亞硝酸鹽脅迫對羅氏沼蝦血細(xì)胞及其抗氧化酶活力的影響

冼健安， 張秀霞， 郭 慧， 王冬梅， 王安利

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101；2華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室，生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東普通高校重點實驗室，廣東 廣州 510631；3廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025

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亞硝酸鹽脅迫對羅氏沼蝦血細(xì)胞及其抗氧化酶活力的影響

冼健安1，2， 張秀霞1， 郭 慧3， 王冬梅1， 王安利2*

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101；2華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室，生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東普通高校重點實驗室，廣東 廣州 510631；3廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025

【背景】亞硝酸鹽是蝦類集約化養(yǎng)殖過程中最常見的毒性污染物之一，研究亞硝酸鹽脅迫對羅氏沼蝦血細(xì)胞的毒性以及抗氧化酶在抗脅迫防御中的作用，能夠為羅氏沼蝦養(yǎng)殖過程中的亞硝酸鹽中毒防治提供理論參考?！痉椒ā恳圆煌瑵舛?0、1、5和10 mg·L-1)的亞硝態(tài)氮(NO2--N)對羅氏沼蝦進行脅迫，于脅迫后的0、6、12、24和48 h取樣，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測血細(xì)胞活性氧(ROS)含量和細(xì)胞凋亡率，同時測定血細(xì)胞總數(shù)(THC)和胞內(nèi)抗氧化酶活力?！窘Y(jié)果】1 mg·L-1NO2--N在48 h內(nèi)對血細(xì)胞ROS含量、凋亡率和THC均無顯著影響。5 mg·L-1NO2--N脅迫24 h，血細(xì)胞ROS含量顯著上升，THC顯著下降，脅迫48 h凋亡率顯著提高。10 mg·L-1NO2--N脅迫6 h，血細(xì)胞ROS含量和凋亡率均顯著上升，脅迫12 h THC顯著下降。血細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活力均不同程度地被NO2--N脅迫所誘導(dǎo)，CAT活力主要在脅迫前期提高，而GPx活力在脅迫后期提高?！窘Y(jié)論與意義】亞硝酸鹽存在濃度和時間毒性效應(yīng)，一定濃度的亞硝酸鹽會誘導(dǎo)蝦血細(xì)胞產(chǎn)生ROS，這些ROS的過量產(chǎn)生誘導(dǎo)了血細(xì)胞發(fā)生凋亡，繼而導(dǎo)致THC下降，這一氧化脅迫過程可能是亞硝酸鹽對羅氏沼蝦產(chǎn)生細(xì)胞毒性的重要機制之一。抗氧化酶活力的誘導(dǎo)表明抗氧化酶在亞硝酸鹽脅迫過程中發(fā)揮防御作用。

