利用DNA條形碼與形態(tài)學相結合快速鑒定哈麥篩下物

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·種子檢驗·

利用DNA條形碼與形態(tài)學相結合快速鑒定哈麥篩下物

尤佳，黃璽，王溪橋，王軍平，文朝慧
(甘肅出入境檢驗檢疫局， 蘭州 730010)

對哈麥篩下物中3種難辨認的雜草種子DNA條形碼基因atp-F/atp-H和psbK/psbI進行PCR擴增并對PCR擴增產(chǎn)物測序，以近緣種植物為外類群建立系統(tǒng)進化樹構建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定到屬，輔以形態(tài)學方法最終鑒定為反枝莧(Amaranthusretroflexus)、千穗谷(Amaranthushypochondriacus)、歐洲油菜(Brassicanapus)。DNA條形碼與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定相結合，彌補了單一鑒定方法的局限性，提高了檢測的準確性與時效性。

哈薩克斯坦小麥； 雜草； DNA條形碼

近年來，隨著國際貿(mào)易往來增長，進境種子糧谷攜帶入侵我國的雜草呈現(xiàn)數(shù)量增多、頻率加強、蔓延范圍擴大的趨勢。2016年一季度質(zhì)檢總局植物疫情截獲通報顯示，雜草截獲種次占比均為第一，共截獲有害生物93 781種次，其中檢疫性有害生物達12 772種次。雜草不僅直接危害農(nóng)田、果、桑、林園各種作物，造成減產(chǎn)，使品質(zhì)變劣，而且傳播病蟲害，誘發(fā)作物致病[1]。

目前，在出入境檢驗檢疫工作中，雜草鑒定以傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定為主。然而，形態(tài)鑒定具有一定的局限性，進境雜草主要以果實或種子形態(tài)出現(xiàn)，通常不具備完整的分類鑒定信息，難以準確鑒定；雜草果實或種子通常隨進境糧谷、羊毛或運輸工具等途徑進入，在此過程中經(jīng)常發(fā)生磨損，導致果實或種子形態(tài)特征不完整，進一步加大了鑒定難度；另外，形態(tài)學鑒定需要專業(yè)人員有豐富的經(jīng)驗，甘肅局雜草分類鑒定研究基礎較為薄弱，缺乏相關方面的專家，在一定程度上影響了口岸檢驗檢疫的效率和質(zhì)量。隨著經(jīng)濟一體化趨勢以及絲綢經(jīng)濟帶甘肅黃金段的建設，會有越來越多的境外植物產(chǎn)品進入甘肅，外來入侵雜草的輸入更加直接和頻繁，如要在確保檢驗檢疫質(zhì)量的同時，又能縮短檢驗檢疫周期，加快通關速度，促進外貿(mào)健康發(fā)展，就必須利用先進的分子生物學技術提高檢驗檢疫效率。DNA條形碼技術是利用一段或幾段標準的、易擴增的、種間差異顯著大于種內(nèi)差異的 DNA片段來鑒別物種的新技術[2]。該技術有助于發(fā)現(xiàn)新物種，并為解決近似種和隱存種等傳統(tǒng)分類鑒定難題提供新的研究方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

哈薩克斯坦小麥篩下物(未知物種雜草)。

1.2 試 劑

植物DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程技術服務有限公司；引物由華大基因公司合成，用無菌去離子水溶解至終濃度為10μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方 法

1.3.1 PCR擴增測序

本實驗選用2對DNA條形碼atp-F(5’-ACTCGCAC ACACTCCCTTTCC-3’)和atp-H(5’-GCTTTTATGGAAGCT TTAACAAT-3’)，psbK(5’-TTAGCCTTTGTTTGGCAAG-3’)和psbI(5’-AGAGTTTGAGAGTAAGCAT-3’)進行PCR擴增，反應程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖進行PCR產(chǎn)物凝膠電泳，用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，送測序。

1.3.2 外類群選擇

選擇NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)親緣關系較近的屬做外類群，序列調(diào)自Genbank。

圖1 基于atpf-atph序列構建未知物種及近緣物種部分序列的鄰位相連法分子系統(tǒng)樹NJ

圖2 基于atpf-atph序列的未知物種X 1、X 2及近緣物種部分序列的遺傳距離

圖3 基于atpf-atph序列構建未知物種及近緣物種部分序列的鄰位相連法分子系統(tǒng)樹NJ

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

采用BioEdit軟件進行校對和排序，然后用MEGA6.0、Clustal X軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining算法中的Kimura 2-Parameter模型構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展分析1 000次。

1.3.4 形態(tài)鑒定

形態(tài)學輔助鑒定確定物種。

2 結果與分析

2.1 外類群物種

根據(jù)測序公司反饋結果，結合序列圖譜，選擇序列質(zhì)量得分和有效讀長最高的測序結果進行NCBI blast，得到系統(tǒng)進化樹外類群，序列號見表1。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹與遺傳距離

通過圖1系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，X1、X2與莧屬植物(Amaranthus)聚類在一起，結合遺傳距離圖2，X1與反枝莧(Amaranthusretroflexus)遺傳距離最小(0.005 3)，刺莧(Amaranthusspinosus)其次(0.007 1)；X2與X1遺傳距離最近(0.007 1)，反枝莧(Amaranthusretroflexus)次之(0.036 2)。

