轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化觀察

李琴，何伶俐，陳婷婷，龍密密，王誠

(六盤水市人民醫(yī)院，貴州六盤水 553001)

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轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化觀察

李琴，何伶俐，陳婷婷，龍密密，王誠

(六盤水市人民醫(yī)院，貴州六盤水 553001)

目的 觀察轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化情況。方法 原代提取成骨細(xì)胞，將細(xì)胞分為四組,Control組細(xì)胞不做任何處理，NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染無序siRNA，Lipo組細(xì)胞轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，ClC-3 siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA,各組細(xì)胞加載流體剪切力行力學(xué)刺激。采用MMT法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時的光密度值；同時檢測各組細(xì)胞堿性磷酸酶水平及成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)形成能力。結(jié)果 與Control組相比，ClC-3 siRNA組細(xì)胞各時點(diǎn)光密度值降低(P均<0.01)。ClC-3 siRNA組、Lipo組、NC組、Control組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶水平分別為(32.434±2.130)、(46.199±1.900)、(47.347±2.500)、(49.540±1.550)U/mL，鈣化結(jié)節(jié)形成能力分別為25.02%±3.46%、36.83%±4.54%、38.45%±4.84%、40.57%±2.22%，ClC-3 siRNA組與Control組相比，P均<0.01。結(jié)論 轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA可抑制大鼠成骨細(xì)胞的增殖、分化。

基因轉(zhuǎn)染；ClC-3蛋白；成骨細(xì)胞；氯通道；流體剪切力；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化；堿性磷酸酶

離子通道如鈣離子通道[1]、鉀離子通道[2]等與成骨分化及其相關(guān)功能有關(guān)，但氯離子通道與成骨的相關(guān)作用仍不甚了解。ClC家族屬于電壓門控類的離子通道，其家族成員ClC-3不僅在細(xì)胞容積調(diào)控中起重要作用，還與細(xì)胞增殖[3]、凋亡[4]、遷移[5]、破骨細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)酸化調(diào)節(jié)[6]等相關(guān)。研究[7]報道，氯通道參與成骨細(xì)胞的代謝活動。流體剪切力(FSS)是研究骨細(xì)胞對力學(xué)刺激反應(yīng)的方法。本研究用ClC-3 siRNA下調(diào)ClC-3氯通道蛋白表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化情況。

