轉(zhuǎn)染人源Omentin-1、Vaspin妊娠期糖尿病脂肪細(xì)胞胰島素受體底物和磷脂酰肌醇3激酶表達(dá)變化

潘寶龍，馬潤玫

(昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650031)

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轉(zhuǎn)染人源Omentin-1、Vaspin妊娠期糖尿病脂肪細(xì)胞胰島素受體底物和磷脂酰肌醇3激酶表達(dá)變化

潘寶龍，馬潤玫

(昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650031)

目的 觀察轉(zhuǎn)染人源網(wǎng)膜素1(Omentin-1)、內(nèi)臟脂肪組織源性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)的妊娠期糖尿病(GDM)脂肪細(xì)胞胰島素受體底物1/2(IRS-1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)表達(dá)變化。方法 復(fù)蘇、傳代及誘導(dǎo)分化GDM前脂肪細(xì)胞。構(gòu)建Omentin-1、Vaspin過表達(dá)載體，以3個(gè)不同過表達(dá)梯度(1.0、2.5、5.0 μg)轉(zhuǎn)染傳代脂肪細(xì)胞，以無轉(zhuǎn)染組為對(duì)照。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組脂肪細(xì)胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1/2、PI3K mRNA；采用Western blotting法檢測各組脂肪細(xì)胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1/2、PI3K蛋白及酪氨酸磷酸化IRS-1/2；采用[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取測定法測算各組脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取率。結(jié)果 隨Omentin-1表達(dá)增加，轉(zhuǎn)染人源Omentin-1脂肪細(xì)胞中IRS-1、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達(dá)增加，IRS-2 mRNA及蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化，IRS-1酪氨酸磷酸化程度明顯升高，IRS-2酪氨酸磷酸化程度未發(fā)生明顯變化，葡萄糖攝取率上升。隨Vaspin表達(dá)增加，轉(zhuǎn)染人源Vaspin脂肪細(xì)胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達(dá)均未出現(xiàn)明顯變化，IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度均未出現(xiàn)明顯變化，葡萄糖攝取率變化不明顯。 結(jié)論 轉(zhuǎn)染人源Omentin-1的GDM脂肪細(xì)胞IRS-1和PI3K(P85a)表達(dá)升高，葡萄糖攝取率升高；轉(zhuǎn)染人源Vaspin的GDM脂肪細(xì)胞無此變化。

妊娠期糖尿??；網(wǎng)膜素1；內(nèi)臟脂肪組織源性絲氨酸蛋白酶抑制劑；基因轉(zhuǎn)染；胰島素抵抗；胰島素受體底物1；胰島素受體底物2；磷脂酰肌醇3激酶

妊娠期糖尿病(GDM)是在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖尿病，嚴(yán)重威脅孕婦及其子代健康。至今為止GDM病因不明，眾多研究[1,2]一致認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。胰島素抵抗被認(rèn)為是GDM的始發(fā)因素，是目前公認(rèn)的GDM發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)之一，而胰島素信號(hào)通路異常是發(fā)生胰島素抵抗的主要原因[3,4]。近年來，來源于脂肪組織的脂肪因子與GDM的關(guān)系倍受關(guān)注，已成為新的研究熱點(diǎn)[5,6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在GDM患者血清及體內(nèi)網(wǎng)膜脂肪組織中，網(wǎng)膜素1(Omentin-1)出現(xiàn)了明顯的低表達(dá)，而內(nèi)臟脂肪組織源性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)出現(xiàn)了明顯高表達(dá)，提示兩者可能與GDM的胰島素抵抗存在關(guān)聯(lián)。本研究觀察了轉(zhuǎn)染人源Omentin-1、Vaspin的GDM脂肪細(xì)胞胰島素受體底物1/2(IRS-1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)表達(dá)變化，IRS-1/2酪氨酸磷酸化水平的變化，以及細(xì)胞葡萄糖攝取率的變化，探討脂肪因子Omentin-1、Vaspin與GDM胰島素抵抗的內(nèi)在聯(lián)系，為研究GDM發(fā)病機(jī)理和治療策略提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖杜爾液體培養(yǎng)基(HG-DMEM)及6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Hyclone)，蛋白酶抑制劑(美國Merckmi Lipore)，蛋白上樣緩沖液(上海Beyotime)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，0.45 μm，德國Millipore)，人源Omentin-1及Vaspin過表達(dá)載體(廣州復(fù)能基因公司)。Thermo CO2培養(yǎng)箱，AIRTECH超凈工作臺(tái)，上海菁華紫外分光光度計(jì)(752)，美國ABI RT-PCR儀，ABI 96孔定量PCR板，BIO-RAD電泳儀(164-5050)。

