甘肅地產(chǎn)四倍體黃芩與二倍體黃芩清熱燥濕作用比較研究

楊志軍，張金保，楊秀娟，陳靜，杜弢，2

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000

甘肅地產(chǎn)四倍體黃芩與二倍體黃芩清熱燥濕作用比較研究

楊志軍1，張金保1，楊秀娟1，陳靜1，杜弢1，2

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000

目的比較甘肅地產(chǎn)四倍體與二倍體黃芩清熱燥濕作用。方法SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、二倍體黃芩低劑量組、二倍體黃芩高劑量組、四倍體黃芩低劑量組、四倍體黃芩高劑量組。采用高脂高糖飲食加白酒及大腸桿菌感染方法誘導大鼠濕熱模型，各給藥組給予相應藥物灌胃，正常對照組予生理鹽水，每日1次，連續(xù)7 d。觀察大鼠肛溫、體質(zhì)量等體征變化，檢測大鼠血清白細胞介素-4（IL-4)、干擾素-γ（IFN-γ)、胃動素（MTL)、胃泌素（GAS）及胃腸組織MTL、GAS含量。結(jié)果與正常對照組比較，模型組大鼠肛溫顯著升高，體質(zhì)量降低，血清IL-4、IFN-γ含量顯著升高，胃腸組織及血清MTL、GAS含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量、肛溫，血清IL-4、IFN-γ、GAS、MTL及胃腸組織GAS、MTL均有不同程度的變化；與低劑量組比較，二倍體、四倍體黃芩高劑量組血清IL-4、IFN-γ含量顯著降低（P＜0.05），血清及胃腸組織GAS、MTL含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論甘肅地產(chǎn)二倍體黃芩和四倍體黃芩均有清熱燥濕作用。

黃芩；四倍體；二倍體；清熱燥濕；大鼠

黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血安胎等功效，臨床應用歷史悠久。2006年，甘肅中醫(yī)學院藥用植物遺傳育種研究所與甘肅神農(nóng)文峰藥業(yè)有限公司聯(lián)合引進中國藥科大學高山林教授等培育的四倍體黃芩新品系D20，在甘肅渭源進行大規(guī)模的大田種植。由于多倍體植物染色體加倍，四倍體黃芩新品系D20具有生長勢旺、抗逆性強、增產(chǎn)潛力大等優(yōu)勢[1]。因此，本實驗主要比較甘肅地產(chǎn)二倍體與四倍體黃芩水煎液對濕熱模型大鼠的清熱燥濕作用，為四倍體黃芩新品系D20的應用提供藥效學依據(jù)。

1　實驗材料

1.1動物和飼料

3月齡SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物室，溫度20～25 ℃，濕度40%～50%。普通飼料由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，肥甘飼料為普通飼料粉碎后加入20%豬油、8%蜂蜜混勻后加工而成。

1.2藥物及制備

甘肅地產(chǎn)二倍體和四倍體黃芩，甘肅中醫(yī)藥大學藥用植物遺傳育種研究所。采集于甘肅渭源，均為2年生二倍體或四倍體黃芩根，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥用植物遺傳育種研究所杜弢教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的根。水煎液制備：將二倍體、四倍體黃芩干燥藥材快速漂洗，蒸至“圓汽”后30 min，取出，晾干，切片[2]。分別取適量二倍體、四倍體黃芩，第1次加10倍量水，浸泡30 min，文火加熱50 min，過濾，再加8倍量水復煎40 min，合并2次濾液，水浴濃縮為含原藥材1 g/mL的藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3致病菌

大腸桿菌，甘肅省人民醫(yī)院，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學微生物室培育，并配制成109/mL濃度的菌液待用。

1.4主要試劑和儀器

白細胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、胃動素（MTL）、胃泌素（GAS）試劑盒，上海豐翔生物科技有限公司，批號201504。酶標儀（BIO-RAD，型號BIOZYMEⅢ），超細勻漿機（上海弗魯克，型號F6/10-10G），氣浴恒溫搖床（北京博勵行儀器公司，型號GFL3033），電子體溫計（北京綠源恒泰醫(yī)療器械公司，型號MT-502A），離心機（湖南星科科學儀器公司，型號DL-5M），電子天平（慈溪市天東衡器廠，型號HX1001T）。