亞硝酸鹽； 羅氏沼蝦； 血細(xì)胞； 氧化脅迫； 抗氧化活力

水產(chǎn)動物主要以氨氮的形式排泄氮廢物，在亞硝化細(xì)菌的作用下，氨氮會轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿鼜姷膩喯跛猁}。隨著養(yǎng)殖周期的延長，水環(huán)境中的亞硝酸鹽濃度也相應(yīng)增高(寇紅巖等,2014)。亞硝酸鹽是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中最常見的環(huán)境毒性因子之一，尤其對現(xiàn)代的集約化高密度養(yǎng)殖影響更大。亞硝酸鹽對蝦類的毒性影響主要集中在半致死濃度、組織結(jié)構(gòu)、生理生化代謝和免疫酶活性的影響等方面(胡賢德等,2009; 胡義波等,2005; 黃翔鵠等,2006; 呂曉燕等,2010； 彭自然等,2004; Tseng & Chen,2004; Wangetal.,2004)。研究顯示，水體中較高含量的亞硝酸鹽會趨向于在蝦的血淋巴中積累(寇紅巖等,2014； Chenetal.,1992)。因此，亞硝酸鹽脅迫對蝦血細(xì)胞會產(chǎn)生直接影響，但目前針對亞硝酸鹽對蝦類血細(xì)胞毒性影響的研究甚少。Xianetal. (2011)的研究表明，亞硝酸鹽脅迫會對斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon(Fabricius)的血細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫作用，從而誘導(dǎo)血細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致血細(xì)胞總數(shù)(total haemocyte count，THC)下降，因而推測亞硝酸鹽脅迫對淡水蝦類可能也具有相同的細(xì)胞毒性機制。因此,本研究以羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii(de Man)為研究對象，分析亞硝酸鹽對淡水蝦類血細(xì)胞的影響；另外，為探討蝦血細(xì)胞如何通過調(diào)節(jié)抗氧化活力進行抗亞硝酸鹽防御，本研究還測定了血細(xì)胞中3類主要抗氧化酶活力的變化，以期為羅氏沼蝦養(yǎng)殖過程中的亞硝酸鹽脅迫防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羅氏沼蝦購于廣東省廣州市黃沙水產(chǎn)交易市場，室內(nèi)[pH 7.9～8.0，溫度(24±2)℃，不間斷曝氣]馴養(yǎng)，每天7:00和17:00投喂商業(yè)羅氏沼蝦成蝦餌料(粗蛋白30%，粗脂肪3%)2次，試驗前停食1 d。馴養(yǎng)1周后，選取附肢完整、無病患、活力強的個體作為試驗用蝦，平均體重(11.16±1.34) g。

1.2 亞硝酸鹽脅迫

以NaNO2作為亞硝酸氮源，設(shè)置3個NO2--N脅迫濃度：1、5和10 mg·L-1，不添加組為對照組，每組3個平行。每個養(yǎng)殖桶(直徑65 cm的圓形塑料桶)放水180 L，每桶放養(yǎng)羅氏沼蝦35尾。試驗水源為經(jīng)曝氣1周的自來水，未測出亞硝酸氮，其他水體條件與馴養(yǎng)時的條件一致，脅迫試驗期間不投餌，為保證試驗期間的亞硝酸氮濃度，每24 h換取相應(yīng)NO2--N濃度的水一次，換水量為50%。在脅迫的0、6、12、24和48 h取樣測定。

1.3 血細(xì)胞指標(biāo)測定

1.3.1 血細(xì)胞懸液的制備與血細(xì)胞總數(shù)測定 用2.5 mL的一次性注射器吸取400 μL預(yù)冷的抗凝劑(葡萄糖20.5 g·L-1，檸檬酸鈉8 g·L-1，氯化鈉4.2 g·L-1，pH 7.5)，從蝦的圍心腔抽取等量血淋巴，將血淋巴轉(zhuǎn)移到離心管中，取20 μL到血細(xì)胞計數(shù)板中，用光學(xué)顯微鏡觀察計數(shù)測定THC；剩余血淋巴用預(yù)冷的抗凝劑調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個·mL-1，制備的血細(xì)胞懸液用于流式細(xì)胞術(shù)指標(biāo)的測定。

1.3.2 流式細(xì)胞儀 所用流式細(xì)胞儀為美國BD公司的FACSCalibur，應(yīng)用CellQuest軟件(Becton Dickinson Immuno-cytometry Systems, San Jose, CA)進行試驗數(shù)據(jù)的獲取和分析。用綠色熒光通道(第一熒光通道，F(xiàn)L1)獲取DCF和FITC的熒光數(shù)據(jù)，用橙黃色熒光通道(第二熒光通道，F(xiàn)L2)獲取PI的熒光數(shù)據(jù)。每個樣品均獲取細(xì)胞數(shù)10000個。

1.3.3 血細(xì)胞活性氧含量 以DCFH-DA為熒光標(biāo)記探針測定血細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量。分別取血細(xì)胞懸液200 μL，加入10 μmol·L-1DCFH-DA避光孵育30 min，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，上流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果以DCF熒光強度為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示，分析細(xì)胞的DCF平均熒光強度，胞內(nèi)的ROS含量與DCF平均熒光強度成正比(冼健安等,2012a)。

