36份小麥種質資源抗麥長管蚜遺傳多樣性的鑒定與分析

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36份小麥種質資源抗麥長管蚜遺傳多樣性的鑒定與分析

孔欣欣，王春平，王黎明，董普輝，龐玉輝，張鵬飛
(河南科技大學農學院， 河南 洛陽 471003)

為篩選抗麥長管蚜優(yōu)異的小麥種質資源，以36份不同抗蚜水平的小麥種質資源為材料，調查記錄不同時期供試材料的蚜蟲數(shù)量，并利用3對位于7 D染色體的特異性簡單重復序列(Simple Sequence Repeats，SSR)標記檢測材料，采用蚜量比值、Shannon’s 信息指數(shù)及聚類分析的方法進行分析，在分子水平上探討小麥抗麥長管蚜種質資源的遺傳多樣性。分子檢測結果表明，引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121擴增條帶數(shù)平均為6.7條，其中多態(tài)性條帶數(shù)分別為5條、5條和2條；平均位點的有效等位基因數(shù)范圍為0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指數(shù)范圍0.000 0～1.329 7。聚類分析結果表明，36份小麥種質資源按照閾值λ=2.06可分為4大類群，其中發(fā)現(xiàn)抗性品種矮抗58與其它品種具有較遠的親緣關系，可作為最新的抗蚜材料。

小麥； 種質資源； 麥長管蚜； 遺傳多樣性； SSR分析

小麥是世界上重要的糧食作物之一，麥長管蚜是危害小麥的主要害蟲，且是各麥區(qū)小麥穗期(受害最敏感期)的優(yōu)勢麥蚜種群[1]。小麥每年產量因病蟲為害損失20%左右，其中麥蚜損害為10%～15%[2]。目前，化學抗蟲是最常用的防治麥蚜方法，大面積的使用化學農藥會殺害蚜蟲的早期天敵[3]。因此，培育、篩選和利用抗蚜品種是防治麥蚜最經濟有效的措施，同時也最有利于天敵和環(huán)境的保護[4-5]。

近年來，國內外許多學者對小麥種質資源及其抗蚜性的遺傳差異和進化做了相關研究。Peng等[6]用51對SSR引物對71份小麥品種進行遺傳多樣性分析，得出SSR標記的平均等位變異位點為6.7個。倪中福等[7]用23個SSR引物對不同生態(tài)區(qū)的6個春小麥品種(系)及北方冬麥區(qū)的17個冬小麥品種(系)進行了遺傳多樣性分析，獲得平均變異位點為2.9個。仇松英等[8]利用18對SSR引物對47份麥蚜抗性不同的小麥品種進行了遺傳多樣性分析，平均變異位點有5.2個。王春平等[9]選用32對多態(tài)性穩(wěn)定的SSR標記對14份麥長管蚜抗性不同的小麥品種進行了遺傳多樣性分析，平均等位變異為6.8個。史忠良等[10]利用19對多態(tài)性SSR標記分析47份抗麥紅吸漿蟲品種(系)的遺傳多樣性分析，平均變異位點為5.47個。許蘭杰等[11]利用54對多態(tài)性的SSR引物對43份不同抗蚜水平小麥品種(系)進行遺傳多樣性分析，獲得平均等位變異為6.7個。

前人應用SSR分子標記研究了小麥品種抗蚜性的遺傳多樣性[5,12-14]，但對于小麥種質資源抗麥長管蚜的表型和基因型一致性以及分子標記開發(fā)的相互驗證在國內外尚未見報道。因此，本研究以36份不同抗蚜水平的小麥種質資源為材料，調查記錄不同時期供試材料的蚜蟲數(shù)量，并利用3對位于7 D染色體的特異性簡單重復序列(Simple Sequence Repeats，SSR)標記檢測材料，采用蚜量比值、Shannon’s信息指數(shù)及聚類分析的方法進行分析，在分子水平上探討小麥抗麥長管蚜種質資源的遺傳多樣性，以期明確小麥抗蚜種質資源的遺傳多樣性、親緣關系以及標記的應用功效，為小麥抗蟲育種的應用提供親本材料和分子水平上的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

36份小麥種質資源(見表1)：從本課題組前期研究的小麥種子資源中，選擇性狀穩(wěn)定的88份供試材料進行田間抗蚜鑒定，根據(jù)2年重復資料結果，從中又選擇具有不同抗性且抗性結果較為穩(wěn)定的36份材料作為研究對象。試驗材料由河南科技大學農學院小麥遺傳育種課題組提供，分別于2012—2013年度和2013—2014年度種植在河南科技大學試驗田，完全隨機設計，每份供試材料播種2行，行長為1 m，行距為0.24 m，重復3次，保護行種植千斤早作為對照，常規(guī)大田管理，整個生育期均不噴灑農藥。

