異檸檬酸脫氫酶作為肺癌標(biāo)志物的臨床意義

孫 濤 周喆炎 邊 莉 徐開(kāi)軍 馬 薈

(云南省第三人民醫(yī)院病理科，云南 昆明 650011)

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異檸檬酸脫氫酶作為肺癌標(biāo)志物的臨床意義

孫 濤 周喆炎 邊 莉1徐開(kāi)軍 馬 薈

(云南省第三人民醫(yī)院病理科，云南 昆明 650011)

目的 探討異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)作為肺癌標(biāo)志物的臨床意義。方法 RT-PCR檢測(cè)收集的50例肺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中IDH1、激活蛋白激酶C1受體(RACK1)、過(guò)氧化物氧化還原酶2(PRDX2)的表達(dá)水平。ELISA檢測(cè)收集的50例肺癌患者及20例正常人血漿標(biāo)本中IDH1的表達(dá)水平。以肺癌細(xì)胞A549為研究對(duì)象，轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA抑制肺癌細(xì)胞中IDH1的表達(dá)，MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6 d的肺癌細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌組織中均過(guò)度表達(dá)，IDH1相對(duì)于癌旁組織表達(dá)量上調(diào)最多。20例正常人血漿中IDH1水平中位數(shù)為3.48 U/L，50例肺癌患者血漿中IDH1水平中位數(shù)為6.55 U/L，組間比較差異顯著(P<0.01)。IDH1 siRNA組肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞存活率與siRNA control組相比差異顯著(P<0.05，P<0.01)。siRNA control組細(xì)胞凋亡率為0.12±0.01，與IDH1 siRNA組(0.41±0.02)比較差異顯著(P<0.01)。結(jié)論 IDH1在肺癌組織和血漿中高表達(dá)。抑制IDH1可以抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。IDH1可以作為肺癌標(biāo)志物用于診斷肺癌。

肺癌；異檸檬酸脫氫酶1

肺癌的發(fā)生與吸煙、職業(yè)、遺傳等多種因素有關(guān)。肺癌發(fā)病早期癥狀不明顯，確診時(shí)一般為肺癌中晚期，耽誤了最佳的治療時(shí)機(jī)。小分子標(biāo)志物診斷癌癥是目前研究較多的癌癥診斷方法。

異檸檬酸脫氫酶(IDH)廣泛存在于真核生物體內(nèi)，是由IDH基因編碼的一種蛋白酶〔1〕。IDH1是IDH的一種亞型，在預(yù)防應(yīng)激、胰島素分泌、射線抵御等方面具有重要作用。已經(jīng)有研究表明，肺癌組織和正常的癌旁組織中 IDH1、激活蛋白激酶C1受體(RACK1)、過(guò)氧化物氧化還原酶2(PRDX2)為差異表達(dá)蛋白，而且參與了腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的傳導(dǎo)〔2〕。本研究通過(guò)對(duì)比肺癌細(xì)胞中IDH1、RACK1、PRDX2的表達(dá)水平，研究其對(duì)肺癌細(xì)胞的作用，以期為診斷肺癌提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌組織、血漿樣本及細(xì)胞系 肺癌組織及對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織50例，50例肺癌患者及20例正常人血漿標(biāo)本均來(lái)自2011年7月至2016年7月云南省第三人民醫(yī)院和昆明醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院，患者已簽署知情協(xié)議書(shū)，組織標(biāo)本和血漿標(biāo)本性別年齡均無(wú)顯著差異。肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.1.2 主要儀器及試劑 CO2培養(yǎng)箱，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)，北京中科院；倒置顯微鏡，日本尼康；酶標(biāo)儀，北京柏邁科技有限公司；水浴鍋，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒；RT-PCR檢測(cè)試劑盒，寶生物工程(大連) 有限公司；Matrigel，上海前塵生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青有限公司；PBS，碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基青鏈霉素胰蛋白酶，上海春曉生物技術(shù)有限公司；MTT，上海前塵生物科技有限公司；IDH1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，上海易利生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè)組織樣本中IDH1、RACK1、PRDX2水平 收集的50例肺癌組織和對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織隨機(jī)編號(hào)為1～50，每一組取0.2 g組織樣本放置于組織研磨管中，加入1 ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)，勻漿器研磨后轉(zhuǎn)移到離心管中，3 000 r/min離心5 min后，棄上清液。在組織沉淀中加入TRIzol裂解液，充分混勻后，放置于室溫下充分裂解6 min，加入200 μl氯仿，震蕩混合后置于室溫下靜置3 min。12 000 r/min，4℃離心5 min，收集上清液。在上清液中加入600 μl的75%乙醇溶液，混勻后10 000 r/min離心5 min，棄上清液，在室溫下干燥10 min，加入適量的焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解。提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成IDH1、RACK1、PRDX2 mRNA，按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)分析IDH1、RACK1、PRDX2轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)正常人和肺癌患者血漿中IDH1的表達(dá) 收集的50例肺癌患者和20例正常人血漿標(biāo)本，利用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血漿標(biāo)本中的IDH1水平。用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度，波長(zhǎng)為450 nm。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存于液氮罐中的肺癌細(xì)胞A549，放置于37℃的水浴鍋中孵育5 min，觀察凍存管中的液體全部融化后，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液。在細(xì)胞沉淀中加入2 ml含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基，充分混勻，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞融合度為90%時(shí)，棄細(xì)胞生長(zhǎng)液，在細(xì)胞中加入PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入0.25%胰蛋白酶，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中消化3 min，觀察細(xì)胞呈單個(gè)存在時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入PBS洗滌細(xì)胞后，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞A549，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞呈單個(gè)細(xì)胞，加入PBS洗滌細(xì)胞兩次，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到85%時(shí)，將細(xì)胞生長(zhǎng)液更換為不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。用不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液分別與IDH1 siRNA和siRNA control混合后，室溫下靜置5 min，為A液。轉(zhuǎn)染試劑與不完全培養(yǎng)液混合后，在室溫下靜置20 min，為B液。A液與B液混合后，室溫下靜置20 min，與細(xì)胞混合后，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為含有胎牛血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA和siRNA control后的肺癌細(xì)胞A549，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，用PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整每孔中細(xì)胞個(gè)數(shù)為20 000個(gè)，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，待細(xì)胞貼壁后，棄細(xì)胞生長(zhǎng)液，更換新的細(xì)胞生長(zhǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 d。加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸除上清液，加入150 μl的DMSO溶液，避光條件下反應(yīng)10 min，直至結(jié)晶物完全溶解后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔的吸光度(OD值)，分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA和siRNA control后的肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)48 h后，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，在細(xì)胞中加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心細(xì)胞10 min，在細(xì)胞沉淀中加入PBS懸浮細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，使得每毫升細(xì)胞懸浮液中含有2×106個(gè)細(xì)胞。取1 ml的細(xì)胞懸浮液，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀，加入適量的結(jié)合緩沖液后，在細(xì)胞中加入5 μl Annexin V和5 μl PI混合，室溫下孵育反應(yīng)10 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測(cè)組織樣本中IDH1、RACK1、PRDX2水平 以正常的癌旁組織中IDH1、RACK1、PRDX2水平為參照(設(shè)為1)，IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌組織中均過(guò)度表達(dá)(分別為3.09±0.15，2.16±0.17，2.20±0.11)，IDH1相對(duì)于癌旁組織表達(dá)量上調(diào)最多，故選用IDH1進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 ELISA檢測(cè)肺癌患者和正常人血漿中IDH1水平 20例正常人血漿中IDH1水平中位數(shù)為3.48 U/L，50例肺癌患者血漿中IDH1水平中位數(shù)為6.55 U/L，組間比較差異顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 正常人和肺癌患者血清中IDH1含量