通過圖3系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，X3與蕓薹屬(Brassica)聚類在一起，結合遺傳距離圖4，X3與歐洲油菜(Brassicanapus)、蕪菁(Brassicarapa)、芥菜(Brassicajuncea)遺傳距離最小(0.003 1)，與甘藍(Brassicaoleracea)較近(0.003 5)，需要形態(tài)學輔助鑒定。

2.3 形態(tài)學鑒定比對

解剖鏡下進行進一步比對(圖5)。X1種子近圓形；直徑1 mm，厚0.5 mm；黑色，兩面凸，呈凸透鏡狀，表面光滑有強光澤；周邊較薄，有細顆粒狀環(huán)帶，因此確認為反枝莧(Amaranthusretroflexus)。X2種子近圓形；直徑1.3 mm，厚0.7 mm；紅褐色，兩面凸，呈凸透鏡狀，表面光滑有強光澤，具環(huán)狀邊；種臍黑色，明顯突出，鑒定為千穗谷(Amaranthushypochondriacus)。X 3種子球形，徑長2 mm；種皮深褐色，表面具不規(guī)則網(wǎng)紋，網(wǎng)眼淺而小，不甚明顯；種臍小，凸起，表面覆蓋白色遺留物，鑒定為歐洲油菜(Brassicanapus)。

表1 系統(tǒng)進化樹外類群

序號種名編號1Amaranthusspinosus刺莧GQ247902．12Amaranthusretroflexus反枝莧HQ594560．13Betavulgaris甜菜KR230391．14Salicornia(brachiate)海蓬子KJ629115．15Haloxylonammodendron梭梭KF534478．16Haloxylonpersicum白梭梭KF534479．17Chenopodium(simplex)藜HQ594634．18Amaranthushybridus綠穗莧GQ247901．19Brassicanapus歐洲油菜KM454973．110Brassicarapa蕪菁DQ231548．111Brassicajuncea芥菜KT581449．112Brassicaoleraceavar．甘藍KR233156．113Raphanussativus蘿卜KJ716483．114Sinapisarvensis白芥HQ594867．115Raphanusraphanistrum野蘿卜GQ248045．116VellapseudocytisusGQ248064．117Eutremahalophilum山崳菜KT962846．1

圖4 基于atpf-atph序列的未知物種X 3及近緣物種部分序列的遺傳距離

圖5 未知物種形態(tài)照片

3 討 論

與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定物種相比，DNA條形碼有顯著的優(yōu)勢：1) 操作簡單，只要會分子生物學操作的人員就可以對未知物種有個大方向的判斷，基本可以鑒定到屬。2) 大大縮短鑒定周期，一定程度上提高了口岸檢驗檢疫的效率與準確性。3) 不受未知物種生長發(fā)育階段和形態(tài)特征的限制。但是，遺傳距離相近物種僅通過DNA條形碼技術是不能準確鑒定的，主要原因：1) 植物非常容易發(fā)生自交、雜交或網(wǎng)狀式進化，同一基因在不同植物類群中進化速率不一致，導致植物DNA條形碼要比動物DNA條形碼研究復雜得多，因此對于植物DNA條形碼來講，該技術還只是一個驗證過程，并未完全成熟[3]。2) 常用的植物DNA條形碼片段或多或少都存在一定局限性。條形碼擴增片段通常較短，就極容易出現(xiàn)重復序列/poly結構，重復序列導致PCR測序反應酶產(chǎn)生滑動，產(chǎn)生非特異性信號。例如該實驗所用的葉綠體psbK-psbI序列，在很多論文中都證明可以作為鑒定物種的DNA條形碼[4-6]，但是在本實驗擴增莧屬和蕓薹屬植物種子DNA時，該條形碼擴增片段存在poly-A，序列質(zhì)量得分很低。其它常用條形碼，例如trnH-psbA在很多屬植物中擴增成功率和物種識別率方面表現(xiàn)很好[7-8]，但不足的是，該片段存在插入/缺失現(xiàn)象，致使不同植物間該片段長度變異較大，導致非同屬物種間的比對較為困難[3]。因此從實用性和準確率等角度考慮，以2～3個條形碼組合為宜。3) 受限于Genebank數(shù)據(jù)庫，因此必須與傳統(tǒng)分類鑒定相結合才能下結論。

單一通過分子生物學手段鑒定物種，是很難鑒定到種及種下分類階元的，而且一定程度上也取決于序列的選取。實驗通過多條基因序列特征比較，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用軟件得出與近緣種的遺傳距離，快速將未知物種鎖定在屬的范圍，再通過形態(tài)分類鑒定佐以補充，確定到種的水平。2種方法相結合一定程度上彌補了甘肅口岸植物分類鑒定經(jīng)驗的不足，同時提高了口岸截獲外來物種的鑒定準確性與時效性。

[1]李慧.常見雜草識別與防除原色圖譜[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009.

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(本欄目責任編輯：申 曉)

The Rapid Identification of Unknown Weed Seeds in Kazakhstan Wheats with DNA Barcoding and Traditional Morphological Identification

YOUJia,HUANGXi,WANGXiqiao,WANGJunping,WENChaohui

2016-07-07

甘肅出入境檢驗檢疫局2015年度科技計劃項目。

尤 佳(1988—)，女，甘肅蘭州人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事出入境植物檢疫相關工作；E-mail:abbyyj@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.121

S 512.1

A

1001-4705(2016)11-0121-03