HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地爬山虎莖中白藜蘆醇的含量

鮑慧瑋 侯曉琳 劉芳馨 張 晨 劉 佳

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117

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HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地爬山虎莖中白藜蘆醇的含量

鮑慧瑋 侯曉琳 劉芳馨 張 晨 劉 佳*

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117

目的：建立一種測(cè)定爬山虎莖中白藜蘆醇含量的方法，并對(duì)不同產(chǎn)地的爬山虎進(jìn)行測(cè)定。方法：使用Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(45∶55)；柱溫：35℃；體積流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；進(jìn)樣量均為10μL。結(jié)果：爬山虎中白藜蘆醇的進(jìn)樣量在0.002168～0.03252mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為101.2%，RSD值為0.84%，且精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好。結(jié)論：該方法可以精密、快速、穩(wěn)定和高效的測(cè)定爬山虎中白藜蘆醇的含量。

爬山虎莖；白藜蘆醇；含量測(cè)定；HPLC

爬山虎(ParthenocissustricuspidataS. Z.)系葡萄科爬山虎屬落葉多年生多分枝木質(zhì)大藤本，又名地錦、爬墻虎[1-2]。爬山虎莖長(zhǎng)10～30m，枝端卷須可發(fā)育成粘性吸盤有很強(qiáng)的吸附、攀援能力，可攀援光滑的墻壁和裸露的巖石[3]，具有良好的生態(tài)適應(yīng)性，是裝飾墻壁、 假山的園林植物。近年來，人們對(duì)其黏附、繁殖以及綠化方面的研究較多，其同樣具有良好的藥效作用，如在抑菌[4]、抗氧化[5]等方面。爬山虎中藥用活性成分較多，包括多糖、紅色素、多酚類、黃酮類成分等，其中白藜蘆醇在抗血栓[6]、抗腫瘤[7]、改善和治療心血管疾病中起著重要的作用[8-10]，其結(jié)構(gòu)見圖1，且白藜蘆醇在自然界中更加穩(wěn)定，藥效較順式更強(qiáng)，從爬山虎中分離白藜蘆醇也成為其獲得方法之一[11]。鑒于爬山虎較高的藥用價(jià)值，卻缺少質(zhì)量控制方法，本研究利用HPLC法建立一種測(cè)定爬山虎中白藜蘆醇的方法，以評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的爬山虎[12]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260型液相色譜儀(美國安捷倫有限公司)；AVW20D型電子天平(日本島津制作所)；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-400KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 反式白藜蘆醇對(duì)照品(批號(hào)：111535-200502，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇(色譜純，美國FISHER公司)，乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚(分析純，北京化工廠)，水(純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。樣品經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院李波老師鑒定為葡萄科爬山虎屬落葉多年生多分枝木質(zhì)大藤本植物爬山虎莖(ParthenocissustricuspidataS. Z.)，來源及批號(hào)見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)[7]色譜柱：Agilent TC C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(45∶55)；柱溫：35℃；體積流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm；進(jìn)樣量均為10μL。理論塔板數(shù)按白藜蘆醇計(jì)算均不低于1500。在此條件下，白藜蘆醇與其他物質(zhì)分離度均符合藥典規(guī)定，白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品和爬山虎莖供試品色譜圖見圖2、圖3。

表1 爬山虎產(chǎn)地及批號(hào)

