特異性敲除巨噬細胞CXCR4基因?qū)蝹?cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)纖維化的緩解作用及機制

張翠薇，熊小明，劉勇，阮思蓓，馬躍榮

(1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都610000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

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特異性敲除巨噬細胞CXCR4基因?qū)蝹?cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)纖維化的緩解作用及機制

張翠薇1,2，熊小明2，劉勇2，阮思蓓2，馬躍榮1

(1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都610000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察特異性敲除巨噬細胞的CXCR4基因?qū)蝹?cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎間質(zhì)纖維化的緩解作用，并探討其作用機制。方法 構(gòu)建巨噬細胞CXCR4基因敲除小鼠模型(KO小鼠)16只并隨機分為KO UUO組、KO Sham組各8只；將16只野生型C57小鼠(WT小鼠)隨機分為WT UUO組、WT Sham組各8只。構(gòu)建UUO模型，造模后第12天處死小鼠取左腎組織。用HE染色法評估腎小管病變程度；用Masson染色法評估腎間質(zhì)膠原沉積程度；用免疫組化染色法評估腎組織巨噬細胞浸潤情況并行M1、M2型巨噬細胞計數(shù)，計算兩型細胞比值(M1/M2)；用Western blotting法檢測腎組織中基質(zhì)細胞衍生因子1(SDF-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及CD206蛋白表達。結(jié)果 與KO Sham組、WT Sham組比較，KO UUO組、WT UUO組腎小管損傷程度減輕、腎間質(zhì)膠原沉積程度及浸潤的巨噬細胞數(shù)量減少，M1/M2升高，腎組織中iNOS、SDF-1蛋白表達升高(P均<0.05)，KO UUO組以上指標(biāo)比WT UUO組變化更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 特異性敲除巨噬細胞的CXCR4基因可緩解UUO小鼠的腎間質(zhì)纖維化程度，其機制可能為阻止巨噬細胞通過SDF-1/CXCR4軸趨化到腎間質(zhì)中，減少M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化。

輸尿管梗阻；腎間質(zhì)纖維化；基質(zhì)細胞衍生因子1/趨化因子受體軸；巨噬細胞；基因敲除；小鼠

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎病終末期的共同表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在腎臟的聚集促進了腎間質(zhì)纖維化[1～3]。腎間質(zhì)纖維化時在腎臟聚集的巨噬細胞主要受基質(zhì)細胞衍生因子1(SDF-1)/趨化因子受體(CXCR4)軸的趨化[4,5]。2014年9月～2016年4月，本研究嘗試通過特異性敲除巨噬細胞的CXCR4基因，進而阻斷單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠的SDF-1/CXCR4軸對巨噬細胞的趨化作用，從而達到緩解腎間質(zhì)纖維化的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 巨噬細胞特異性表達Cre重組酶純合子(Lyzcre/cre)小鼠、CXCR4 loxp轉(zhuǎn)基因純合子(CXCR4loxp/loxp)小鼠，均引自美國Jackson Lab。將以上兩種轉(zhuǎn)基因小鼠進行飼養(yǎng)并雜交繁殖，子一代小鼠再與CXCR4loxp/loxp小鼠回交獲得子二代小鼠，篩選出基因型為Lyzcre/creCXCR4loxp/loxp或Lyzcre/-CXCR4loxp/loxp的小鼠16只。小鼠位于巨噬細胞的Cre重組酶可以被巨噬細胞特異性啟動子啟動進而能夠?qū)⒕奘杉毎蟽蓚€loxp位點間的目的基因序列刪除(即巨噬細胞上CXCR4基因被特異性敲除，以下簡稱KO小鼠)。KO小鼠均按照J(rèn)ackson Lab推薦的基因鑒定方案進行基因型鑒定。將KO小鼠隨機分為KO UUO組和KO Sham組各8只。另從成都達碩實驗動物有限公司購得野生型C57小鼠(WT小鼠)16只，將其隨機分為WT UUO組和WT Sham組各8只。以上小鼠均為雄性，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g。

1.2 主要試劑 引物，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；一步法小鼠基因鑒定試劑盒(PD101-01)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；巨噬細胞集落刺激因子(SRP3201)，購自美國Sigma公司；抗體anti-F4/80[CI∶A3-1](ab6640)、anti-F4/80(ab100790)、Anti-CXCR4[UMB2](ab124824)、anti-誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)(ab15323)、anti-CD206 (ab64693)、anti-SDF1(ab25117)和anti-α-Tubulin[DM1A] (ab7291)，均購自美國abcam公司。