1.3.4 血細(xì)胞凋亡率 以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒測定血細(xì)胞凋亡率。血細(xì)胞懸液進行離心，血細(xì)胞重懸于1×Annexin V結(jié)合緩沖液中，使細(xì)胞濃度約為3×106個·mL-1，每100 μL血細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液，避光染色15 min后，加入400 μL 1×Annexin V結(jié)合緩沖液，200目篩網(wǎng)過濾后立即上流式細(xì)胞儀檢測。以Annexin V-FITC熒光強度為橫坐標(biāo)，PI熒光強度為縱坐標(biāo)作雙參數(shù)散點圖，設(shè)十字門劃分細(xì)胞類群：活細(xì)胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于左下象限，前期凋亡細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于右下象限，后期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于右上象限。分析各類細(xì)胞的比例，凋亡率為前期凋亡、后期凋亡和死亡細(xì)胞所占的比例，即右下象限和右上象限細(xì)胞所占的比例(冼健安等,2012b)。

1.4 胞內(nèi)抗氧化酶活力測定

1.4.1 血細(xì)胞勻漿液的制備 如上述所取蝦的血淋巴在4 ℃下以3000 r·min-1離心10 min，棄上清，以等量生理鹽水重懸血細(xì)胞，在冰浴中進行超聲波破碎(勻漿3 s，間歇8 s，次數(shù)10次)，再將勻漿液離心(4 ℃、3000 r·min-1，10 min)，上清液為待測液。

1.4.2 酶活力測定 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒分別測定SOD、CAT和GPx活力。按照說明書步驟進行操作并計算酶活力。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 13.0進行單因素方差分析，結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，P<0.05確認(rèn)為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血細(xì)胞總數(shù)

羅氏沼蝦的初始THC為(36.41±3.48)×105個·mL-1。在試驗的48 h內(nèi)，1 mg·L-1NO2--N脅迫對羅氏沼蝦的THC無顯著影響(P>0.05)。5 mg·L-1NO2--N脅迫24和48 h，10 mg·L-1NO2--N脅迫12、24和48 h，THC均顯著下降(P<0.05)。脅迫48 h，5和10 mg·L-1的THC分別下降至(27.49±1.51)×105和(25.70±2.68)×105個·mL-1(圖1)。

圖1 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細(xì)胞總數(shù)

2.2 血細(xì)胞活性氧含量

在試驗的48 h內(nèi)，1 mg·L-1NO2--N脅迫對羅氏沼蝦的ROS無顯著影響(P>0.05)。5 mg·L-1NO2--N脅迫24和48 h，10 mg·L-1NO2--N脅迫6、12、24和48 h，蝦血細(xì)胞ROS含量顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 血細(xì)胞凋亡率

羅氏沼蝦的初始血細(xì)胞凋亡率為0.95%。在48 h內(nèi)，1 mg·L-1NO2--N脅迫對血細(xì)胞凋亡率無顯著影響(P>0.05)。5 mg·L-1NO2--N脅迫48 h，血細(xì)胞凋亡率顯著升高至3.36%(P<0.05)。10 mg·L-1NO2--N脅迫6 h，血細(xì)胞凋亡率開始顯著提高(P<0.05)，在24 h達(dá)到最高值，為6.75%(圖3)。

圖2 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細(xì)胞活性氧含量

圖3 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細(xì)胞凋亡率

2.4 血細(xì)胞SOD活力

如圖4所示，1、5 mg·L-1NO2--N脅迫6 h，SOD活力顯著提高(P<0.05)，隨后恢復(fù)至對照組水平(P>0.05)。10 mg·L-1NO2--N脅迫時，SOD活力在脅迫的12和24 h有顯著提高(P<0.05)，隨后下降至對照組水平(P>0.05)。

2.5 血細(xì)胞CAT活力

圖5所示，1 mg·L-1NO2--N脅迫12 h，5 mg·L-1NO2--N脅迫24 h，CAT活力呈現(xiàn)顯著上升(P<0.05)。10 mg·L-1NO2--N脅迫時，CAT活力在脅迫的6、12和24 h均顯著高于對照組(P<0.05)，在48 h時下降至對照組水平(P>0.05)。