2　實驗方法

2.1分組

將60只SD大鼠適應性喂養(yǎng)2 d后，隨機分為正常對照組、模型組、二倍體黃芩低劑量組、二倍體黃芩高劑量組、四倍體黃芩低劑量組、四倍體黃芩高劑量組。

2.2造模

參照文獻[3-5]方法造模。大鼠給予肥甘飼料喂養(yǎng)，給予白酒灌胃（56度紅星二鍋頭，5 mL/kg），每日1次，并置于人工氣候箱中（溫度35 ℃，濕度95%，每日9－11時、15－17時）。第22日，給予濃度為109/mL大腸桿菌灌胃1次（2 mL/200 g），4 h后加強感染1次（1 mL/200 g），置于自然環(huán)境，普通飼料喂養(yǎng)，檢測大鼠肛溫、體質(zhì)量變化。

2.3給藥

各給藥組分別給予二倍體、四倍體黃芩水煎液灌胃（低劑量組5 g/kg、高劑量組10 g/kg），正常對照組大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，給予生理鹽水10 mL/kg灌胃。每日1次，連續(xù)7 d。給藥劑量參照《中藥藥理實驗方法學》[6]進行換算，大鼠與人的等效劑量作為低劑量組，2倍量為高劑量組。

2.4樣品制備

各組大鼠于取材前禁食不禁水12 h后，股動脈取血，靜置30 min，3000 r/min離心10 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存。大鼠處死后，將大鼠腹腔剪開，取各組大鼠同一部位胃體及結(jié)腸各0.5 g，用清水沖洗，濾紙吸干。0 ℃冰浴條件下，分別將胃、結(jié)腸組織用生理鹽水制成10%勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液備用。

2.5檢測指標

2.5.1癥狀及體征觀察根據(jù)脾胃濕熱證的臨床特點，確定以大鼠的精神狀態(tài)、食量、飲水量、糞便、體質(zhì)量、肛溫等為觀察指標。

2.5.2血清白細胞介素-4、干擾素-γ、胃動素、胃泌素含量檢測取血清，ELISA測定IFN-γ、IL-4、GAS、MTL含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。2.5.3胃、結(jié)腸組織胃動素和胃泌素含量檢測取胃、結(jié)腸組織上清液，ELISA測定GAS、MTL含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3　統(tǒng)計學方法

4　結(jié)果

4.1癥狀體征變化

造模開始1～5 d，各組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，飲食、飲水量及大小便正常；隨著造模時間的推進，模型組大鼠飲食飲水量明顯減少，嗜睡懶動，毛發(fā)疏松粗糙，陰囊松馳下垂，大便溏結(jié)不調(diào)，小便黃濁，體質(zhì)量增長緩慢；大腸桿菌灌胃后，大鼠出現(xiàn)不同程度的寒顫、發(fā)熱、泄瀉、呼吸急促、扎堆等現(xiàn)象；造模23 d后，與正常對照組比較，其余各組體質(zhì)量增長明顯緩慢，肛溫明顯升高；藥物治療后，各給藥組大鼠體質(zhì)量增長較模型組明顯增快，肛溫明顯下降，精神、飲食狀況好轉(zhuǎn)，大小便逐漸恢復正常，但毛發(fā)仍然疏松粗糙。

4.2肛溫變化

造模前，各組大鼠肛溫無明顯差異（P＞0.05）；造模后，與正常對照組比較，各組大鼠肛溫顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，治療后各給藥組大鼠肛溫明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠肛溫比較（±s，℃）

表1　各組大鼠肛溫比較（±s，℃）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù) 造模前　造模后　治療后正常對照組 10 36.85±0.31　37.11±0.51　37.33±0.36模型組 10 36.95±0.70　39.98±0.23##39.48±0.37##二倍體黃芩低劑量組 10 37.13±0.43　39.70±0.22##38.35±0.54*二倍體黃芩高劑量組 10 37.20±0.49　39.65±0.58##38.13±0.32*四倍體黃芩低劑量組 10 37.06±0.16　39.94±0.32##38.45±0.34*四倍體黃芩高劑量組 10 37.20±0.48　39.58±0.34##38.26±0.35*

