子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)、比例變化及其意義

王興霞，康山，馬俊英，孫江慧，劉雪潔，李利

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

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子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)、比例變化及其意義

王興霞，康山，馬俊英，孫江慧，劉雪潔，李利

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

目的 觀察子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)計數(shù)、比例變化，并探討其意義。方法 選擇53例子宮內(nèi)膜腺癌患者為病例組，20例健康女性為對照組。采用Hladovec法對兩組行外周血總CECs計數(shù)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組外周血總CECs、活性循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(V-CECs)比例，并進(jìn)行比較。分析病例組外周血總CECs、V-CECs水平與腫瘤最大直徑、臨床分期、基層浸潤深度、細(xì)胞分化程度的關(guān)系。結(jié)果 病例組、對照組總CECs計數(shù)分別為20.00(8.75,32.65)、4.95(2.35,7.15)cells/μL，兩組比較，P<0.01。病例組、對照組總CECs比例分別為2.45%(1.15%,3.05%)、0.65%(0.35%,1.00%)，V-CECs比例分別為1.01%(0.45%,1.35%)、0.23%(0.10%,0.31%)，兩組比較，P均<0.01。病例組總CECs計數(shù)和總CECs、V-CECs比例與腫瘤最大直徑有關(guān)(P均<0.05)，與臨床分期、基層浸潤深度和細(xì)胞分化程度無關(guān)。結(jié)論 子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例升高，且與腫瘤最大直徑有關(guān)。CECs、V-CECs可能參與了子宮內(nèi)膜腺癌的血管生成，對其發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用，有可能成為評估腫瘤血管生成狀況、判斷療效的標(biāo)志物。

循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞；活性循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞；子宮腫瘤；子宮內(nèi)膜腺癌

循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)參與了腫瘤新生血管的生成，其機制可能為通過增殖、遷移、黏附形成血管管腔，為腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)、氧及轉(zhuǎn)移演變所需的渠道[1]。CECs分為休眠CECs(rCECs)、活性CECs(V-CECs)和凋亡CECs，其中發(fā)揮主要作用的是V-CECs[2]。大量文獻(xiàn)[3]報道，腫瘤患者外周血中CECs水平高于健康人，而當(dāng)病情達(dá)到完全緩解時，其數(shù)值又可降至正常水平。但CECs在子宮內(nèi)膜腺癌中的作用報道較少。本研究觀察了子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血CECs計數(shù)、比例變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年3～10月就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)后經(jīng)病理確診為子宮內(nèi)膜腺癌的53例患者為病例組，年齡27～69歲，其中子宮內(nèi)膜腺癌Ⅰ期37例、Ⅱ期12例、晚期(Ⅲ、Ⅳ期)4例。所有患者之前未接受過任何手術(shù)、放化療及其他抗腫瘤治療。同時選擇同期于我院體檢的健康成人20例為對照組，年齡29～62歲。兩組均排除患有其他原發(fā)性良惡性腫瘤、肺動脈高壓、系統(tǒng)性脈管炎、缺血性心臟病、免疫性疾病、糖尿病、感染性疾病等。兩組一般資料具有可比性。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 外周血總CECs計數(shù) 采用Hladovec法[4]。用含3.8%構(gòu)椽酸鈉抗凝的5 mL采血管采集外周血4.5 mL。將4.5 mL外周血離心(1 500 g，20 min)，取上清液，在上清液中加入0.2 mL的0.1%二磷酸腺苷液，振蕩10 min，再次離心(1 500 g，20 min)，將離心后所得的上清液再次離心(3 000 g，10 min)，得到沉淀物中即含有CECs。在沉淀物中加入0.1 mL生理鹽水，振蕩10 min，使沉淀物重懸后，取1滴于血細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)，同一標(biāo)本計數(shù)4次，取均數(shù)，單位為cells/μL。

1.3 外周血總CECs、V-CECs比例測算 采用流式細(xì)胞術(shù)[5]。用含EDTA-K2抗凝的血常規(guī)管采集外周血1 mL，置于4 ℃冰箱保存，2 h內(nèi)進(jìn)行檢測。將1 mL外周血混勻后，取100 μL至已加入CD45-PC5、CD146-FITC和CD106-PE各20 μL的試管中，振蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加溶血素2 mL，再次孵育10 min，上機檢測。檢測前需對流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢查，保證所用儀器的各種指標(biāo)在正常質(zhì)量控制允許范圍內(nèi)，主要方法有熒光補償和光流路質(zhì)量調(diào)控。通過前向角散射光和側(cè)向角散射光信號對單個核細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，此細(xì)胞群包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，每份標(biāo)本門內(nèi)細(xì)胞數(shù)在100 000個以上，然后分別計算CECs(CD45-CD146+)和V-CECs (CD45-CD146+CD106+)占此門內(nèi)的百分比。用EXPO 32 ADC軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(P25、P75)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例比較 病例組、對照組總CECs計數(shù)分別為20.00(8.75,32.65)、4.95(2.35,7.15)cells/μL，兩組比較，P<0.01。病例組、對照組總CECs比例分別為2.45%(1.15%,3.05%)、0.65%(0.35%,1.00%)，V-CECs比例分別為1.01%(0.45%,1.35%)、0.23%(0.10%,0.31%)，兩組比較，P均<0.01。