2.6 血細(xì)胞GPx活力

如圖6所示，在脅迫的6 h時，各脅迫組的GPx活力與對照組之間均無顯著差異(P>0.05)。經(jīng)1 mg·L-1NO2--N脅迫后，GPx活力在48 h呈現(xiàn)顯著上升(P<0.05)；5 mg·L-1脅迫組的GPx活力在24和48 h顯著上升(P<0.05)；10 mg·L-1脅迫組的GPx活力在12和24 h顯著上升(P<0.05)，在48 h下降至對照組水平(P>0.05)。

圖4 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細(xì)胞SOD活力

圖5 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細(xì)胞CAT活力

圖6 亞硝酸鹽脅迫下羅氏沼蝦的血細(xì)胞GPx活力

3 討論

3.1 亞硝酸鹽對血細(xì)胞的影響

蝦類為無脊椎動物，一般被認(rèn)為僅具先天性免疫，血細(xì)胞在其生理和免疫過程中起著十分重要的作用(Johanssonetal.,2000)。蝦類的循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量，即THC，對外界環(huán)境十分敏感。研究顯示，各類環(huán)境因子脅迫，如氨氮(Rodríguez-Ramosetal.,2008)、亞硝酸鹽(Tseng & Chen,2004; Wangetal.,2004)、重金屬(Lorenzonetal.,2001)、硫化物(Chengetal.,2007)和鹽度(Wang & Chen,2006)等，均會導(dǎo)致THC下降，從而使蝦的免疫力下降。當(dāng)外界亞硝酸鹽含量較高時，亞硝酸鹽趨向于進入蝦血淋巴中并積累(寇紅巖等,2014； Chen & Chen,1992; Chengetal.,2007)，此時亞硝酸鹽直接接觸并作用于血細(xì)胞，因此應(yīng)重視亞硝酸鹽的血細(xì)胞毒性影響研究。關(guān)于亞硝酸鹽如何導(dǎo)致THC下降，Xianetal.(2011)借助FCM在斑節(jié)對蝦上做了初步研究。本研究以淡水蝦羅氏沼蝦為研究對象，也得到了相似的結(jié)果，表明亞硝酸鹽對淡水蝦類的血細(xì)胞也具有相同的氧化脅迫毒性機制。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽對羅氏沼蝦血細(xì)胞的毒性影響具有明顯的濃度和時間效應(yīng)。當(dāng)NO2--N濃度為1 mg·L-1時，在試驗的48 h內(nèi)，并未發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞指標(biāo)有顯著的影響；濃度為5 mg·L-1時，細(xì)胞指標(biāo)在脅迫后期出現(xiàn)顯著的變化；而濃度為10 mg·L-1時，細(xì)胞指標(biāo)在前期即發(fā)生顯著變化。

一般認(rèn)為，由于Cl-與NO2-會競爭鰓上的吸收位點，鹽度越高，Cl-的含量就越高,競爭吸收進入蝦體內(nèi)的NO2-就越少，因此水體鹽度越高，蝦對亞硝酸鹽的耐受能力越強(胡賢德等,2009)，因而海水蝦類的亞硝酸鹽耐受能力普遍高于淡水蝦類(寇紅巖等,2014)。這在血細(xì)胞指標(biāo)的變化上也有一定的體現(xiàn)，在斑節(jié)對蝦的研究中，NO2--N濃度達(dá)到10 mg·L-1時，血細(xì)胞指標(biāo)的顯著變化也僅在脅迫后期才開始發(fā)生；濃度達(dá)到20 mg·L-1時，血細(xì)胞指標(biāo)在前期即開始有顯著變化(Xianetal.,2011)。相比較之下，羅氏沼蝦血細(xì)胞對外界亞硝酸鹽濃度更為敏感，耐受能力較斑節(jié)對蝦低。為使羅氏沼蝦的脅迫響應(yīng)更為顯著，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，本研究選定了較高的亞硝酸氮濃度。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5和10 mg·L-1脅迫24 h，羅氏沼蝦的活動變得遲鈍緩慢，但48 h試驗過程中未出現(xiàn)死亡個體。