4.3體質(zhì)量變化

造模前，各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；造模后，與正常對照組比較，各組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，治療后各給藥組大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2　各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表2　各組大鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù)造模前　造模后　治療后正常對照組 10 187±12.7 223±12.8 244±14.1模型組 10 187±17.6 208±10.2#221± 6.7#二倍體黃芩低劑量組10 181±15.7 205±10.7#232±12.7*二倍體黃芩高劑量組10 187±12.6 206± 8.6#239±12.5*四倍體黃芩低劑量組10 183± 4.8 207± 9.0#231± 5.6*四倍體黃芩高劑量組10 182± 9.1 207±14.8#236± 6.6*

4.4四倍體黃芩和二倍體黃芩對模型大鼠血清白細胞介素-4、干擾素-γ、胃動素、胃泌素含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清IL-4、IFN-γ含量顯著升高，MTL、GAS含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，二倍體黃芩高劑量組及四倍體黃芩高、低劑量組大鼠血清IL-4、IFN-γ含量顯著降低而GAS、MTL含量顯著升高（P＜0.05），二倍體黃芩低劑量組大鼠血清IL-4、IFN-γ含量顯著降低，MTL含量顯著升高（P＜0.05）；與同一品種低劑量組比較，二倍體黃芩、四倍體黃芩高劑量組大鼠血清IL-4、IFN-γ含量顯著降低，GAS含量顯著升高（P＜0.05）；不同品種同等劑量組比較，四倍體黃芩低劑量組大鼠血清IFN-γ含量顯著高于二倍體黃芩低劑量組（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3　各組大鼠血清IL-4、IFN-γ、MTL、GAS含量比較（±s，ng/L）

表3　各組大鼠血清IL-4、IFN-γ、MTL、GAS含量比較（±s，ng/L）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與同一品種低劑量組比較，▲P＜0.05；與二倍體黃芩低劑量組比較，△P＜0.05

組別 只數(shù)　IL-4　IFN-γ　MTL　GAS正常對照組 10 25.67±2.52　637.28±22.08 477.96±25.23 37.68±0.96濕熱模型組 10 38.09±1.41#1203.90±32.24#404.16±18.48#28.61±0.12#二倍體黃芩低劑量組 10 30.71±3.19*　801.44±20.59*456.81± 8.28*30.28±1.58二倍體黃芩高劑量組 10 26.88±2.91*▲　679.02±30.72*▲475.04±28.79*34.77±2.65*▲四倍體黃芩低劑量組 10 30.92±4.91*　839.91±24.07*△457.38±25.90*31.33±2.46*四倍體黃芩高劑量組 10 26.54±1.73*▲　691.80±24.96*▲459.28±17.64*34.96±2.96*▲

4.5四倍體黃芩和二倍體黃芩對模型大鼠胃和結(jié)腸組織胃動素和胃泌素含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胃腸組織MTL、GAS含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，二倍體黃芩、四倍體黃芩高劑量組大鼠胃、結(jié)腸組織MTL、GAS含量顯著升高（P＜0.05），二倍體黃芩、四倍體黃芩低劑量組大鼠胃、結(jié)腸組織MTL和結(jié)腸組織GAS含量顯著升高（P＜0.05）；與同一品種黃芩低劑量組比較，二倍體黃芩高劑量組大鼠結(jié)腸組織GAS、MTL及四倍體黃芩高劑量組結(jié)腸組織MTL含量顯著升高（P＜0.05）；不同品種同等劑量黃芩組比較，四倍體黃芩低、高劑量組大鼠結(jié)腸組織MTL含量顯著高于二倍體黃芩低、高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4　各組大鼠胃、結(jié)腸組織MTL和GAS含量比較（s，ng/L）

表4　各組大鼠胃、結(jié)腸組織MTL和GAS含量比較（s，ng/L）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與同一品種低劑量組比較，▲P＜0.05；與二倍體黃芩同等劑量組比較，△P＜0.05