2.2 病例組外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。病例組總CECs計數(shù)和總CECs、V-CECs比例與腫瘤最大直徑有關(guān)(P均<0.05)，與臨床分期、基層浸潤深度和細(xì)胞分化程度無關(guān)。

表1 病例組外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系[中位數(shù)(P25、P75)]

3 討論

新生血管的生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤與新生血管相互影響，新生血管可提供營養(yǎng)物質(zhì)、氧等促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步生長并提供腫瘤轉(zhuǎn)移、進(jìn)展所需要的渠道；腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種促血管生成因子，其中VEGF是最有特征的血管生成調(diào)節(jié)因子[6]。研究[1]顯示，CECs通過增殖、遷移、黏附形成管腔，參與腫瘤新生血管的生成。同時亦有研究[7]證明，腫瘤血管是由CECs和腫瘤細(xì)胞襯于腔內(nèi)形成的復(fù)合體。Mancuso等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CECs水平在乳腺癌和淋巴瘤患者外周血中顯著高于正常人。

因CECs具有數(shù)量偏少、形態(tài)多樣、大小不一的特點，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)方法可用于CECs、V-CECs的分離檢測。之前采用Hladovec法、Percoll密度梯度法檢測CECs,其人為影響因素較多,檢測結(jié)果不夠精確[9]，但可廣泛用于研究初期階段。隨著技術(shù)的發(fā)展，后又出現(xiàn)了免疫磁珠分離技術(shù)和流式細(xì)胞儀法，這些方法有客觀、準(zhǔn)確、特異性強等優(yōu)勢。因CECs、V-CECs具有多種細(xì)胞免疫表型，選用哪些CD分子定義CECs、V-CECs目前尚未達(dá)成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，較廣泛認(rèn)可的是定義CD45-CD146+為CECs，定義CD45-CD146+CD106+為V-CECs。

本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例高于健康女性，此結(jié)果與Mancuso等[2]的研究結(jié)果相符。同時Bertolini等[10]研究發(fā)現(xiàn)，許多實體腫瘤患者外周血中CECs水平顯著高于正常人，而當(dāng)患者病情達(dá)到完全緩解時，CECs水平又可降至正常。多項研究顯示，CECs、V-CECs參與了腫瘤的血管生成，在多種腫瘤組織中均存在高表達(dá)。由此可認(rèn)為CECs和V-CECs參與了子宮內(nèi)膜腺癌的血管生成，可用來評估血管生成狀況，觀察其動態(tài)水平變化可用來評估抗血管生成藥物的治療效果。

Folkman等[11]首先提出了關(guān)于腫瘤血管生成假設(shè)的觀點和血管內(nèi)皮抑制素抗腫瘤血管生成作用的基本原理，腫瘤直徑越大，新生血管生成越多，外周血CECs、V-CECs水平越高。本研究結(jié)果顯示，腫瘤最大直徑<2 cm子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例低于≥2 cm者，這一結(jié)果與上述研究報道一致。Monestiroli等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CECs水平在移植人淋巴瘤的鼠模型中呈穩(wěn)步升高趨勢，CECs水平與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)關(guān)系。同時Rowand等[13]發(fā)現(xiàn)，在實體腫瘤患者外周血中，進(jìn)展期患者CECs水平較病情穩(wěn)定患者高。由此推斷，子宮內(nèi)膜腺癌腫瘤直徑越大，CECs、V-CECs水平越高。本研究發(fā)現(xiàn)，不同分期、肌層浸潤深度和細(xì)胞分化程度的子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。Kawaishi等[14]認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌患者外周血CECs水平在性別、吸煙史、病理類型、臨床分期上均無統(tǒng)計學(xué)差異。據(jù)此推測這些因素對子宮內(nèi)膜腺癌患者外周血總CECs計數(shù)及總CECs、V-CECs比例變化無影響。但由于本實驗病例組所含樣本量較少，依據(jù)不同因素分層后各組所含樣本數(shù)不足，后續(xù)實驗需進(jìn)一步擴大樣本量，對此結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步認(rèn)證。

對于多種實體腫瘤類型(包括卵巢癌、直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等)來說，抗血管生成治療已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)的治療選擇方式[15]，以總CECs、V-CECs為目標(biāo)的靶向治療有可能為子宮內(nèi)膜腺癌的治療提供新思路。

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2016-01-04)