3.2 亞硝酸鹽對抗氧化酶活力的影響

抗氧化酶是機體內(nèi)清除過量ROS的重要工具，在正常生理狀態(tài)下，ROS的產(chǎn)生和清除在抗氧化酶以及其他抗氧化物質(zhì)的作用下處于良好的動態(tài)平衡中；當(dāng)機體受到環(huán)境脅迫時，這種動態(tài)平衡往往會被打破，機體容易受到氧化損傷，此時抗氧化酶活力的調(diào)動是機體進行抗氧化防御的重要手段。研究顯示，環(huán)境脅迫如溫度、pH、氨氮等會誘導(dǎo)蝦類抗氧化酶基因表達(dá)水平或酶活力提高，以進行抗氧化防御(蔣琦辰等,2013； Wangetal.,2009; Zhouetal.,2010)；但當(dāng)環(huán)境脅迫程度較高或脅迫時間延長時，抗氧化系統(tǒng)不足以控制ROS的過量產(chǎn)生，細(xì)胞便會受到氧化損傷，導(dǎo)致抗氧化體系反而受到破壞，抗氧化酶轉(zhuǎn)錄水平或酶活力會呈現(xiàn)出被抑制的狀態(tài)(劉曉華等,2007; 王玥等,2005; Wangetal.,2009)。在較多的亞硝酸鹽脅迫研究中，不論以肝胰腺、鰓、血清還是以肌肉為研究對象，往往都表現(xiàn)出對抗氧化酶活力的抑制性(黃翔鵠等,2006; 呂曉燕等,2010； 王玥等,2005)，這與脅迫濃度和時間有一定關(guān)系，另外可能由于亞硝酸鹽自身也具有強氧化性，相比溫度、pH等環(huán)境因子，對抗氧化酶具有更強的破壞性。當(dāng)凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei(Boone)受亞硝酸鹽脅迫時，其血細(xì)胞中的Mn-SOD、CAT、GPx和硫氧還蛋白的轉(zhuǎn)錄水平均被不同程度地誘導(dǎo)提高(Guoetal.，2013)。本研究中，為了探討血細(xì)胞對亞硝酸鹽脅迫作出的胞內(nèi)抗氧化響應(yīng)，測定了血細(xì)胞胞內(nèi)的抗氧化酶活力。結(jié)果顯示，胞內(nèi)的SOD、CAT和GPx活力均不同程度地升高，與凡納濱對蝦的表達(dá)量研究結(jié)果相似，表明血細(xì)胞調(diào)動了胞內(nèi)的抗氧化酶體系以對抗亞硝酸鹽脅迫帶來的氧化威脅。

如本試驗所述，在1 mg·L-1最低濃度脅迫時，THC、ROS含量和凋亡率均未發(fā)生顯著變化，但3類抗氧化酶的活力卻有一定程度的提高，表明在此亞硝酸鹽濃度下，血細(xì)胞通過調(diào)動胞內(nèi)的抗氧化酶體系，維持了胞內(nèi)的氧化與抗氧化動態(tài)平衡，保護血細(xì)胞免受損傷，因此在THC等細(xì)胞指標(biāo)上沒有體現(xiàn)出脅迫響應(yīng)變化。隨著亞硝酸鹽濃度的提高，雖然抗氧化酶活力也被誘導(dǎo)提高，但細(xì)胞指標(biāo)也出現(xiàn)了顯著的負(fù)面變化，表明此時被激活提高的抗氧化酶體系不足以對抗高濃度亞硝酸鹽造成的氧化脅迫，導(dǎo)致血細(xì)胞受到氧化損傷。