1 材料與方法

1.1 試劑 胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素(Hyclone，美國)；ClC-3一抗是兔源的多克隆抗體(Abcam，美國)；β-actin一抗購自博士德生物科技有限公司；二抗山羊抗兔IgG(H+L)購自碧云天公司(上海，中國)；堿性磷酸酶(ALP)染液D001-1購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定 取4只36 h內(nèi)出生的SD大鼠，拉頸處死，置75%乙醇浸泡20 min。取頭蓋骨置于無菌PBS液中，仔細(xì)刮除表面骨膜、血管等結(jié)締組織，將頭蓋骨剪碎至1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 000 r/min離心，去上清。加入0.25%胰酶溶液，37 ℃消化15 min。加入200 U/mL膠原酶Ⅰ消化液，37 ℃震蕩60 min。加入含10%胎牛血清(Gibco，美國)的DMEM(Gibco，美國)完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，去上清。加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞長到占培養(yǎng)皿的80%左右時進(jìn)行細(xì)胞傳代，每隔2～3 d傳代1次。取第3代的細(xì)胞，進(jìn)行鑒定。將細(xì)胞接種在12孔板，48 h后按照ALP染液操作說明書進(jìn)行鑒定。倒置相差顯微鏡(Olympus CKX41，日本)觀察，拍照，非貼壁的成骨細(xì)胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸沉降貼壁，剛貼壁的活細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則多角形，細(xì)胞核單核呈卵圓形，慢慢長匯合時細(xì)胞呈鋪路石狀，并可重疊生長，細(xì)胞核呈淡綠色，胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色至紅棕色，提示成功提取成骨細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組及ClC-3 siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d將對數(shù)生長期的細(xì)胞用不含抗生素的培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，過夜。將細(xì)胞分為四組，Control組細(xì)胞不做任何處理，NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染無序siRNA，Lipo組細(xì)胞轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，ClC-3 siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA。本研究中的ClC-3 siRNA為對應(yīng)于鼠源的ClC-3氯離子通道基因的siRNA雙鏈，由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，正義鏈序列：5′-CGAGAGAAGUGUAAGGACATT-3′，反義鏈序列：5′-UGUCCUUACACUUCUCUCGTT-3′。NC組正義鏈序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。用不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液稀釋LipofectamineTM2000和20 μmol/L siRNA，每孔用量分別為5、10 μL，室溫孵育5 min；將siRNA懸液和LipofectamineTM2000懸液混合，再孵育20 min；用不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入1 600 μL無血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液，將LipofectamineTM2000和siRNA混合液緩慢滴加到各孔內(nèi)，使終濃度為100 nmol/L，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6 h后換正常培養(yǎng)液，共培養(yǎng)48 h。大鼠成骨細(xì)胞ClC-3蛋白檢測采用Western blotting法。常規(guī)方法提取上述四組細(xì)胞總蛋白。將得到的蛋白進(jìn)行BCA蛋白定量及變性，每孔加樣20 μL(約含40 μg總蛋白)，用10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳和半干轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，ClC-3兔多克隆抗體和β-actin 4 ℃孵育過夜；TBST漂洗3次，每次10 min；然后與山羊抗兔IgG(H+L)二抗室溫孵育1 h，用TBST進(jìn)行3次漂洗，每次10 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。Image J 軟件進(jìn)行圖像分析，測定灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算相對比值。發(fā)現(xiàn)ClC-3 siRNA組較Control組的ClC-3蛋白表達(dá)下降(P<0.01)，NC組、Lipo組與Control組ClC-3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 大鼠成骨細(xì)胞FSS加載方法 用細(xì)胞拉應(yīng)力、壓應(yīng)力、流體切應(yīng)力加載分析系統(tǒng)(FX-5000，F(xiàn)lexcell，美國)加載FSS。系統(tǒng)以流室系統(tǒng)和灌流系統(tǒng)的其他部分組成完整的閉合環(huán)路，蠕動泵提供負(fù)壓動力，推動灌流液循環(huán)。以2×104/cm2的密度將轉(zhuǎn)染中的上述四組細(xì)胞接種在預(yù)置于培養(yǎng)皿中的長方形(50 mm×20 mm×0.20 mm)蓋玻片上，加入完全培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁融合生長。將蓋玻片放入流室系統(tǒng)(預(yù)先紫外線照射1 h)的方形槽中，流經(jīng)成骨細(xì)胞的切應(yīng)力、流量以及流室之間的關(guān)系公式為τ=6Qμ/bh2。其中τ為腔底切應(yīng)力(細(xì)胞所受的力，dyne/cm2)，Q為循環(huán)液流量(cm3/s)，μ為循環(huán)液黏度(0.01 dynes/cm2)，b為流室寬度(約為2 cm)，h為流室高度(約為0.025 cm)。調(diào)整蠕動泵轉(zhuǎn)速為28 r/min，通過流動腔流量Q為49.7 mL/min(0.833 cm3/s)，根據(jù)上述公式得出τ約為1.2 Pa(1.2 Pa=12 dyne/cm2)。加載時間為30 min/次，每隔24 h一次，持續(xù)72 h，相當(dāng)于人每天運(yùn)動30 min，模仿替代骨骼所受的生理刺激。

1.2.4 成骨細(xì)胞增殖能力觀察 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。按每孔100 μL、細(xì)胞懸液濃度為2.5×107cells/L處理后的細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板。分別觀察培養(yǎng)24、48、72 h后的OD值。在檢測OD值前加入MTT液10 μL/孔(5 g/L)，37 ℃孵育4 h，棄去液體，每孔加入100 μL鹽酸異丙醇溶解15～30 min，全自動酶標(biāo)儀測定570 nm波長的OD值。OD值代表細(xì)胞增殖能力。

1.2.5 成骨細(xì)胞ALP測定 取上述處理后的四組細(xì)胞，消化，制成3×104～5×104/mL濃度的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL加到96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，吸出96孔培養(yǎng)板的舊培養(yǎng)基，PBS洗2～3遍，按分組更換成已配置好的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，每組設(shè)復(fù)孔5個，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)72 h。根據(jù)南京建成公司生產(chǎn)的ALP測定試劑盒稍作改良進(jìn)行檢測，并計算ALP濃度。

1.2.6 成骨細(xì)胞鈣化功能觀察 取上述處理后的四組細(xì)胞，消化，同樣制成3×104～5×104/mL濃度的細(xì)胞懸液，按每孔500 μL接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后，倒棄培養(yǎng)基，PBS洗2～3遍，按實(shí)驗分組更換成已經(jīng)配置好的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)21 d，每2～3 d更換1次轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第21天時，倒棄培養(yǎng)基，PBS小心洗3次，加95%乙醇固定10 min。PBS輕輕反復(fù)洗滌5次，每次5 min。每孔加入0.1%茜素紅S(溶解于pH 8.3的Tris鹽酸)進(jìn)行染色，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min。單蒸水洗3次，晾干。倒置顯微鏡下觀察，拍照,計算染色面積。