MTL GAS組別 只數(shù)胃組織　結(jié)腸組織　胃組織　結(jié)腸組織正常對照組 10 856.42±13.48 836.79±14.93 70.94±6.36 83.16±6.57模型組 10 525.79±13.56#567.45±12.95#60.27±7.94#62.76±2.54#二倍體黃芩低劑量組 10 805.12± 8.36*762.66±15.09*64.74±5.07 70.56±4.07*二倍體黃芩高劑量組 10 820.70±14.00*802.71±14.24*▲68.80±4.41*79.10±9.93*▲四倍體黃芩低劑量組 10 805.91±24.97*743.75±19.35*△65.46±2.13 71.59±2.56*四倍體黃芩高劑量組 10 803.87±20.81*766.53±16.59*▲△69.35±6.99*78.21±5.86*

5　討論

黃芩首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品?！肚Ы鹨矸健酚涊d甘肅的地理環(huán)境較適合黃芩的生長。近年來，黃芩在甘肅栽培面積大、產(chǎn)量高，被列為“十大隴藥”之一。由于同源四倍體黃芩植株高大，莖粗葉厚，生長期延長，生活力及抗逆性均增強，具有較高的增產(chǎn)潛力。因此，甘肅中醫(yī)藥大學與甘肅神農(nóng)文峰藥業(yè)有限公司聯(lián)合引進了四倍體黃芩新品系D20，在渭源縣進行了種植。目前，從綜合產(chǎn)量、適應性、抗病性、黃芩苷含量、抗炎、止血等方面進行了考察[7-8]，證實四倍體黃芩綜合性狀優(yōu)良。

黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，善治中上焦?jié)駸嶙C?，F(xiàn)代藥理研究證明，黃芩具有抗炎、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛等作用[9]。本實驗檢測黃芩水煎液對濕熱模型大鼠體質(zhì)量、肛溫和血清IL-4、IFN-γ、MTL、GAS及胃腸組織MTL、GAS含量的影響，從而比較甘肅地產(chǎn)四倍體黃芩和二倍體黃芩的清熱燥濕作用。

脾胃濕熱證，其發(fā)生發(fā)展是由多種原因造成的，可概括為外感病邪、內(nèi)傷七情、飲食勞倦、體質(zhì)因素等方面。本實驗通過采用“高脂高糖、白酒飲食＋人工氣候箱＋產(chǎn)毒性大腸桿菌”建立大鼠濕熱證模型?！镀⑽刚摗酚小帮嬍呈Ч?jié)，甘肥過度，脾胃乃傷”，可見過度肥甘飲食導致的脾胃虛弱是濕熱發(fā)病的前提條件，給予大鼠高脂高糖飲食加產(chǎn)毒性大腸桿菌，可造成大鼠脾胃功能損傷，為脾胃濕熱的形成提供了條件?！督饏T翼》記載“有飲食之濕，酒水乳酪之類也”，選用白酒灌胃亦能促進濕熱證形成。本模型充分模擬了脾胃濕熱證的臨床發(fā)生過程。

胃腸的運動和功能障礙是濕熱證常見的表現(xiàn)。濕熱病邪為患時，濕熱郁蒸，氣血阻滯，易傷脾、胃、腸，脾主運化，胃主收納，濕熱證的胃腸運動呈現(xiàn)亢奮和抑制交替的病理狀態(tài)，胃腸激素GAS、MTL等的生理作用是調(diào)節(jié)消化器官的運動、分泌和吸收，故MTL和GAS的變化是濕熱證胃腸運動消化吸收紊亂的一種體現(xiàn)[10]。GAS是由胃竇和十二指腸黏膜G細胞分泌的一種激素，其主要生物效應是刺激胃酸分泌、促進胃腸黏膜生長和胃腸胰蛋白質(zhì)、RNA、DNA合成。GAS分泌減少導致胃酸分泌減少，會影響胃腸道消化功能。MTL因能刺激胃小體運動而得名，其主要生理活性為刺激胃腸運動及促進胃蛋白酶分泌，對消化道運動的調(diào)節(jié)有重要作用。MTL分泌減少，則胃腸收縮蠕動減緩，消化功能受到影響。