CAT和GPx均是清除H2O2的抗氧化酶。在本研究中，CAT和GPx活力的變化體現(xiàn)了一定的時間效應(yīng)，CAT活力主要在脅迫前期被誘導(dǎo)提高，而GPx活力的提高主要出現(xiàn)在脅迫后期。這些結(jié)果表明，CAT和GPx具有協(xié)同作用，在亞硝酸鹽脅迫時，羅氏沼蝦血細(xì)胞優(yōu)先調(diào)動了CAT進行H2O2的清除，而隨著脅迫時間的延長，GPx成為清除H2O2的主力。關(guān)于CAT和GPx的協(xié)同作用，在其他一些環(huán)境因子脅迫過程中也有相似的體現(xiàn)(Wangetal.,2009; Zhouetal.,2010)。

本研究結(jié)果顯示了抗氧化酶在抗亞硝酸鹽脅迫過程中扮演著重要角色。營養(yǎng)學(xué)研究表明，在飼料中添加適量的營養(yǎng)素或添加劑可提高水產(chǎn)動物的抗氧化活力，尤其是銅、錳等與抗氧化酶組成相關(guān)的礦物元素(郭志勛等,2003; 王宏偉等,2008)，以及維生素C、E等自身具有抗氧化能力的物質(zhì)(秦志華等,2007; 周立斌等,2009)。因此，在飼料中添加適量的這些營養(yǎng)素或添加劑可能有助于提高蝦類的抗亞硝酸鹽脅迫能力，這在一些初步的研究中已有體現(xiàn)(冼健安等,2013)，更廣泛的證據(jù)還有待進一步研究。通過營養(yǎng)學(xué)角度提高蝦類的抗亞硝酸鹽脅迫能力，可更安全、便捷地降低養(yǎng)殖風(fēng)險、減少用藥，是發(fā)展可持續(xù)生態(tài)養(yǎng)殖的理想途徑。

郭志勛, 陳畢生, 徐力文, 鄭石軒, 湛波, 劉立鶴, 程開敏, 2003. 飼料銅的添加量對南美白對蝦生長、血液免疫因子及組織銅的影響. 中國水產(chǎn)科學(xué), 10(6): 526-528.

胡賢德, 孫成波, 王平, 古文光, 阮德雄, 黃海立, 2009. 不同鹽度條件下亞硝酸氮對斑節(jié)對蝦的毒性影響. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 40(1): 103-106.

胡義波, 王玥, 姜乃澄, 2005. 氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮對羅氏沼蝦血細(xì)胞及超微結(jié)構(gòu)的影響. 浙江大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版), 32(6): 691-697.

黃翔鵠, 李長玲, 鄭蓮, 劉楚吾, 周潔, 2006. 亞硝酸鹽氮對凡納濱對蝦毒性和抗病相關(guān)因子影響. 水生生物學(xué)報, 30(4): 466-471.

蔣琦辰, 顧曙余, 張文逸, 張呈祥, 馮曉慶, 譚紅月, 楊家新, 黃文婷, 李楓, 2013. 氨氮急性脅迫及其毒后恢復(fù)對紅螯光殼螯蝦幼蝦相關(guān)免疫和代謝指標(biāo)的影響. 水產(chǎn)學(xué)報, 37(7): 1066-1072.

寇紅巖, 冼健安, 郭慧, 錢坤, 苗玉濤, 葉超霞, 潘訓(xùn)彬, 王安利, 2014. 亞硝酸鹽對蝦類毒性影響的研究進展. 海洋科學(xué), 38(2): 107-115.劉曉華, 曹俊明, 楊大偉, 周萌, 趙紅霞, 馬力, 藍(lán)漢冰, 謝從新, 黃志剛, 2007. 氨氮脅迫前后凡納濱對蝦組織中抗氧化酶和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的分布. 水利漁業(yè), 27(6): 24-26.呂曉燕, 李嘉堯, 方燕, 郭占林, 趙云龍, 李愷, 2010. 亞硝酸鹽對紅螯光殼螯蝦不同組織免疫相關(guān)酶活性及超微結(jié)構(gòu)的影響. 水產(chǎn)學(xué)報, 34(12): 1812-1820.