表1 36份小麥種質資源抗麥長管蚜鑒定

小麥種質資源蚜情指數(shù)抗性級別小麥種質資源蚜情指數(shù)抗性級別小麥種質資源蚜情指數(shù)抗性級別煙農190．5311MR大唐9910．3885HR千斤早2．1801HS陜糯1號0．3713MR石新7330．6786LR邯61720．7253LR中33990．327MR周麥190．2213HR豫麥491．1286LSAMIGO0．6712LRASTRON0．627LR186TM0．5458MR長武6130．2852HR周麥180．5458MR中8891．2079LS9631．1605LS小偃220．3467MR濟麥170．4327MR植952400．4745MR98?10?350．5655MR遠豐1390．9319LSZB070．4131MR荔高6號0．4844MR04?F6?8160．7794LR豫麥700．772LRPI2626600．895LRPI2949940．5311MRPI高0．627LR小偃2160．3073MR陜5340．8851LR東旱1號0．8286LR周優(yōu)190．7888LR遠豐1752．3186HS矮抗580．1746HR周911770．8433LRZB0111．2638MS

注：HR、MR、LR、LS、MS、HS分別表示對麥長管蚜蟲表現(xiàn)為高抗、中抗、低抗、低感、中感和高感。

1.2 抗蚜性鑒定方法

抗蚜性鑒定方法參考曹如槐[15]的蚜情指數(shù)法，稍有改動：采用田間自然感蚜，在灌漿成熟期按“Z”字型隨機選取10株小麥，調查記錄每株主莖麥長管蚜數(shù)，隔7 d調查1次，共調查5次。參照Painter[16]分級標準，以蚜情指數(shù)作為抗性評價的指標，抗性程度分為7級：免疫、高抗、中抗、低抗、低感、中感、高感，蚜情指數(shù)分別為0.00、0.01～0.30、0.31～0.60、0.61～090、0.91～1.20、1.21～1.50、gt;1.50。

1.3 SSR標記分析

取幼嫩葉片用十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，CTAB)法[17]提取小麥種質資源的DNA。本研究利用前期[9,18]選取的位于小麥A、B和D組同源染色體組上的175對SSR分子標記進行了全基因組的篩選，鑒定出了有多態(tài)性的32對引物，篩選出3對特異性SSR標記。3對SSR標記序列參照Rder等[19]和Somers等[20]研究和相關網站SSR引物的序列信息，由Invitrogen生物工程公司合成。聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)反應體系50μL：10×Buffer(含Mg2+)，2 UTaqDNA聚合酶，200μmol/L dNTPs，引物0.4 mol/L，50 ng模板DNA，體積用超純水補足。選用PTC-200 PCR儀：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)電泳分離PCR產物，銀染顯色后觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計方法

SSR標記檢測結果采用0/1賦值法，在相同的遷移位置上有擴增條帶，有帶記為1，無帶記為0，構建0，1二元數(shù)據(jù)矩陣。利用Excel計算蚜情指數(shù)；利用Popgene 1.32[21]軟件包計算Shannon’s信息指數(shù)和平均位點有效等位基因數(shù)；利用DPS 7.05(Data Processing System)版軟件計算相似系數(shù)遺傳距離進行聚類分析。計算公式如下：

2 結果分析

2.1 36份小麥種質資源抗性鑒定分析

在前期大面積篩選抗蚜種質資源的基礎上，采用自然感蚜的方法，對多年穩(wěn)定的88份供試材料進行抗性鑒定，并從中又選擇具有不同抗性且抗性結果較為穩(wěn)定的36份材料作為研究對象，詳細結果見表1。由表1可知，36份小麥種質資源中，表現(xiàn)高抗(HR)的材料有3份，包括矮抗58、周麥19、長武613；中抗(MR)材料有14份；低抗(LR)材料有12份；低感(LS)材料有3份；高感(HS)材料有2份。

表3 36份小麥種質資源抗麥長管蚜性的遺傳多樣性水平

小麥種質資源AeⅠ小麥種質資源AeⅠ小麥種質資源AeⅠ千斤早0．12800．0838PI2949940．11950．0393遠豐1390．13940．1567陜糯1號0．26670．2310PI2626600．11950．0393中8890．30000．3662中33990．16670．0000豫麥490．48000．3662大唐9910．22500．4945ZB0110．19420．4500石新7330．27550．1797周優(yōu)190．24320．1283小偃220．18620．0393ASTRON0．11950．0393周911770．13040．0838ZB070．13040．0838荔高6號1．08000．6365濟麥170．65750．5973AMIGO0．19100．4107周麥191．08000．636504?F6?8160．27550．1797東旱1號0．27550．1797矮抗581．02801．3297煙農190．49940．5459植952400．14060．1283中186TM0．11950．0393邯61720．31990．7324長武6130．74190．522998?10?350．13040．0838遠豐1750．20000．4500PI高0．13040．0838陜5340．12800．0838周麥181．08000．6365中9630．44710．4107小偃2160．75000．1352豫麥700．60000．5014