1.3 UUO模型制備 KO UUO組、WT UUO組行單側(cè)輸尿管結(jié)扎。小鼠麻醉、消毒后，經(jīng)腹正中線切口暴露腹腔，游離左側(cè)腎臟及輸尿管，在左側(cè)輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3處分別結(jié)扎，剪斷輸尿管，縫合皮膚。KO Sham組、WT Sham組行假手術(shù)，僅開腹、暴露輸尿管但不結(jié)扎。UUO小鼠于術(shù)后第7天開始出現(xiàn)漸進性的腎盂積水，腎皮質(zhì)萎縮，腎小管管腔塌陷，大量上皮細胞死亡，間質(zhì)出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，而腎小球改變不明顯。于造模后第12天處死各組小鼠，取1/2新鮮左腎組織提取蛋白行Western blotting檢測，取其余1/2左腎組織制備石蠟切片。

1.4 巨噬細胞分離及CXCR4表達檢測 骨髓來源的巨噬細胞分離方法參照文獻[6]，切斷小鼠的股骨和脛骨，將骨髓細胞沖洗入培養(yǎng)基；待紅細胞裂解后，剩余的細胞計數(shù)并接種于培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)基中加入10 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子；過夜，收集未貼壁細胞，PBS清洗并接種于60 mm培養(yǎng)皿中(10% FBS的DMEM培養(yǎng)基+10 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子)，7 d后行F4/80和CXCR4免疫熒光雙標(biāo)染色檢測CXCR4表達。

1.5 小鼠腎間質(zhì)纖維化評估方法 ①腎小管病變程度評估：采用HE染色法。取石蠟切片常規(guī)HE染色，于光鏡(×400)下觀察。腎小管病變表現(xiàn)為腎小管擴張、上皮脫落和間質(zhì)擴增，依據(jù)皮質(zhì)受累程度將腎小管病變程度分為5級，0級：正常；1級：皮質(zhì)受累范圍≤25%；2級：皮質(zhì)受累范圍26%～50%；3級：皮質(zhì)受累范圍51%～75%；4級：皮質(zhì)受累范圍>75%[7]。②膠原沉積程度評估：采用Masson三色染色法。取石蠟切片染色，膠原纖維、黏液、軟骨呈亮藍色，胞質(zhì)、肌肉和纖維素呈紅色，胞核黑藍色。于高倍鏡下(×400)在皮質(zhì)區(qū)隨機采集互不重疊的10個視野的圖像(避開腎小球和大血管)，利用Image J圖像分析軟件計算出每個視野纖維化的區(qū)域(亮藍色)占總面積的百分比，觀察10個視野，取平均值[8]。③巨噬細胞浸潤情況評估：采用免疫組化染色法。取石蠟切片，以F4/80作為標(biāo)記巨噬細胞的一抗，檸檬酸鹽煮沸修復(fù)抗原，行常規(guī)免疫組化染色，巨噬細胞質(zhì)染色呈棕黃色。于高倍鏡下(×400)在皮質(zhì)區(qū)隨機采集互不重疊的8個視野的圖像(避開腎小球和大血管)。利用Image J圖像分析軟件計數(shù)巨噬細胞數(shù)量，觀察8個視野，取平均值。M1、M2型巨噬細胞計數(shù)方法：M1型巨噬細胞特異性標(biāo)記iNOS陽性，M2型巨噬細胞特異性標(biāo)記CD206陽性，二者陽性細胞顯示綠色熒光。于高倍鏡下(×400)在皮質(zhì)區(qū)隨機選取互不重疊的10個視野(避開腎小球和大血管)，分別采集不同激發(fā)波長的熒光圖像，利用Image J圖像分析軟件計數(shù)M1型及M2型陽性細胞個數(shù)，計算兩型細胞比值(M1/M2)。

1.6 小鼠腎組織中SDF-1、iNOS及CD206蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取1/2新鮮左腎組織提取總蛋白，測定蛋白濃度后，取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用SDF-1、iNOS、CD206抗體4 ℃孵育過夜，與辣根酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，然后與發(fā)光底物孵育，用Bio-Rad凝膠成像儀成像并使用Image Lab軟件檢測蛋白條帶的表達量。以α-Tubulin為內(nèi)參，蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/內(nèi)參蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1 KO小鼠基因鑒定結(jié)果 經(jīng)基因鑒定，KO小鼠的CXCR4 loxp標(biāo)記是純合子型，而Lyz Cre標(biāo)記是純合子或雜合子型。特異性敲除小鼠巨噬細胞上的CXCR4基因，其他組織、細胞中的CXCR4基因得以保留。對各組小鼠骨髓巨噬細胞進行分離培養(yǎng)，可見細胞一般為圓形或橢圓形，可呈多突形，部分細胞伸出偽足。對原代培養(yǎng)的巨噬細胞進行巨噬細胞特異性抗原F4/80和CXCR4免疫熒光雙標(biāo)染色，巨噬細胞純度達97%，且KO小鼠的巨噬細胞不表達CXCR4，而WT小鼠有豐富的CXCR4表達。見圖1。