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果 IDH1 siRNA組肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞存活率與siRNA control組相比差異顯著(P<0.05，P<0.01)。轉(zhuǎn)染IDH1 siRNA可抑制細(xì)胞中IDH1的表達(dá)，進(jìn)而有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖。見(jiàn)表1。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 IDH1 siRNA組的肺癌細(xì)胞凋亡率為(0.41±0.02)，明顯多于siRNA control組(0.12±0.01，P<0.05)?？梢?jiàn)，抑制IDH1的表達(dá)可以有效促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549，凋亡。

表1 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的肺癌細(xì)胞A549增殖情況

與siRNA control組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)每年大約有160萬(wàn)新增肺癌患者，有140萬(wàn)人死于肺癌，肺癌的死亡人數(shù)占惡性腫瘤死亡人數(shù)的19%。在中國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均為惡性腫瘤中的第一位，其中城市肺癌的死亡率較農(nóng)村高，男性的死亡率較女性高。肺癌發(fā)病隱匿，約有70%的肺癌患者確診時(shí)已經(jīng)為肺癌晚期。

分子標(biāo)記物在多種疾病的診斷中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。癌癥標(biāo)志物在正常組織和癌癥組織中差異表達(dá)，可以是癌基因、抑癌基因或者與癌癥相關(guān)的基因、抗原〔3～5〕，在腫瘤的診斷中具有監(jiān)測(cè)作用。

IDH1基因在人類(lèi)染色體2q33上，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的IDH1可以促進(jìn)NADPH產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)谷胱甘肽的循環(huán)再生〔6〕。IDH1參與細(xì)胞代謝，在與葡萄糖相關(guān)的胰島素分泌中具有調(diào)控作用〔7，8〕。已經(jīng)有研究表明，IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)〔9〕。本研究結(jié)果顯示，IDH1在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)最為明顯，并且肺癌患者血漿中IDH1含量明顯高于正常人。抑制細(xì)胞中IDH1的表達(dá)，可以有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖，并且明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，IDH1在肺癌組織中過(guò)度表達(dá)，發(fā)揮癌基因的作用。抑制IDH1的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。這說(shuō)明IDH1是一種潛在的肺癌標(biāo)志物，為診斷和治療肺癌提供了新思路。

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〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2010Y188)

孫 濤(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事肺、乳腺腫瘤研究。

R734.2

A

1005-9202(2016)21-5337-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.056

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科