膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織與血漿中miRNA表達(dá)變化及意義

荊琳，單鵬程，張洪美，王秀均

(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京100102)

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膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織與血漿中miRNA表達(dá)變化及意義

荊琳，單鵬程，張洪美，王秀均

(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京100102)

目的 觀察膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織及血漿中miRNA的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 取2例因外傷導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨剝脫無法回植的正常關(guān)節(jié)股骨髁非負(fù)重區(qū)軟骨組織、2例行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的原發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎股骨髁非負(fù)重區(qū)軟骨組織以及15例正常志愿者及15例骨關(guān)節(jié)炎患者的血漿標(biāo)本。用RT-PCR技術(shù)及HiSeq高通量測序技術(shù)檢測軟骨組織miRNA表達(dá)，根據(jù)fold change>1且P<0.01，篩選骨關(guān)節(jié)炎致病基因；采用RT-PCR技術(shù)檢測血漿中miRNA表達(dá)。結(jié)果 軟骨組織中檢測的miRNA長度主要分布在22 nt，共篩選出5種基因：hsa-miR-378c、hsa-miR-1268a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-1275，篩選出的miRNA在正常軟骨中低表達(dá)，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中高表達(dá)。篩選出的miRNA在原發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎患者及健康志愿者血漿中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 hsa-miR-378c、hsa-miR-1268a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-375和hsa-miR-1275在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中高表達(dá)，在血漿中表達(dá)無規(guī)律；以上5種miRNA可能為膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的潛在致病基因。

膝骨關(guān)節(jié)炎；微小RNA；軟骨

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動的調(diào)控過程，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡及機(jī)體發(fā)育、疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。據(jù)估計，人類至少有1/3的基因受miRNA調(diào)控[1]。有研究表明，miRNA在組織細(xì)胞中具有特征性的表達(dá)譜，并且身體發(fā)育過程和疾病發(fā)生會導(dǎo)致其表達(dá)譜發(fā)生明顯變化[2，3]。然而，國內(nèi)外有關(guān)miRNA與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系的報道較少。2015年1月～2016年3月，本研究通過比較正常膝關(guān)節(jié)與原發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織中miRNA的表達(dá)差異，以探索miRNA在膝骨關(guān)節(jié)炎病理過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的原發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎男性患者2例，年齡分別為45、56歲，取股骨髁非負(fù)重區(qū)軟骨組織作標(biāo)本(OA1、OA2)；選本院因外傷導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨剝脫、無法回植的男性志愿者2例，年齡分別為42、55歲，取股骨髁非負(fù)重區(qū)軟骨組織作標(biāo)本(CK1、CK2)。選擇原發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎患者15例(觀察組)，男6例、女9例，年齡36～62(42±4.7)歲；體檢健康志愿者15例(健康對照組)，男7例、女8例，年齡24～60(40±6.2)歲；均早晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，離心，分離血漿，于-70 ℃下保存待檢；二者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 軟骨組織中miRNA表達(dá)檢測 將關(guān)節(jié)軟骨組織及血漿標(biāo)本送于深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測序。取軟骨組織100 mg置1.5 mL離心管中，加TRIzol 1 mL，充分勻漿，室溫靜置5 min，加入氯仿0.2 mL振蕩、離心，取上清液加入異丙醇0.5 mL離心，棄上清液，加入75%乙醇1 mL沉淀、晾干，獲取純化RNA。采用RT-PCR技術(shù)、HiSeq高通量測序技術(shù)的miRNA數(shù)字化分析，邊合成邊測序，構(gòu)建樣品之間的小分子RNA差異表達(dá)譜。將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭、去污染序列及去低質(zhì)量序列處理，得到可信的目標(biāo)分析序列，再對其進(jìn)行RNA序列長度分布統(tǒng)計和樣本間公共序列統(tǒng)計。Ct值為待檢基因?qū)崟r熒光強(qiáng)度明顯大于背景循環(huán)數(shù)，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。建立數(shù)據(jù)庫，分別使用Scatter plot圖、fold change及t檢驗(yàn)比較兩標(biāo)本中共同基因的差異表達(dá)，fold change=log2(OA/CK)(OA、CK為兩組基因相對表達(dá)量)。篩選條件：fold change>1且P<0.01，認(rèn)為是差異基因。

1.3 血漿miRNA表達(dá)檢測 取血漿標(biāo)本按照TRIzol試劑說明提取總RNA，根據(jù)篩選出的目標(biāo)基因，用Pola(A)加尾法及實(shí)時RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)進(jìn)行Poly(A)多聚尾和合成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa) 進(jìn)行加樣，每個樣本均重復(fù)檢測3次，取平均值。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 膝骨關(guān)節(jié)炎及正常軟骨組織中miRNA表達(dá)比較 CK1、CK2、OA1、OA2中測得的miRNA長度主要集中于22 nt，其次為23 nt。長度為22 nt的miRNA占31.4%～51.73%，而22 nt加23 nt的miRNA占58.17%～75.88%。在fold change>1且P<0.01的條件下，共篩選出5種miRNA：hsa-miR-378c、hsa-miR-1268a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-1275，以上均在OA1、OA2中低表達(dá)而在CK1、CK2中高表達(dá)。見表1、2。

表1 CK1、CK2及OA1、OA2中miRNA的相對表達(dá)量

表2 膝骨關(guān)節(jié)炎及正常軟骨組織和miRNA的fold change值

2.2 膝骨關(guān)節(jié)炎患者及健康志愿者血漿中miRNA表達(dá)比較 膝骨關(guān)節(jié)炎患者及健康志愿者血漿中hsa-miR-1268a、hsa-miR-375、hsa-miR-1275相比表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；兩組血漿中均無hsa-miR-483-5p、hsa-miR-378c表達(dá)。