注：A為待鑒定小鼠CXCR4基因擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，純合子(hemo)會在550 bp處出現(xiàn)條帶，雜合子(hemi)會在550、481 bp處出現(xiàn)條帶；B為待鑒定小鼠Lyz Cre基因擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，純合子(hemo)會在700 bp處出現(xiàn)條帶，雜合子(hemi)會在700、350 bp處均出現(xiàn)條帶； C為倒置顯微鏡(×200)下觀察到的原代培養(yǎng)的巨噬細胞。

2.2 各組腎間質(zhì)纖維化程度比較 見表1。

2.3 各組腎組織中SDF-1、iNOS和CD206蛋白表達比較 見表2。

表1 各組腎間質(zhì)纖維化程度比較±s)

注：與WT UUO組比較，*P<0.05；與對應(yīng)的Sham組比較，#P<0.01。

表2 各組腎組織中SDF-1、iNOS和CD206蛋白相對表達量比較±s)

注：與WT UUO組比較，*P<0.05；與對應(yīng)的Sham組比較，△P<0.05。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化的特征是細胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)異常積聚和腎臟結(jié)構(gòu)漸進性改變導(dǎo)致腎功能持續(xù)下降。研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟浸潤的巨噬細胞數(shù)量的增加程度與臨床預(yù)后(疾病進展、癥狀嚴(yán)重程度、纖維化可能性和小管萎縮)呈反比[1,2]。慢性腎病時，腎間質(zhì)浸潤的巨噬細胞主要是血行來源(只有少數(shù)來源于腎間質(zhì)固有巨噬細胞)，這些血行來源的巨噬細胞主要是因為慢性腎病時局部的炎性趨化作用轉(zhuǎn)移而來。趨化因子-受體軸(SDF-1/CXCR4)在趨化巨噬細胞歸巢中發(fā)揮重要作用。SDF-1是一種趨化因子，它有兩個特異性的跨膜蛋白受體CXCR4和CXCR7。在慢性腎病時腎組織的SDF-1顯著升高，相應(yīng)的間質(zhì)巨噬細胞數(shù)量也顯著升高，說明SDF-1/CXCR4軸在腎病時趨化巨噬細胞到腎臟發(fā)揮了重要作用。因為SDF-1/CXCR4軸是高度特異性結(jié)合，只要敲除或者阻止CXCR4發(fā)揮作用，即可阻止巨噬細胞通過此途徑向腎臟趨化聚集。基于此現(xiàn)象，部分研究通過系統(tǒng)性去除巨噬細胞而實現(xiàn)了對腎纖維化的抑制[3,9,10]，但是卻因為從整體上去除巨噬細胞增加了感染風(fēng)險和免疫缺陷。而有研究則采用趨化因子阻斷劑抑制巨噬細胞的趨化作用[1]，但這種廣泛性非特異性對趨化作用的阻斷會影響很多正常的生理功能，往往會增加嚴(yán)重感染的風(fēng)險及其他不良反應(yīng)。鑒于此，本研究只在巨噬細胞上去除趨化因子SDF-1的特異性受體CXCR4而阻止巨噬細胞在病理狀態(tài)下向腎臟聚集?；驐l件性敲除技術(shù)與常規(guī)的全基因組基因敲除將每一個體細胞上的特定基因位點均敲除掉不同，條件性基因敲除主要通過Cre/floxp位點特異性重組酶系統(tǒng)使靶基因的表達或缺失發(fā)生在試驗動物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官。通過該技術(shù)可以只敲除巨噬細胞上的CXCR4，進而只阻止巨噬細胞通過SDF-1/CXCR4軸聚集到腎臟。