2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品10.22mg，置1000mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成0.01022mg/mL的白藜蘆醇對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 將干燥的爬山虎莖粉碎，過60目篩，精密稱定10.5g，加200mL的乙酸乙酯超聲提取約20min，過濾，在藥渣中加入200mL乙酸乙酯超聲提取約20min，過濾，并用200mL乙酸乙酯洗滌藥渣，合并乙酸乙酯提取液，旋蒸60℃蒸干，用色譜甲醇溶解并用定容于10mL容量瓶中。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品10.84mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別吸取0.2、0.6、1、1.5、2、3ml，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。即濃度為0.002168、0.006504、0.01084、0.01626、0.02168、0.03252mg/mL的線性關(guān)系對(duì)照品溶液。按照“2.1”方法，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積(Y)對(duì)溶液濃度(X)作圖，得到白藜蘆醇的回歸方程為Y=31552X+6.2003，r=0.9995(n=6)，表明白藜蘆醇在0.002168～0.03252mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 按照“2.1”項(xiàng)下方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和爬山虎供試品溶液(批號(hào)為20150801)各10μL，重復(fù)進(jìn)入高效液相色譜儀6次，測(cè)得白藜蘆醇對(duì)照品和供試品色譜峰面積的RSD值分別為1.79%和1.82%，結(jié)果表明此方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 分別在0、2、4、6、8、10、12、24h時(shí)，按照“2.1”項(xiàng)下方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和爬山虎莖供試品溶液(批號(hào)為：20150601)10μL，依次進(jìn)樣，測(cè)得白藜蘆醇對(duì)照品和爬山虎供試品色譜峰面積的RSD值分別為1.65%和1.01%(n=8)，結(jié)果表明供試品溶液中白藜蘆醇和對(duì)照品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取爬山虎莖供試品(批號(hào)：20150601)6份，每份約10g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)得白藜蘆醇色譜峰面積，并計(jì)算出其含量的RSD值為1.95%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取白藜蘆醇對(duì)照品6份，每份約10mg，定容至100mL容量瓶中，吸取0.5mL，分別加入6份約5g的爬山虎莖供試品(批號(hào)：20150601)，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，并進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果白藜蘆醇的平均回收率為101.2%，RSD值為0.84%(n=6)，表明此方法回收率良好。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地爬山虎樣品，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀器中，依法進(jìn)行含量測(cè)定，記錄色譜峰面積，并按照外標(biāo)法計(jì)算供試品中白藜蘆醇的含量。結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地爬山虎莖中白藜蘆醇的含量結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法的考察 分別考察超聲提取法、回流提取法對(duì)爬山虎中白藜蘆醇的提取，發(fā)現(xiàn)兩種方法均有很好的提取效果。但是回流提取法需要提取時(shí)間較長(zhǎng)，且其液相色譜圖雜質(zhì)峰較多，故選取超聲提取法對(duì)爬山虎進(jìn)行提取。通過對(duì)比甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚等試劑對(duì)爬山虎的提取結(jié)果，發(fā)現(xiàn)除石油醚外，提取效果均很好，但其中乙酸乙酯色譜圖中干擾主峰的雜質(zhì)最少，最利于白藜蘆醇的分離和測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相的考察 選擇甲醇-水和乙腈-水體系對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行分離，不斷的改變有機(jī)相和水相的比例，最終確定甲醇-水(45∶55)為最佳分離比例，可將白藜蘆醇和其它物質(zhì)很好的分離開，且分離時(shí)間較短，峰形良好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 因爬山虎莖中成分極其復(fù)雜，故通過二極管全波長(zhǎng)陣列檢測(cè)器對(duì)供試品在190～400nm波長(zhǎng)下進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在290nm下，白藜蘆醇吸收較好，且在此波長(zhǎng)下其與爬山虎中其它組分分離度良好。

爬山虎雖然是一種具有良好藥效的藥材，但人們往往對(duì)于其爬墻能力方面研究較多，對(duì)于其藥用價(jià)值方面研究較少。通過對(duì)其成分的分離，發(fā)現(xiàn)其中含有較高含量的白藜蘆醇。白藜蘆醇具有良好的抗腫瘤活性和治療心血管疾病等藥效作用，來近些年來備受人們關(guān)注，市場(chǎng)的需求也日益增加。由于爬山虎價(jià)格低廉，且生長(zhǎng)速度極其迅速，從爬山虎莖中提取、分離反式白藜蘆醇也是一種可行的方法。白藜蘆醇的含量直接影響其質(zhì)量，故測(cè)定其中白藜蘆醇的含量非常重要。本研究建立了一種精密、快速、穩(wěn)定、高效的HPLC測(cè)定方法，測(cè)定不同產(chǎn)地爬山虎莖中白藜蘆醇的含量，建立了一種可靠的質(zhì)量評(píng)定方法，此方法為其質(zhì)量控制奠定了研究基礎(chǔ)。

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(編輯：陶希睿)

Determination of Resveratrol in Different Areas of Boston Ivy Stem by HPLC

BAO Huiwei HOU Xiaolin LIU Fangxin ZHANG Chen LIU Jia*

Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China

Objective To establish a method for the determination resveratrol in Boston ivy stem in different places. Methods The chromatographic column: Agilent TC-C18 (4.6mm×250mm, 5μm); The mobile phase: methanol-water(45∶55); The column temperature: 35℃; The volumetric flow rate: 1mL/min; The UV detector was set at 290nm; The sample size: 10μL. Results Resveratrol showed good liner relation when the content was during 0.002168mg/mL～0.03252mg/mL in the samples, the average recovery was 101.2%,RSD=0.84%, good stability, precision and repeatability; Conclusion This method can determine the contents of trans-resveratrol in Boston ivy stem, it is fast, accurate and stable.

Boston Ivy Stem; Resveratrol;Content Determination; HPLC

2016-08-13

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20120932)。

鮑慧瑋(1989-)，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥有效成分質(zhì)量控制和藥理研究工作。E-mail：baohuiwei@163.com

劉佳，博士，講師，主要從事方向中藥藥理學(xué)研究工作。E-mail： 84630309@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2016)21-0017-03