彭自然, 臧維玲, 高楊, 江敏, 徐桂榮, 丁福江, 2004. 氨和亞硝酸鹽對凡納濱對蝦幼蝦的毒性影響. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報, 13(3): 274-278.

秦志華, 李健, 王群, 劉淇, 2007. Vc-2-多聚磷酸酯對中國對蝦稚蝦生長、免疫及體內(nèi)Vc含量的影響. 海洋水產(chǎn)研究, 28(4): 66-71.

王宏偉, 曹向可, 錢慶增, 王亞斌, 2008. 飼料中錳對日本沼蝦抗氧化酶活性的影響. 河北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 28(3): 300-304.

王玥, 胡義波, 姜乃澄, 2005. 氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮對羅氏沼蝦免疫相關(guān)酶類的影響. 浙江大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版), 32(6): 698-705.

冼健安, 茍妮娜, 陳曉丹, 苗玉濤, 王安利, 2012a. 流式細(xì)胞術(shù)檢測蝦類血細(xì)胞活性氧含量方法的建立. 海洋科學(xué), 36(2): 29-33.

冼健安, 苗玉濤, 葉超霞, 葉劍敏, 郭慧, 張勝鵬, 王安利, 2013. 飼料銅含量對亞硝酸鹽脅迫下斑節(jié)對蝦血細(xì)胞的影響. 水生態(tài)學(xué)雜志, 34(5): 71-75.

冼健安, 王安利, 苗玉濤, 2012b. 流式細(xì)胞術(shù)在克氏原螯蝦血細(xì)胞的分類、活性和免疫功能中的應(yīng)用. 淡水漁業(yè), 42(1): 9-14, 57.

周立斌, 王安利, 張偉, 張海發(fā), 2009. 飼料維生素E含量對美國紅魚生長和非特異性免疫的影響. 漁業(yè)科學(xué)進展, 30(1): 47-53.

Chen J C and Chen S F, 1992. Accumulation of nitrite in the haemolymph ofPenaeusmonodonexposed to ambient nitrite.ComparativeBiochemistryandPhysiologyC,Toxicology&Pharmacology, 103(3): 477-481.

Cheng S Y, Hsu S W and Chen J C, 2007. Effect of sulfide on the immune response and susceptibility toVibrioalginolyticusin the kuruma shrimpMarsupenaeusjaponicus.Fish&ShellfishImmunology, 22(1/2): 16-26.

Guo H, Xian J A, Li B, Ye C X, Wang A L, Miao Y T and Liao S A, 2013. Gene expression of apoptosis-related genes, stress protein and antioxidant enzymes in hemocytes of white shrimpLitopenaeusvannameiunder nitrite stress.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC,Toxicology&Pharmacology， 157(4): 366-371.

Johansson M W, Keyser P, Sritunyalucksana K and Soderhall K, 2000. Crustacean haemocytes and haematopoiesis.Aquaculture, 191: 45-52.

Lorenzon S, Francese M, Smith V J and Ferrero E A, 2001. Heavy metals affect the circulating haemocyte number in the shrimpPalaemonelegans.FishandShellfishImmunology, 11(6): 459-472.Rodríguez-Ramos T, Espinosa G, Hernández-López J, Gollas-Galván T, Marrero J, Borrell Y, Alonso M E, Bécquer U and Alonso M, 2008. Effects ofEcherichiacolilipopolysaccharides and dissolved ammonia on immune response in southern white shrimpLitopenaeusschmitti.Aquaculture, 274(1): 118-125.

Tseng I T and Chen J C, 2004. The immune response of white shrimpLitopenaeusvannameiand its susceptibility toVibrioalginolyticusunder nitrite stress.Fish&ShellfishImmunology, 17(4): 325-333.

Wang F I and Chen J C, 2006. Effect of salinity on the immune response of tiger shrimpPenaeusmonodonand its susceptibility toPhotobacteriumdamselaesubsp. damselae.Fish&ShellfishImmunology, 20(5): 671-681.

Wang W N, Wang A L, Zhang Y J, Li Z H, Wang J X and Sun R Y, 2004. Effects of nitrite on lethal and immune response ofMacrobrachiumnipponense.Aquaculture, 232: 679-686.