1.2 人前脂肪細(xì)胞獲取及傳代培養(yǎng) GDM患者大網(wǎng)膜前脂肪細(xì)胞的獲取符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得患者的知情同意。將凍存細(xì)胞從液態(tài)氮中取出，進(jìn)行復(fù)蘇和傳代，前脂肪細(xì)胞獲取及上述具體操作方法見課題組報(bào)道文獻(xiàn)。

1.3 Omentin-1、Vaspin過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 由廣州復(fù)能基因公司協(xié)助構(gòu)建(Omentin-1序列號(hào)EX-W1410-Lv105，Vaspin序列號(hào)EX-E0540-Lv105)。培養(yǎng)和篩選STBL3大腸桿菌單克隆菌株，經(jīng)震蕩培養(yǎng)和0.2 mL冰冷氯化鈣懸浮，將其制作為感受態(tài)細(xì)胞。分別取1 μL上述質(zhì)粒，加至制好的感受態(tài)細(xì)胞中，按照課題組報(bào)道文獻(xiàn)完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆及進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)過程。使用粒抽提試劑盒(美國TIANGEN)，按照說明書抽提得到過表達(dá)載體Omentin-1(0.495 μg/μL)，Vaspin(0.601 μg/μL)。誘導(dǎo)GDM人源第3代傳代前脂肪細(xì)胞，待其分化為成熟脂肪細(xì)胞后，將Omentin-1和Vaspin過表達(dá)載體分別按照0.0、1.0、2.5、5.0 μg共4個(gè)濃度梯度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每個(gè)濃度轉(zhuǎn)染6孔。

1.4 GDM脂肪細(xì)胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1、IRS-2、PI3K mRNA檢測 上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測Omentin-1、Vaspin、IRS-1、IRS-2、PI3K的mRNA。將定量PCR 96孔板置于冰上，總反應(yīng)體系為20 μL(相應(yīng)上下游引物各1 μL、RNA 1 μL、參比染料ROX 10 μL、蒸餾水7 μL)，使用ABI RT-PCR儀，反應(yīng)條件為95 ℃變性1 min，85 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。結(jié)果判讀：2-ΔΔCt計(jì)算各樣本相對(duì)拷貝值。以0.0 μg時(shí)為對(duì)照(設(shè)為1.00)，其余各濃度以均值的比值表示。

1.5 GDM脂肪細(xì)胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1、IRS-2、PI3K蛋白檢測 采用Western blotting法。細(xì)胞裂解液提取法提取細(xì)胞總蛋白，沸水浴5 min變性，BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)測定樣品中蛋白含量，計(jì)算出相應(yīng)加樣量。根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇和配制合適的SDS-PAGE分離膠和濃縮膠；加樣，120 V電泳，待溴酚藍(lán)泳至距離玻璃板下端1 cm位置停止，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，120 min，5%的牛血清白蛋白室溫封閉30 min；將切下的膜室溫孵育一抗60 min，PBS洗3次，室溫孵育二抗60 min；晾干PVDF膜，進(jìn)行顯影和定影，球面積分掃描儀檢測。以β-actin條帶為對(duì)照(設(shè)為1.00)，目標(biāo)蛋白測定值=待測條帶/β-actin。

1.6 GDM脂肪細(xì)胞酪氨酸磷酸化IRS-1、IRS-2檢測 Western blotting法觀察轉(zhuǎn)染后脂肪細(xì)胞中的IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化水平。操作步驟基本同1.5。

1.7 GDM脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取率計(jì)算 脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后以[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取測定法檢測葡萄糖攝取率，液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞分鐘衰變數(shù)，BCA法檢測蛋白濃度。[3H]-2DG攝取率=計(jì)數(shù)分鐘衰變數(shù)×2/蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉(zhuǎn)染后GDM脂肪細(xì)胞Omentin-1、Vaspin mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量 轉(zhuǎn)染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Omentin-1脂肪細(xì)胞Omentin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、34.11、207.72、1 104.35，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.94、1.99、2.91、4.54。轉(zhuǎn)染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Vaspin脂肪細(xì)胞Vaspin mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、7.44、1 105.78、9 543.26，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.91、2.47、4.39、4.97。

2.2 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉(zhuǎn)染后GDM脂肪細(xì)胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量 見表1。

