛋白液,室溫靜置2 min,室溫12 000 r/min離心30 s,棄廢液。加入500 μL漂洗液,室溫靜置2 min,室溫12 000 r/min離心30 s,棄廢液。重復(fù)漂洗1次。室溫12 000 r/min離心2 min,棄收集管。將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無(wú)核酸酶的離心管中,向吸附膜中心位置加20 μL無(wú)核酸酶H2O,室溫放置2 min,室溫12 000 r/min離心2 min。

1.4miRNA的RT-qPCR檢測(cè)

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:RNA 5 μL（1.5 μg),2×miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液10 μL,miRNA逆轉(zhuǎn)錄酶混合液2 μL,無(wú)核酸酶水補(bǔ)足20 μL。輕輕混勻表中配制的反應(yīng)液,42℃,反應(yīng)60 min進(jìn)行miRNA加A尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),最后95℃滅活3 min。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系:2×miRcutePlusmiRNA Premix（withSYBR&ROX) 10 μL,正反向特異引物（10 μmol/L)各0.4 μL,miRNA第一鏈cDNA 1.2 μL,50×ROX Reference Dye 2 μL,無(wú)核酸酶水補(bǔ)足20 μL。程序如下:95℃預(yù)變性15 min；95℃變性20 s,60℃退火延伸34 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán),然后進(jìn)行溶解曲線分析。采用相對(duì)定量方法（2-ΔΔCt)對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（依s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不穩(wěn)定型心絞痛患者血清miR-146a的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)與內(nèi)參miR-191相比較,觀察組患者血清miR-146a的表達(dá)水平較對(duì)照組升高了（1.82±0.23)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05),見(jiàn)圖1A。與外參相比較,觀察組患者血清miR-146a的表達(dá)水平較對(duì)照組升高了（1.64±0.17)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05),見(jiàn)圖1B。

圖1　miR-146a在不穩(wěn)定型心絞痛患者和健康人群血清中的表達(dá)水平

2.2不穩(wěn)定型心絞痛患者血清miR-663的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與內(nèi)參miR-191比較,觀察組患者血清miR-663的表達(dá)水平是對(duì)照組的（0.41±0.04)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05),見(jiàn)圖2A；與外參相比較,觀察組患者血清miR-146a的表達(dá)水平是對(duì)照組的（0.49±0.03)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05),見(jiàn)圖2B。

圖2　miR-663在不穩(wěn)定型心絞痛患者和健康人群血清中的表達(dá)水平

3　討論

理想的生物標(biāo)志物應(yīng)該具備以下標(biāo)準(zhǔn):可以通過(guò)無(wú)創(chuàng)方法獲取、高度特異性和敏感性、較長(zhǎng)半衰期、能夠被快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)等。體液miRNA完全滿足以上標(biāo)準(zhǔn)。miRNA不同于其他RNA,能夠耐受RNA酶的水解,在體液中非常穩(wěn)定,而且可以采用實(shí)時(shí)定量PCR、基因芯片、測(cè)序等高靈敏度、高通量的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),目前已成為深受關(guān)注的一類(lèi)臨床生物標(biāo)志物。近幾年將miRNA作為疾病的生物標(biāo)志物的研究越來(lái)越多,已成為生物標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)。血清miRNAs的變化與多種人類(lèi)疾病如癌癥[17-18]、阿爾茲海默[19-20]等相關(guān),其表達(dá)水平異常具有協(xié)助疾病診斷的潛在價(jià)值。在心血管疾病領(lǐng)域也有很多報(bào)道[21-25], Widera等[24]對(duì)444例ACS患者血漿中的心肌細(xì)胞富含的miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-208a、miR-208b和miR-499濃度進(jìn)行了檢測(cè),并分析它們與ACS病情發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性。Fichtlscherer等[25]首次探討了穩(wěn)定型心血管疾病患者血漿中幾十種miRNA水平,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)豐富的miR-126、miR-92a、miR-17在心血管疾病患者血漿的水平下降,炎癥相關(guān)miRNA-155和血管平滑肌細(xì)胞富含的miRNA-145也在穩(wěn)定型心血管疾病患者血漿中下調(diào)。但結(jié)果中只有miRNA-145的變化與預(yù)期相符,其他與預(yù)期結(jié)果相反,表明篩選特異有效的miRNA用于心血管疾病預(yù)測(cè)和診斷,仍需要進(jìn)一步的深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn),不穩(wěn)定型心絞痛患者血清miR-146a的表達(dá)水平比健康者升高,而miR-663的表達(dá)水平比健康者下降。這一結(jié)果與之前報(bào)道的增生血管中miR-146a[13-14]表達(dá)水平升高及miR-633[15-16]的表達(dá)水平降低相吻合。這為miR-146a、miR-663作為生物標(biāo)志物用于輔助診斷不穩(wěn)定型心絞痛提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究聯(lián)合使用了內(nèi)參法和外參法分別進(jìn)行miRNA表達(dá)量分析,所得結(jié)果一致,反映出了所用檢測(cè)方法的可靠性。miR-191是一種在血清中穩(wěn)定表達(dá)的miRNA,被作為內(nèi)參用于阿爾茲海默等患者血清中的miRNA表達(dá)譜分析[19]。已有研究表明[13],與正常動(dòng)脈血管比較,內(nèi)膜增生動(dòng)脈血管中的miR-191表達(dá)水平?jīng)]有改變,推測(cè)其未參與血管重塑性疾病的發(fā)生發(fā)展,因此本實(shí)驗(yàn)選取miR-191作為內(nèi)參。但是考慮到樣本量較少,miR-146a、miR-663作為生物標(biāo)志物用于不穩(wěn)定型心絞痛臨床診斷的價(jià)值尚需進(jìn)一步探討。