注:Ae表示平均每位點有效等位基因數(shù);I表示Shannon’s信息指數(shù)。

注：1～36編號同表;M:DNA標準分子量；R：抗性種質條帶；S：敏感種質條帶。圖1 Xwmc182標記對36份小麥種質資源的SSR檢測結果

2.2 SSR標記的多態(tài)性分析

從本課題前期研究[9]所得出的32對引物中，篩選出了3對位于7D染色體上條帶清晰、重復性較好的特異性引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121，對篩選出的36份具有不同抗性的小麥種質資源進行檢測，詳細結果見表2。由表2可知，Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121標記的擴增條帶數(shù)分別是8條、9條和3條，其中多態(tài)性條帶數(shù)分別為5條、5條和2條，平均每條引物能擴增出條帶數(shù)6.7條，多態(tài)位點百分率為55.7%～66.7%。其中，圖1為Xwmc182標記擴增的SSR產物電泳圖，其帶型分布與小麥種質資源抗性鑒定結果一致。

表2 SSR標記檢測結果的多態(tài)性分析

代號標記擴增條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)(%)多態(tài)位點百分率(%)1Xgwm448562．52Xwmc1829555．73Xwmc1213266．7

2.3 36份小麥種質資源抗蚜性的遺傳多樣性分析

采用0/1賦值法對SSR標記檢測結果構建0，1二元數(shù)據(jù)矩陣，利用軟件包計算Shannon’s信息指數(shù)和平均位點有效等位基因數(shù)，詳細結果見表3。由表3可知，36份不同抗性水平的小麥種質資源中，平均位點的有效等位基因數(shù)的范圍為0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指數(shù)的范圍為0.000 0～1.329 7。說明36份小麥種質資源抗麥長管蚜的遺傳多樣性相對豐富。其中，矮抗58的遺傳多樣性最高，Ae值和I值分別為1.028 0、1.329 7；周麥19、荔高6號、周麥18次之，Ae值和Ⅰ值分別均為1.080 0、0.636 5；中3399最低，Ae值和Ⅰ值分別為0.166 7、0.000 0。36份小麥種質資源的平均位點有效等位基因數(shù)為0.363 9，Shannon’s信息指數(shù)為0.308 5。SSR標記結果反映了36份小麥種質資源抗性遺傳變異的程度，說明36份小麥種質資源抗麥長管蚜的遺傳多樣性很豐富。

2.4 小麥種質資源抗蚜性的聚類分析

根據(jù)SSR標記的數(shù)據(jù)結果，計算出36份小麥種質資源的遺傳相似性系數(shù)矩陣，結合UPGMA法構建種質資源間的聚類分析圖(圖2)。按照閾值為標準，36份小麥種質資源可分為4大類。第1類包括千斤早、石新733、遠豐139、ZB011、899、963、豫麥49、遠豐175；第2類包括陜糯1號、周優(yōu)19、3399、小偃22、ZB 07、PI高、98-10-35、周91177、PI 294994、186 TM、PI 262660、ASTRON、東旱1號、04-F 6-816、植95240、陜534、AMIGO、大唐991、邯6172、濟麥17、煙農19、豫麥70；第3類包括小偃216、長武613、周麥18、荔高6號、周麥19；第4類包括矮抗58。其中，第1類為敏感型的種質資源，第2類包含低抗、中抗型的種質資源，第3類包含中抗、高抗型的種質資源，第4類為高抗型的種質資源。

圖2 36份小麥種質資源的聚類分析圖

3 討 論

分析小麥種質資源抗蚜遺傳多樣性是保護、開發(fā)和利用種質資源的前提。目前，SSR分子標記是遺傳多樣性研究較為有效的方法。本研究是在本課題組[9]前期研究基礎上，篩選出的3對位于7 D染色體上條帶清晰、重復性好的特異性引物，對36份具有代表性的小麥種質資源進行遺傳多樣性分析，結果表明，平均每條引物能擴增出條帶數(shù)為6.7條。研究結果與Peng等[6]抗俄羅斯雙尾蚜小麥種質資源微衛(wèi)星標記分析、許蘭杰等[11]不同抗蚜水平小麥品種(系)SSR分析6.7條的結果一致，且與本課題組前期[9]小麥品種SSR分析6.8條的結果幾乎一致，驗證了SSR標記的重復可用性，為以后本課題開發(fā)利用抗蚜功能標記奠定了基礎。