表1 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉(zhuǎn)染后GDM脂肪細(xì)胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)的mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.3 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉(zhuǎn)染后GDM脂肪細(xì)胞IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度 轉(zhuǎn)染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Omentin-1脂肪細(xì)胞酪氨酸磷酸化IRS-1水平分別為0.56、0.72、1.51、2.34，IRS-2磷酸化水平分別為1.19、1.04、1.14、0.97。轉(zhuǎn)染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Vaspin脂肪細(xì)胞酪氨酸磷酸化IRS-1水平分別為0.88、0.79、0.86、0.91，酪氨酸磷酸化IRS-2水平分別為0.92、0.96、0.89、0.87。

2.4 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉(zhuǎn)染后GDM脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率 轉(zhuǎn)染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Omentin-1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率分別為1.00、1.21、1.26、1.44，轉(zhuǎn)染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Vaspin脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率分別為1.00、0.97、0.97、1.01。

3 討論

因涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原因，目前對(duì)于基因過表達(dá)與疾病的關(guān)系研究多以體外實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行，尤其對(duì)于人脂肪細(xì)胞的研究，更多的是采用了小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞[7,8]。嚙齒類動(dòng)物與人類存在明顯的遺傳學(xué)差異，且兩者之間的代謝途徑也迥然不同，因此，將其作為實(shí)驗(yàn)載體往往難以避免潛在的實(shí)驗(yàn)缺陷問題，從而影響數(shù)據(jù)和結(jié)論的科學(xué)性[9]。課題組在前期成功建立了GDM網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)及增殖分化模型，以人源細(xì)胞作為研究載體進(jìn)行后續(xù)有關(guān)GDM方面的研究更具科學(xué)性。并且，以取自GDM網(wǎng)膜組織而培養(yǎng)傳代的前脂肪細(xì)胞，可能更多地保留了GDM其他的一些基因信息，更真實(shí)地模擬了GDM基因環(huán)境，使結(jié)果更具有說服力。這也是本課題得以順利進(jìn)行的基礎(chǔ)條件和特點(diǎn)之一。

本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)得到的過表達(dá)載體分別以低(1.0 μg)、中(2.5 μg)、高(5.0 μg)3個(gè)濃度梯度轉(zhuǎn)染GDM脂肪細(xì)胞，而后以實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting驗(yàn)證相應(yīng)mRNA及蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)mRNA及蛋白表達(dá)水平均隨著過表達(dá)載體濃度增加而增加，充分說明所構(gòu)建GDM網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)及增殖分化模型真實(shí)有效，具有正常生理功能和表達(dá)能力，且所構(gòu)建Omentin-1、Vaspin過表達(dá)載體有效，隨梯度增加而表達(dá)增加。

目前眾多研究理論認(rèn)為，胰島素抵抗主要由受體后信號(hào)傳導(dǎo)的異常引起[10,11]。胰島素受體的信號(hào)傳導(dǎo)主要經(jīng)過兩個(gè)途徑，即磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑和Ras-絲分裂原激活的蛋白激酶(Ras-MAPK)途徑。PI3K途徑是胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑，也是胰島素對(duì)代謝調(diào)節(jié)的主要途徑，主要作用于葡萄糖攝取，糖原合成和降解的調(diào)節(jié)；Ras-MAPK途徑主要與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)，主要作用于細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié)[12,13]。兩條途徑相互獨(dú)立，在一定條件下，也能相互激活。其中，IRS是胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)的IRS分子包括四個(gè)亞型(IRS-1、IRS-2、IRS-3、IRS-4)。IRS-1是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的“船塢”蛋白，目前研究[14]認(rèn)為IRS-1的表達(dá)可能與具有2型糖尿病家族史的患者密切相關(guān)，IRS-1表達(dá)不足或者磷酸化異常可導(dǎo)致胰島素抵抗。IRS-2在胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生中起著極其重要的作用，一旦IRS-2的表達(dá)出現(xiàn)異常，機(jī)體將很快出現(xiàn)糖尿病樣癥狀[15]?；谏鲜隼碚摚狙芯繉?duì)Omentin-1、Vaspin與GDM胰島素PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)系進(jìn)行研究。

