不同產(chǎn)地魚腥草中槲皮苷含量測(cè)定

印曉紅，金漢臺(tái)，譚林威，何林旺，王建方，閔會(huì)，胡江寧

1.浙江康恩貝制藥股份有限公司藥品研發(fā)中心，浙江 杭州 310052；2.浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052；3.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400

·中藥研究與開發(fā)·

不同產(chǎn)地魚腥草中槲皮苷含量測(cè)定

印曉紅1，2，金漢臺(tái)3，譚林威1，2，何林旺3，王建方1，2，閔會(huì)1，2，胡江寧1，2

1.浙江康恩貝制藥股份有限公司藥品研發(fā)中心，浙江 杭州 310052；2.浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052；3.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400

目的建立魚腥草中槲皮苷含量的測(cè)定方法，比較不同產(chǎn)地魚腥草中槲皮苷含量差異。方法采用高效液相色譜法，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈-0.5%冰醋酸（19∶81），檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm，流速為1.0 mL/min。結(jié)果槲皮苷在0.064 56～3.228 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為97.68%，RSD＝1.3%（n＝6）；所測(cè)定的不同產(chǎn)地樣品中，四川產(chǎn)魚腥草的槲皮苷含量最高。結(jié)論本研究建立的方法快速簡(jiǎn)便，穩(wěn)定可靠，專屬性強(qiáng)。不同產(chǎn)地魚腥草中槲皮苷含量差異較大。

高效液相色譜法；魚腥草；槲皮苷；含量測(cè)定；不同產(chǎn)地

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分，味辛，微寒，歸肺經(jīng)，有清熱解毒、消痛排膿、利尿通淋之功效，用于肺癰吐膿、痰熱喘晐、熱痢、熱淋、癰腫瘡毒[1]。復(fù)方魚腥草合劑為魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花經(jīng)提取精制而成的中成藥制劑。魚腥草為復(fù)方魚腥草合劑中的君藥，但2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》并未對(duì)其進(jìn)行含量控制。槲皮苷具有抗病毒、抗炎、利尿等作用[2]，筆者采用HPLC測(cè)定魚腥草中槲皮苷的含量，用于魚腥草的質(zhì)量控制。同時(shí)對(duì)不同產(chǎn)地魚腥草中槲皮苷含量進(jìn)行對(duì)比分析，為更好地研究和開發(fā)利用這一藥用植物以及復(fù)方魚腥草合劑的質(zhì)量提升提供參考。

1　儀器與試藥

Agilent1200、Agilent1260高效液相色譜儀，Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、WelchXtimate-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。Sartorious BS210s電子天平，Mettler Toledo XP26電子天平。

槲皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111538-200504，含量測(cè)定用），水（純化水），乙腈（Merck，色譜純），其他試劑均為分析純。魚腥草藥材為浙江、江蘇、湖北、安徽、四川共5個(gè)產(chǎn)地15批市場(chǎng)流通商品，經(jīng)浙江康恩貝制藥股份有限公司高級(jí)工程師何厚洪鑒定為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分。

2　方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約1 g，精密稱定，精密加入50%乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取槲皮苷對(duì)照品16.14 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度為0.645 6 mg/mL的槲皮苷對(duì)照品貯備液。分別精密吸取一定量的槲皮苷對(duì)照品貯備液，以甲醇稀釋成濃度為6.456、12.91、32.28、64.56、129.1、322.8 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3色譜條件

固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈-0.5%冰醋酸（19∶81），檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按槲皮苷峰計(jì)應(yīng)不低于3000。

2.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液（32.28 μg/mL）、供試品溶液各10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果樣品中槲皮苷與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，理論板數(shù)按槲皮苷峰計(jì)不低于2000，保留時(shí)間約為14.0 min。

圖1　魚腥草中槲皮苷HPLC圖

2.5線性關(guān)系考察

吸取“2.2”項(xiàng)下不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品溶液濃度（C）進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程A＝290.610C－72.925，r2＝0.999 9。槲皮苷在0.064 56～3.228 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)

取魚腥草供試品溶液（5號(hào)），重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定槲皮苷的峰面積并計(jì)算，結(jié)果槲皮苷峰面積均值為640.9，RSD＝0.2%，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取魚腥草供試品溶液（5號(hào)），在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果峰面積均值為638.4，RSD＝0.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（5號(hào)）樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到樣品中槲皮苷平均含量為0.23%，RSD＝1.1%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的魚腥草樣品（5號(hào)）約0.5 g，精密稱定，共6份，精密加入濃度為0.645 6 mg/mL的槲皮苷對(duì)照品溶液2 mL，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為97.68%，RSD＝1.3%，加樣回收率良好，見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)

2.10耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別使用Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent SB-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Xtimate-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱測(cè)定，結(jié)果槲皮苷平均含量為0.23%，RSD＝1.4%（n＝6），表明不同色譜柱耐用性良好；取同一供試品溶液，微調(diào)流動(dòng)相比例并測(cè)定，結(jié)果槲皮苷平均含量為0.23%，RSD＝1.7%（n＝3），表明流動(dòng)相耐用性良好。