表3 膝骨關(guān)節(jié)炎患者及健康志愿者血漿miRNA相對表達(dá)量比較±s)

3 討論

miRNA能通過與靶mRNA特異性的結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。組織細(xì)胞內(nèi)的microRNA可通過某種方式分泌至外周血中，成為循環(huán)microRNA，后者作為一種全新的疾病診斷標(biāo)記物已經(jīng)得到了重視。目前，miRNA的生物學(xué)作用在許多疾病發(fā)生發(fā)展的過程中被逐漸認(rèn)識，然而miRNA在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用國內(nèi)外研究非常有限。所以我們針對原發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎患者及正常志愿者的膝關(guān)節(jié)軟骨及血漿進(jìn)行研究，篩選出具有差異表達(dá)的miRNA，以期對其進(jìn)一步深入研究[4～6]。

通常所說的miRNA是指長度18～24 nt的單鏈非編碼小分子RNA，其通過結(jié)合目標(biāo)信使RNA(mRNA)的3′端非翻譯區(qū)降解目標(biāo)基因，或抑制目標(biāo)基因翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[7～9]。miRNA長度分布的峰值能夠幫助判斷小RNA的種類，多數(shù)情況下植物樣本和動物樣本序列長度分布上有著明顯的差異，其表現(xiàn)是植物樣本長度分布的峰值一般出現(xiàn)在21 nt或24 nt，而動物樣本峰值則出現(xiàn)在22 nt。根據(jù)這些條件對于樣品情況和測序情況可以做初步判斷。我們檢測的4例人軟骨標(biāo)本中miRNA長度主要集中在22 nt，其次為23 nt。這與理論上動物標(biāo)本miRNA峰值一致。

本研究由Scatter plot圖不難發(fā)現(xiàn)，每組miRNA表達(dá)差異比較中，都有miRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中高表達(dá)，而在正常軟骨組織中低表達(dá)。而這些存在差異表達(dá)的miRNA可能在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，有待進(jìn)一步深入研究。Iliopoulos等[10]通過比較正常人與骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨組織中已知的365種miRNA的表達(dá)情況，從中鑒別出的16種miRNA存在差異，通過以上16種miRNA能夠區(qū)別正常軟骨和骨關(guān)節(jié)炎軟骨。在miRNA基因庫中，目前人類已知的miRNA就有800余種。本研究中，針對所有檢測的已知miRNA，比較其在正常軟骨及骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)，在fold change>1且P<0.01的條件下，篩選出hsa-miR-378c、hsa-miR-1268a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-375及hsa-miR-1275這5種miRNA，均在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中高表達(dá)，而在正常軟骨組織中低表達(dá)。推斷這5種miRNA可能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

Diaz-Prado等[11]曾比較4例正常志愿者關(guān)節(jié)軟骨及6例骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中已知的729種miRNA，在fold change值>1.5及P<0.01的條件下，只有hsa-miR-483-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)明顯升高。而在Iliopoulos等[10]鑒別出的在正常軟骨及骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達(dá)具有顯著差異的16種miRNA中，hsa-miR-483-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)，不論是通過miRNA的微陣列分析還是定量PCR分析都顯著升高。此外，Zuntini等[12]也通過實(shí)驗(yàn)證明，hsa-miR-483-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)明顯升高。本研究中，hsa-miR-483-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)明顯升高，其fold change值均>1，這說明hsa-miR-483-5p的高表達(dá)可能與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)。除hsa-miR-483-5p外，hsa-miR-378c、hsa-miR-375及hsa-miR-1275的fold change值分別為1.52、2.22及4.46，這3種miRNA的表達(dá)在數(shù)據(jù)分析中比hsa-miR-483-5p更理想，所以以上幾種miRNA可能為膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的潛在基因。目前，已經(jīng)有研究證明，miR-27a和miR-27b在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中能夠調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)，從而在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中起調(diào)節(jié)作用[13，14]。此外還有研究報道，miR-34a可以抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡[15]。因此，如果能夠找出調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的miRNA，可為骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷及靶向治療提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。本研究已經(jīng)鑒別出的5種miRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中高表達(dá)，以上均可能是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的潛在致病基因。因此，我們將繼續(xù)針對這5種miRNA在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行深入研究。

本研究所篩選的目標(biāo)基因在血漿中部分無表達(dá)，部分表達(dá)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。推論可能是因?yàn)?種miRNA在關(guān)節(jié)軟骨組織及血漿中出現(xiàn)的機(jī)制不同，在血漿中出現(xiàn)的機(jī)制較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究及積累更多臨床數(shù)據(jù)。

由于正常軟骨標(biāo)本獲取困難，miRNA篩選、測序復(fù)雜，且價格昂貴，本研究只在小樣本中對骨關(guān)節(jié)炎潛在的致病基因做初步篩選。但是以上miRNA在血漿中表達(dá)不穩(wěn)定，無規(guī)律可循。我們計劃下一步擴(kuò)大軟骨和血漿樣本量，再次進(jìn)行循環(huán)驗(yàn)證，并探索這些潛在致病基因在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的調(diào)控機(jī)制，以期通過干預(yù)發(fā)現(xiàn)防治骨關(guān)節(jié)炎的新方法。

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北京市自然科學(xué)基金資助項目(7102166)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.020

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1002-266X(2016)37-0061-03

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