Wang W N, Zhou J, Wang P, Tian T T, Zheng Y, Liu Y, Mai W J and Wang A L, 2009. Oxidative stress, DNA damage and antioxidant enzyme gene expression in the Pacific white shrimp,Litopenaeusvannameiwhen exposed to acute pH stress.ComparativeBiochemistryandPhysiologyC, 150(4): 428-435.

Xian J A, Wang A L, Chen X D, Gou N N, Miao Y T, Liao S A and Ye C X, 2011. Cytotoxicity of nitrite on haemocytes of the tiger shrimp,Penaeusmonodon, using flow cytometric analysis.Aquaculture, 317: 240-244.

Zhou J, Wang L, Xin Y, Wang W N, He W Y, Wang A L and Liu Y, 2010. Effect of temperature on antioxidant enzyme gene expression and stress protein response in white shrimp,Litopenaeusvannamei.JournalofThermalBiology, 35(6): 284-289.

(責(zé)任編輯:郭瑩)

Effects of nitrite on haemocyte and antioxidant enzyme activity inMacrobrachiumrosenbergii

Jian-an XIAN1,2, Xiu-xia ZHANG1, Hui GUO3, Dong-mei WANG1, An-li WANG2*

1InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou,Hainan571101,China;2KeyLaboratoryofEcologyandEnvironmentalScienceofGuangdongHigherEducationInstitutes,GuangdongProvincialKeyLaboratoryforHealthyandSafeAquaculture,SchoolofLifeScience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou,Guangdong510631,China;3KeyLaboratoryofAquacultureinSouthChinaSeaforAquaticEconomicAnimalofGuangdongHigherEducationInstitutes,CollegeofFisheries,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang,Guangdong524025,China

【Background】 Nitrite is one of the most common pollutants in intensive shrimp aquaculture. In order to provide theoretical basis of nitrite prevention and cure for culture ofMacrobrachiumrosenbergii, we investigated the toxicity effects of nitrite onM.rosenbergiihaemocytes, and the role of antioxidant enzymes in anti-nitrite defense. 【Method】 Prawns were exposed to different doses (0, 1, 5 and 10 mg·L-1) of NO2--N. Reactive oxygen species (ROS) production in haemocytes and apoptotic haemocyte ratio were determined by flow cytometry. The total haemocyte count (THC) and intracellular antioxidant enzyme activities were also analysed after 0, 6, 12, 24 and 48 h exposure. 【Result】 Results showed that 1 mg·L-1NO2--N had no significant effect on ROS production, apoptotic cell ratio and THC. Increase of ROS production and decline of THC could be observed in prawn exposed to 5 mg·L-1NO2--N after 24 h, and increase of apoptotic ratio occurred after 48 h. Increase of both ROS production and apoptotic ratio were observed in prawn exposed to 10 mg·L-1NO2--N after 6 h, and THC decreased after 12 h. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathion peroxidase (GPx) activities in haemocytes were induced by NO2--N to different levels. 【Conclusion and significance】 These results clearly demonstrate the dose- and time-dependent toxic effect of nitrite. They also indicate that nitrite could induce the ROS generation in prawn haemocytes and then the overproduction of ROS causeing haemocyte apoptosis and subsequent THC decline. This process of oxidative stress is one of the cytotoxicity mechanisms of nitrite onM.rosenbergii. The induced activities of antioxidant enzymes indicate that these antioxidant enzymes play a vital role in anti-nitrite defence.

nitrite;Macrobrachiumrosenbergii; haemocyte; oxidative stress; antioxidant activity

2016-04-25 接受日期(Accepted)： 2016-05-30

廣東省自然科學(xué)基金(2015A030310438、S2012040008093)

冼健安， 男， 助理研究員, 博士。 研究方向: 水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學(xué)。 E-mail: xian-ja@163.com

*通訊作者(Author for correspondence), E-mail: wanganl@scnu.edu.cn

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.04.012