2.11不同產(chǎn)地藥材含量測(cè)定

取15批魚腥草藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同產(chǎn)地藥材含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝2）

3　討論

供試品溶液制備中，分別以25%甲醇、50%甲醇、75甲醇、甲醇、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、乙醇為溶劑回流提取1 h，結(jié)果50%乙醇提取樣品中槲皮苷含量明顯高于其他溶劑提取，因此確定50%乙醇為提取溶劑。并考察了超聲、回流提取方式，結(jié)果顯示回流提取效果更優(yōu)。分別回流提取30、60、90 min，結(jié)果表明三者無(wú)明顯差異，考慮方法耐用情況，選擇回流提取60 min。

以不同比例乙腈-水、乙腈-冰醋酸、甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-0.5%冰醋酸（19∶81）時(shí)，槲皮苷分離度高，穩(wěn)定性較好。

槲皮苷是魚腥草的次生代謝產(chǎn)物。植物次生代謝產(chǎn)物的積累是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，受許多環(huán)境因素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，將貫葉連翹移栽到土耳其北部的幾個(gè)不同地方，其主要有效成分金絲桃素、綠原酸等含量差異很大[3]。長(zhǎng)白山地區(qū)的高山紅景天中紅景天苷的含量受土壤營(yíng)養(yǎng)成分影響，富含有機(jī)質(zhì)、低pH值及含氮豐富的土壤有利于紅景天苷的積累[4]。

目前，魚腥草中槲皮苷含量測(cè)定方法研究有少量報(bào)道，其前處理方法、流動(dòng)相選擇、色譜柱各有不同，更有以槲皮素為檢測(cè)指標(biāo)監(jiān)控槲皮苷的變化情況[5-8]。本研究建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確并較耐用的測(cè)定魚腥草中槲皮苷含量的RP-HPLC分析方法。以槲皮苷含量為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)多批市場(chǎng)流通的不同產(chǎn)地魚腥草藥材進(jìn)行測(cè)定，了解魚腥草藥材的內(nèi)在質(zhì)量情況，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地魚腥草藥材的槲皮苷含量差異較大，以四川產(chǎn)魚腥草中槲皮苷含量最高，可為復(fù)方魚腥草合劑的質(zhì)量提升提供參考。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015：224.

[2] 金光洙,王煥清,莫風(fēng)奎.黃酮類化合物——櫟苷的分子結(jié)構(gòu)研究[J].沈陽(yáng)藥學(xué)院學(xué)報(bào),1994,11(2)：91-95.

[3] CIRAK C, RADULIEN J, KARABK B, et al. Variation of bioactive substances and morphological traits in Hypericum perforatum populations from Northern Turkey[J]. Bioche Syst Ecol,2007, 35(7)：403-4091.

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[5] 彭麗華,蔡品,盧紅梅.魚腥草中主要黃酮成分含量測(cè)定及其道地性研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2012,26(5)：21-23.

[6] 何兵,劉艷,李春紅,等.一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定魚腥草不同部位中6種活性成分的量[J].中草藥,2013,44(15)：2160-2164.

[7] 俞建平,張文婷,祝明.高效液相色譜法測(cè)定魚腥草中槲皮苷的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,27(3)：331.

[8] 鄭一敏,胥秀英,傅善權(quán),等.高效液相色譜法測(cè)定魚腥草中金絲桃苷與槲皮苷的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2005,19(3)：27-28.

Determination of Quercitrin in Houttuyniae Herba from Different Producing Areas

YIN Xiao-hong1,2, JIN Han-tai3, TAN Lin-wei1,2, HE Lin-wang3, WANG Jian-fang1,2, MIN Hui1,2, HU Jiang-ning1,2
(1. Zhejiang CONBA Pharmaceutical Co.,LTD., Hangzhou 310052, China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Technology, Hangzhou 310052, China; 3. Zhejiang CONBA Chinese Medicine Co.,LTD., Lishui 323400, China)

Objective To establish a method to determine the content of quercitrin in Houttuyniae Herba; To compare the differences in the content of quercitrin in Houttuyniae Herba from different producing areas. Methods HPLC was used with octadecylsilane-bonded silica gel as the stationary phase and a mixture of acetonitrile and 0.5% HAc (19:81) as the mobile phase. The detection wavelength was 256nm.vThe flow rate was 1.0 mL/min. Results It was shown that quercitrinwas in a good linear relationship in the range of 0.064 56–3.228 μg. The average recovery of quercitrin was 97.68%, RSD=1.3% (n=6). Houttuyniae Herba from Sichuan Province contains the highest content of quercitrin. Conclusion This method is simple and rapid, with stability, reliability and strong specificity. The contents of quercitrin in Houttuyniae Herba from different producing areas were quite different.

HPLC; Houttuyniae Herba; quercitrin; content determination; different producing areas

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.019

R284.1

A

1005-5304(2016)12-0078-03

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C03005）

胡江寧，E-mail：hujn@conbagroup.com

（2015-12-03）

（2016-01-18；編輯：陳靜）