目前,未見(jiàn)血清miR-633與其他疾病的相關(guān)性報(bào)道。已有研究報(bào)道了血清miR-146a與多種疾病的相關(guān)性,例如,血清miR-146a在乳腺癌[26]、非小細(xì)胞肺癌[27]等患者中表達(dá)水平升高,在敗血癥[28]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[29]等患者中表達(dá)水平下降。因此單獨(dú)使用血清miR-146a用來(lái)診某一疾病缺少特異性,最好是采用多種miRNA聯(lián)合分析,或者結(jié)合其他血液指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合分析。

本研究使用的miRNA提取試劑盒是專(zhuān)門(mén)針對(duì)血清、血漿樣本miRNA提取而開(kāi)發(fā)的。其中的裂解液具有較高的裂解能力和提取靈敏度,吸附柱采用特殊的硅基質(zhì)膜填料,大大增強(qiáng)了對(duì)小RNA分子的吸附能力,提取得到的miRNA純度更好、質(zhì)量更高,效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的Trizol提取法。本實(shí)驗(yàn)使用的miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒采用了雙組分形式,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程,降低了操作失誤的可能性。其中的Poly（A)聚合酶不但具有高效的加A尾效率,還能夠特異性地識(shí)別單鏈miRNA,從而避免了具有雙鏈結(jié)構(gòu)的miRNA前體的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；另外,所使用的逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過(guò)分子改造,去掉了RNase H活性,增加了RNA模板親和力,從而保證了miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)具有更高的效率和靈敏度,同時(shí)能保證miRNA末端的Poly（A)修飾過(guò)程和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程同時(shí)高效進(jìn)行。

綜上所述,本研究分析了不穩(wěn)定型心絞痛患者血清miR-146a、miR-663表達(dá)水平變化,為血清miR-146a、miR-663作為生物標(biāo)志物用于輔助診斷不穩(wěn)定型心絞痛提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Correlations between expression levels of serum miR-146a,miR-663 and unstable angina

SHANG Dan1LIU Xiaopeng1DING Hongyu1HUANG Jing2SUN Shaoguang3
1.Shijiazhuang Health and Epidemic Prevention Station,Beijing Railway Bureau,Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China;2.Clinical Laboratory,Children's Hospital of Hebei Province,Hebei Province,Shijiazhuang050000, China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Basic Medical College,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang050017,China

Objective To detect the expression levels of serum miR-146a and miR-663 in unstable angina patients and healthy controls,explore the correlations between the expression levels of serum miR-146a,miR-663 and unstable angina.Methods 15 patients with unstable angina from the Second Hospital of Hebei Medical University from August to December 2014 were randomly selected as the observation group,while 15 heath from Shijiazhuang Health and Epidemic Prevention Station of Beijing Railway from March to May 2014 were randomly selected as the control group.The expression levels of serum miR-146a and miR-663 in two groups were analyzed by quantitative real-time PCR.Re鄄sults Expression level of serum miR-146a in the observation group were increased,as compared with those in the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05);compared with those in the control group,the expression level of serum miR-663 in the observation group were decreased,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion The changes of serum expression levels of miR-146a or miR-663 have potential significance for the diagnosis of unstable angina.

Unstable angina;miRNA;miR-146a;miR-663

R541.4

A

1673-7210(2016)06(b)-0045-05

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（11201 40198)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81200215)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2013206151)。

尚丹（1980.5-),女,碩士,主管技師；研究方向:分子診斷。孫紹光（1978.4-),男,博士,副教授；研究方向:調(diào)控性非編碼RNA。

（2016-03-09本文編輯:任念)