有研究表明，脾胃濕熱證存在一定的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，處于抑制或亢進的狀態(tài)，說明細胞因子介導了脾胃濕熱證機體內(nèi)的炎癥反應[11-12]。IFN-γ、IL-4分別是Th1、Th2分泌的促炎細胞因子，具有廣泛的生物活性，2種細胞因子相互調(diào)整、相互抑制的平衡狀態(tài)使機體在抵御病原侵襲和維持免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定上保持協(xié)調(diào)平衡。因此，檢測IFN-γ、IL-4能夠反映機體的免疫功能狀態(tài)。

本實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肛溫顯著升高，體質(zhì)量顯著降低，血清IL-4、IFN-γ含量顯著升高，胃腸組織及血清MTL、GAS含量顯著降低，說明造模成功[13-14]。與模型組比較，各給藥組對濕熱大鼠體質(zhì)量、肛溫和血清IL-4、IFN-γ、GAS、MTL及胃腸組織GAS、MTL含量均有不同程度的影響，說明二倍體、四倍體黃芩高、低劑量水煎液均有一定的清熱燥濕作用。各給藥組間兩兩比較，二倍體、四倍體黃芩高劑量清熱燥濕作用顯著優(yōu)于低劑量，四倍體黃芩高、低劑量清熱燥濕作用與二倍體黃芩無顯著差異。

本實驗結(jié)果表明，甘肅地產(chǎn)二倍體黃芩和四倍體黃芩均有清熱燥濕作用，二者清熱燥濕作用無顯著差異。有關(guān)四倍體黃芩的臨床安全性，尚有待進一步評價。

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Comparison of Heat-clearing and Damp-drying Effects between Tetraploid and Diploid Scutellariae Radix Cultivated in Gansu Province

YANG Zhi-jun1, ZHANG Jin-bao1, YANG Xiu-juan1,CHEN Jing1, DU Tao1,2
(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Institute of Medicinal Plant Genetics and Breeding, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective To compare heat-clearing and damp-drying effects of tetraploid and diploid Scutellariae Radix cultivated in Gansu Province. Methods SD rats were randomly divided into normal control group, model group, diploid Scutellariae Radix low- and high-dose groups, tetraploid Scutellariae Radix low- and high-dose groups. High-fat, high-sugar diet, liquor and escherichia infection method were used to induce the rat models of dampness-heat syndrome. Each medication group

relevant medicine for gavage, while normal control group

NS with same volume for gavage, once a day for 7 days. The changes of rat rectal temperatures and body weights were investigated. The contents of IL-4, IFN-γ, and MTL in rat serum and MTL and GAS in gastrointestinal tissues were detected. Results Compared with the normal control group, rat rectal temperatures of model control groups increased significantly (P＜0.05) and body weights were significantly reduced (P＜0.05); The contents of IL-4, IFN-γ, and MTL in model rat serum increased significantly and MTL and GAS in gastrointestinal tissues were significantly reduced (P＜0.05). Compared with the model group, each medication group had impact on the body weight and rectal temperatures, IL-4 and IFN-γ, GAS and MTL in serum, and GAS and MTL in gastrointestinal tissues to some degree; Compared with the low dose group, the contents of serum IL-4 and IFN-γ decreased significantly in high dose of diploid and tetraploid Scutellariae Radix group (P＜0.05), the contents of GAS and MTL in gastrointestinal tissues increased significantly in high dose of diploid and tetraploid Scutellariae Radix group (P＜0.05). Conclusion Both of tetraploid and diploid Scutellariae Radix cultivated in Gansu Province have heat-clearing and damp-drying effects.

Scutellariae Radix; tetraploid; diploid; heat-clearing and damp-drying effects; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.018

R285.5

A

1005-5304(2016)12-0073-05

甘肅省高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目（BH2012-020）；甘肅省中藥材產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)項目（GYC12-05）

杜弢，E-mail：gslzdt@163.com

（2015-12-01）

（2016-01-05；編輯：華強）