本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬腎纖維化的經(jīng)典模型——UUO模型中[11]，腎小管損傷程度、間質(zhì)纖維化程度與間質(zhì)巨噬細胞的浸潤數(shù)量呈正比，說明腎間質(zhì)聚集的巨噬細胞參與了腎間質(zhì)纖維化的過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，在UUO模型的腎組織中SDF-1表達升高，相應(yīng)的間質(zhì)巨噬細胞數(shù)量也顯著升高，這證實了已有的研究結(jié)論，即SDF-1/CXCR4軸趨化巨噬細胞到腎臟發(fā)揮了重要作用[5]。因此，當(dāng)本研究利用基因條件性敲除技術(shù)只把巨噬細胞上的CXCR4敲除之后，顯著減少了巨噬細胞聚集到腎臟的數(shù)量；而與KO UUO組巨噬細胞的減少相伴隨的是其腎小管損傷程度及間質(zhì)纖維化程度的降低。不過需要注意的是，在KO UUO組，腎間質(zhì)仍然聚集了不少巨噬細胞，說明雖然SDF-1/CXCR4軸是趨化巨噬細胞到腎臟的一個重要途徑，但是任然存在其他途徑可以發(fā)揮類似作用。

為進一步了解特異性敲除巨噬細胞CXCR4之后可以緩解間質(zhì)纖維化程度的機制，本研究做了巨噬細胞M1型特異性標(biāo)記iNOS和M2型特異性標(biāo)記CD206的免疫熒光染色，同時對KO UUO組腎組織也做了iNOS及CD206的蛋白定量分析，這兩組數(shù)據(jù)均表明KO UUO組中M1/M2顯著升高。但由于KO Sham組和WT Sham組浸潤的巨噬細胞很少，加之本研究關(guān)注的是在不同條件下實驗終末期的M1/M2差異，所以并未測得Sham組iNOS、CD206的免疫熒光。M1型巨噬細胞以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎功能；M2型巨噬細胞以降低炎癥反應(yīng)、發(fā)揮組織修復(fù)功能為主。多項研究表明，腎間質(zhì)浸潤的M2型巨噬細胞通過多種途徑有力地促進了局部纖維化的發(fā)生發(fā)展[2,12,13]?？梢姡禺愋郧贸奘杉毎腃XCR4可能會阻止M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，但是更進一步的機制有待更深入研究。

綜上所述，特異性敲除UUO小鼠巨噬細胞CXCR4基因，可阻止巨噬細胞通過SDF-1/CXCR4軸趨化到腎間質(zhì)中，并且減少M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，而緩解UUO模型的腎間質(zhì)纖維化程度。這一發(fā)現(xiàn)為治療腎間質(zhì)纖維化提供了新思路。

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Mitigative effect of specific CXCR4 gene knockout in macrophages on renal interstitial fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction

ZHANGCuiwei1,XIONGXiaoming,LIUYong,RUANSibei,MAYuerong

(1ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610000,China)

Objective To investigate the mitigative effect and mechanism of specific CXCR4 gene knockout of macrophages on renal interstitial fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction (UUO).Methods We set up the mice models of CXCR4 gene knockout (KO mice) and divided them into KO UUO group and KO sham group with 8 rats in each group. Meanwhile, we divided 16 wild type C57 mice (WT mice) into WT UUO group and WT sham group with 8 rats in each group. On the twelfth day after UUO model was made, we sacrificed the mice to obtain the left kidney tissues. Then HE staining was used to evaluate the degree of renal tubular lesions, Masson staining to evaluate the degree of renal interstitial collagen deposition, immunohistochemical staining to evaluate the infiltration of macrophages in renal tissues and calculate the number and cell proportion of M1/M2 macrophages, and Western blotting to detect the expression of stromal cell derived factor 1 (SDF-1), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and CD206 protein in renal tissues.Results Compared with the KO sham group and WT sham group, the degree of renal tubular lesions and interstitial collagen deposition was reduced, the number of macrophages was decreased in KO UUO group and WT UUO group. Meanwhile, M1/M2 and the iNOS, SDF-1 protein expression in kidney tissues was increased (allP<0.05). In addition, the above indicators in the KO UUO group changed more significantly than those of the WT UUO group (allP<0.05).Conclusion Specific CXCR4 gene knockout of macrophages could prevent the macrophages from chemotaxis to the renal interstitial via the SDF-1/CXCR4 pathway, reducing M1 macrophage changing into M2 macrophage, thereby alleviating the degree of renal interstitial fibrosis of UUO mouse.

ureteral obstruction; renal interstitial fibrosis; stromal cell derived factor-1/CXC chemokine receptor 4 axis pathway; macrophages; gene knockout; mice

國家自然科學(xué)基金面上項目(81473522)。

張翠薇(1984-)，女，在讀博士，講師，主要研究方向為腎臟病理。E-mail：623910229@qq.com

簡介：馬躍榮(1956-)，男，碩士，教授，主要研究方向為腎臟病理。E-mail：mayr666@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.004

R693

A

1002-266X(2016)37-0011-04

2016-05-13)