2 結(jié)果

2.1 各組成骨細(xì)胞OD值比較 結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)時間各組成骨細(xì)胞OD值比較±s)

注：與Control組相比，*P<0.01。

2.2 各組成骨細(xì)胞ALP水平比較 ClC-3 siRNA組、Lipo組、NC組、Control組成骨細(xì)胞ALP濃度分別為(32.434±2.130)、(46.199±1.900)、(47.347±2.500)、(49.540±1.550)U/mL，ClC-3 siRNA組與Control組相比，P<0.01。

2.3 各組成骨細(xì)胞鈣化功能比較 ClC-3 siRNA組、Lipo組、NC組、Control組鈣化結(jié)節(jié)形成能力分別為25.02%±3.46%、36.83%±4.54%、38.45%±4.84%、40.57%±2.22%，ClC-3 siRNA組與Control組相比，P<0.01。

3 討論

人體的骨骼是一個具有很強(qiáng)調(diào)節(jié)能力的力學(xué)穩(wěn)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)[8]，能隨著日常生活中環(huán)境的變化而不斷地自我調(diào)整，以適應(yīng)不斷變化的生物力學(xué)需求。骨組織對力學(xué)刺激敏感，能夠感受到各種力學(xué)信號的傳導(dǎo)，而且成骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、分化和增殖也均與力學(xué)刺激相關(guān)[9]。FSS能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并明顯促進(jìn)細(xì)胞分化[10]。Pavalko等[11]認(rèn)為骨細(xì)胞的陷窩-小管結(jié)構(gòu)可以感受機(jī)械負(fù)荷引起的小管內(nèi)FSS，改變細(xì)胞膜的現(xiàn)狀。目前認(rèn)為骨細(xì)胞感受應(yīng)力的主要方式是FSS使細(xì)胞發(fā)生形變，引發(fā)局部的電位改變，形成力學(xué)和電化學(xué)耦聯(lián)，介導(dǎo)力學(xué)信號在細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)。骨組織中，能夠?qū)C(jī)械刺激信號轉(zhuǎn)變?yōu)樯盘柕膫鞲衅骺赡苁浅晒羌?xì)胞、骨細(xì)胞和骨襯里細(xì)胞。張力對骨組織的作用受到很多因素的影響，如力的大小、作用時間和速率等。一般加載的力小但時間長與較大而作用時間短的應(yīng)力產(chǎn)生的蛋白合成效應(yīng)結(jié)果相似[12]。氯通道參與成骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)過程，小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1在骨誘導(dǎo)分化過程中，高表達(dá)ClC-3氯通道蛋白，促進(jìn)成骨分化[7]。另有文獻(xiàn)[13]報道，骨硬化病是由于缺乏氯通道家族亞型中的ClC-7所導(dǎo)致。

骨骼細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)的重要組成成分包括調(diào)節(jié)一氧化氮和前列腺素E2的多囊腎蛋白2[14]、嘌呤信號途徑[1]、β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積聚[15]等，進(jìn)而啟動核轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮調(diào)控作用。本研究中的大鼠成骨細(xì)胞通過力學(xué)裝置加載FSS,模仿人體骨骼正常每天運(yùn)動時所受的生理刺激。ClC-3氯通道是容積敏感性氯通道，與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)、增殖、凋亡、周期、遷移或骨細(xì)胞內(nèi)酸化調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本研究主要探討ClC-3氯通道參與成骨細(xì)胞力學(xué)信號傳導(dǎo)可能機(jī)制，闡明ClC-3氯通道是否介導(dǎo)了FSS促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。