Omentin分為Omentin-1、Omentin-2，Omentin-1由網(wǎng)膜脂肪組織中的血管基質(zhì)細(xì)胞分泌入血，或作用于周圍脂肪細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)作用。有體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道，重組Omentin-1可促進(jìn)皮下及網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，提高胰島素敏感性，是胰島素“增敏因子”，但具體機(jī)制尚不明確[16]。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，隨孕婦體質(zhì)量增加(BMI值越高)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA)升高，血清Omentin-1水平不斷下降，Omentin-1水平與胰島素抵抗程度呈反比。本研究發(fā)現(xiàn)隨Omentin-1濃度增加，轉(zhuǎn)染人源Omentin-1脂肪細(xì)胞中IRS-1、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達(dá)增加，IRS-2 mRNA及蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化，IRS-1磷酸化程度明顯升高，IRS-2磷酸化程度未發(fā)生明顯變化，葡萄糖攝取率上升。結(jié)合課題組前期研究可以認(rèn)為，Omentin-1與GDM胰島素抵抗存在緊密的聯(lián)系，是機(jī)體的保護(hù)因子，對(duì)肥胖、糖尿病等具有拮抗作用，Omentin-1的表達(dá)可能通過某種途徑激活了IRS-1/PI3K(P85a)信號(hào)通路，間接導(dǎo)致了IRS-1和PI3K的活化和表達(dá)，并且促進(jìn)了IRS-1的磷酸化，從而提高脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，發(fā)揮其胰島素增敏作用，而與IRS-2沒有明顯關(guān)系。

近年來一些研究認(rèn)為，Vaspin是與肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病密切相關(guān)的脂肪因子之一。2型糖尿病患者由于存在胰島素抵抗，血糖水平不斷增高，血糖的升高可刺激脂肪組織分泌更多Vaspin來提高胰島素敏感性[17,18]。正常妊娠孕婦血清Vaspin水平則與胰島素敏感指數(shù)無關(guān)，GDM對(duì)孕婦血清Vaspin水平無影響[19]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前BMI、TG、FPG、OGTT 2 h是GDM患者血清Vaspin水平的獨(dú)立預(yù)測因子。本研究發(fā)現(xiàn)，隨Vaspin濃度增加，轉(zhuǎn)染人源Vaspin脂肪細(xì)胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達(dá)均未出現(xiàn)明顯變化，IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度均未出現(xiàn)明顯變化，葡萄糖攝取率變化不明顯。認(rèn)為Vaspin與GDM胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路受體下游分子IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)不存在明顯關(guān)聯(lián)，Vaspin的升高并不會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗及GDM的發(fā)生。Vaspin在GDM血清及網(wǎng)膜脂肪組織中的高表達(dá)，很可能只是一種肥胖、GDM糖脂代謝紊亂的補(bǔ)償機(jī)制，僅作為一種肥胖及糖脂代謝紊亂的“生物學(xué)標(biāo)志”，與GDM的胰島素抵抗的發(fā)生沒有必然聯(lián)系。

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Expression changes of IRS-1/2 and PI3K in GDM adipocyte cells after anthropogenic Omentin-1, Vaspin transfection

PANBaolong,MARunmei

(KunmingMedicalUniversity,Kunming650031,China)

Objective To observe the expression changes of insulin receptor substrate-1/2 (IRS-1/2) and phosphatidy inositol 3 kinase (PI3K) in gestational diabetes mellitus (GDM) adipocyte cells after anthropogenic Omentin-1, visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor (Vaspin) transfection. Methods Recoveried, extended and differentiated GDM preadipocyte cells were prepared, and then we built Omentin-1, Vaspin overexpression carrier, and transfected the extended adipose cells with different overexpression levels (1.0, 2.5 and 5.0 μg). Meanwhile, no transfection group was taken as the contrast. Using Q-PCR to detect the mRNA expression of Omentin-1, Vaspin, IRS-1/2 and PI3K (P85a), using Western blotting to detect protein expression of Omentin-1, Vaspin, IRS-1/2 and PI3K (P85a) as well as IRS-1/2 phosphorylation levels, using [3H]-2 -deoxidation-D-glucose uptake assay to detect the rates of glucose uptake in different transfection groups. Results With the increasing Omentin-1 expression, the mRNA and protein expression of IRS-1 and PI3K(P85a) were increased, but those of IRS-2 had no significant changes, IRS-1 phosphorylation increased obviously, IRS-2 phosphorylation had no significant changes, and the glucose uptake rate increased significantly. With the increasing Vaspin expression, all of the mRNA, protein and phosphorylation in IRS-1/2 and PI3K(P85a) had no significant changes, so did the glucose uptake rates. Conclusion In GDM adipocyte cells after anthropogenic Omentin-1 transfection, IRS-1, PI3K(P85a) and glucose uptake rates were increased, but no changes in those of GDM adipocyte cells after anthropogenic Vaspin transfection.

gestational diabetes mellitus; Omentin-1; visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor; gene transfection ; insulin resistance; insulin receptor substrate-1; insulin receptor substrate-2; phosphatidy inositol 3 kinase

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160082)。

潘寶龍(1973-)，男，副主任，副教授，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的研究。E-mail: pbl1210@126.com

簡介：馬潤玫(1962-)，女，主任，教授，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的研究。E-mail: pbl6916@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.003

R714.24

A

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2016-06-12)