本研究通過原代提取小鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞，用ClC-3 siRNA下調(diào)ClC-3氯通道蛋白表達(dá)，觀察下調(diào)ClC-3氯通道對FSS刺激成骨細(xì)胞增殖和分化的影響，探討ClC-3作為FSS促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化可能的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，倒置顯微鏡下，成骨細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，細(xì)胞核單核呈卵圓形，可重疊生長；ALP鑒定成骨細(xì)胞陽性反應(yīng)為胞質(zhì)中呈現(xiàn)紅色至紅棕色，提示成功提取成骨細(xì)胞。ClC-3 siRNA組的ClC-3蛋白的表達(dá)明顯下降。在確認(rèn)ClC-3氯通道成功下調(diào)后，觀察下調(diào)ClC-3氯通道對FSS刺激成骨細(xì)胞增殖和分化的影響。FSS能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，伴隨明顯的促進(jìn)細(xì)胞分化[10]。那么氯通道是否參與了FSS促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖？本研究結(jié)果顯示，下調(diào)ClC-3氯通道蛋白表達(dá)后成骨細(xì)胞增殖明顯被抑制，提示ClC-3可能介導(dǎo)了FSS促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。骨型ALP是成骨細(xì)胞分化和功能的標(biāo)志物。鈣化結(jié)節(jié)形成能力是反映成骨細(xì)胞分化成熟功能的關(guān)鍵指標(biāo)，通過茜紅素S染色，顯示鈣化結(jié)節(jié)。茜紅素S能與鈣化結(jié)節(jié)中的鈣離子螯合，產(chǎn)生桔紅色沉積，桔紅色沉積即是鈣化結(jié)節(jié)。骨型ALP和鈣化結(jié)節(jié)均是成骨細(xì)胞分化形成成熟骨細(xì)胞能力的關(guān)鍵指標(biāo)。實(shí)驗結(jié)果顯示，ClC-3 siRNA組能明顯阻抑ALP的分泌并阻抑鈣化結(jié)節(jié)形成，推測ClC-3可能介導(dǎo)了FSS促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

哺乳動物對外界的環(huán)境極為敏感，能感受并傳導(dǎo)化學(xué)或力學(xué)信號。其中骨細(xì)胞對力學(xué)刺激尤為敏感，成骨細(xì)胞力學(xué)信號傳導(dǎo)的機(jī)制一直被研究，離子通道是學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)。離子通道的開放和關(guān)閉與力學(xué)刺激有關(guān)。FSS誘導(dǎo)的ATP釋放依賴于L型電壓敏感性鈣通道的開放使得鈣離子的進(jìn)入細(xì)胞[1]。細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如嘌呤信號途徑[1]、β連環(huán)素在胞質(zhì)內(nèi)大量積聚[15]，增強(qiáng)縫隙連接和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放等，都是成骨細(xì)胞感受機(jī)械刺激并作出力學(xué)傳導(dǎo)的早期事件[16]。另外，機(jī)械刺激能產(chǎn)生一氧化氮，而一氧化氮的產(chǎn)生能增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度和斷裂阻力，使得骨量和骨結(jié)構(gòu)做出相應(yīng)變化，以適應(yīng)機(jī)械的刺激[17]。

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Observation of cell proliferation and differentiation in rat osteoblasts tranfected by ClC-3 siRNA

LIQin,HELingli,CHENTingting,LONGMimi,WANGCheng

(ThePeople'sMunicipalHospitalofLiupanshui,Liupanshui553001,China)

Objective To observe the cell proliferation and differentiation in rat osteoblasts which were transfected by ClC-3 siRNA.Methods The primary osteoblasts were extracted and divided into 4 groups: the control group which was not treated, negative control (NC) group which was transfected by unordered siRNA, Lipo group which was transfected by lipofectamineTM2000 transfection reagents only and the ClC-3 siRNA group which was transfected by ClC-3 siRNA. All cells were cultured in the flow shear stress installation. The optical density (OD) values at 24, 48 and 72 h after culture in each group were detected by MTT. The alkaline phosphatase level and calcified nodule was also detected. Results Compared with the control group, the OD value of the ClC-3 siRNA group was decreased at each time points (allP<0.05). The alkaline phosphatase levels and calcified nodule forming abilities in the ClC-3 siRNA, Lipo, NC and control groups were (32.434±2.130), (46.199±1.900), (47.347±2.500) and (49.540±1.550) U/mL, and 25.02%±3.46%, 36.83%±4.54%, 38.45%±4.84% and 40.57%±2.22%, respectively. Significant difference was found between the ClC-3 siRNA group and the control group (allP<0.01).Conclusion After transfection of ClC-3 siRNA, the cell proliferation and differentiation of rat osteoblasts is inhibited.

gene transfection; ClC-3 protein; osteoblasts; chloride channel; flow shear stress; cell proliferation; cell differentiation; alkaline phosphatase

李琴(1987-)，女，碩士，初級技師，主要從事免疫及分子生物學(xué)研究。E-mail: pan417076448@qq.com

簡介：王誠(1967-)，男，主任技師，主要從事免疫及分子生物學(xué)研究。E-mail: jywangcheng@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.007

R331

A

1002-266X(2016)35-0024-04

2015-08-23)