對品種進行聚類分析，是研究品種間遺傳差異和雜交育種親本選配的重要參考依據(jù)。從當前抗蚜育種的形勢來看，了解抗蚜品種間的遺傳差異對于抗蚜品種的選育具有重要意義。本研究以相對距離為2.06時將36個具有不同抗性的材料聚為4大類群。聚類結果與Peng等[8]、王春平[9]、許蘭杰等[11]的結果不一致，這與研究材料的不同、所用檢測標記的類型及抗蚜機制的不一致有關；試驗材料為36份具有不同抗性的小麥種質資源，聚類結果為4大類是可行的，這些材料的表型和基因型結果基本一致，其中表型為低抗型的石新733被聚類到敏感型的種質資源中，匹配率為97.2%，分析結果可靠，可作為分子標記輔助育種中抗蟲育種的親本材料。

4 結 論

本研究利用3對SSR標記對36份小麥種質資源進行檢測，采用蚜量比值、Shannon’s信息指數(shù)及聚類分析的方法進行分析，得出的主要結論如下：

1) 36份小麥種質資源中，表現(xiàn)高抗(HR)的材料有3份，包括矮抗58、周麥19、長武613；中抗(MR)材料有14份；低抗(LR)材料有12份；低感(LS)材料有3份；高感(HS)材料有2份。

2) 引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121擴增的條帶數(shù)分別是8條、9條和3條，其中多態(tài)性條帶數(shù)分別為5條、5條和2條，平均每條引物能擴增出條帶數(shù)6.7條，多態(tài)位點百分率為55.7%～66.7%。

3) 36份小麥種質資源抗麥長管蚜的遺傳多樣性相對豐富，平均位點的有效等位基因數(shù)的范圍為0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指數(shù)的范圍為0.000 0～1.329 7。

4) 36份小麥種質資源可分為4大類。其中，第1類占8份，屬于敏感型的種質資源；第2類占22份，屬于抗型的種質資源；第3類占5份，屬于中高抗型的種質資源；第4類僅一份(矮抗58)，屬于高抗型的種質資源。

[1]李賢慶,郭線茹,李克斌,等.不同小麥品種(系)對麥長管蚜的抗性[J].昆蟲學報,2006,49(6):963-968.

[2]白莉,鄭王義,任東植,等.麥長管蚜為害損失估計及防治閾值研究[J].山西農業(yè)科學,2006,34(1):61-64.

[3]張乃芹,侯傳本,于凌春,等.麥田主要天敵昆蟲種群動態(tài)及對麥蚜控制效應的研究[J].山東農業(yè)科學,2007(5):86-88.

[4]李鳳珍,吉萬全,吳金華.小麥抗蚜研究新進展[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2004,32(1):73-77.

[5]段燦星,王曉鳴,朱振東,等.我國小麥抗麥長管蚜(Sitobionavenae)研究概況[J].植物遺傳資源學報,2003,4(2):175-178.

[6]Peng J H,Bai Y,Haley S D,et al.Microsatellite-based Molecular Diversity of Bread Wheat Germplasm and Association Mapping of Wheat Resistance to the Russion Wheat Aphid[J].Genetica,2009,135(9):99-122.

[7]倪中福,張義榮,梁榮奇,等.普通小麥D染色體組微衛(wèi)星分子標記遺傳差異研究[J].作物學報,2003,29(1):145-151.

[8]仇松英,張松令,史忠良,等.小麥抗蚜品種的遺傳多樣性SSR標記分析[J].農學學報,2011,1(2):5-10.

[9]王春平,羅 坤,趙惠燕,等.14份小麥種質資源抗麥長管蚜遺傳多樣性的SSR分析[J].核農學報,2011,25(4):639-644.

[10]史忠良,仇松英,張松令,等.小麥抗麥紅吸漿蟲品種的遺傳多樣性分析[J].農學學報,2011,1(1):10-16.

[11]許蘭杰,侯起嶺,侯春雨,等.不同抗蚜性小麥品種(系)的遺傳多樣性SSR標記分析[J].華北農學報,2014,29(5):119-124.

[12]段燦星,王曉鳴,朱振東.小麥種質對麥長管蚜的抗性鑒定與評價[J].植物遺傳資源學報,2006,7(3):297-300.

[13]Arzani A,Peng J,Lapitan N.DNA and Morphological Markers for a Russian Wheat Aphid Resistance Gene[J].Euphytica,2004,139(2):167-172.

[14]Han Y,Wang Y,Bi J,Yang X.Constitutive and Induced Activities of Defense-related Enzymes in Aphid-resistant and Aphid-susceptible Cultivars of Wheat[J].Journal of chemical ecology,2009,35(2):176-182.

[15]曹如槐.農作物抗病蟲性鑒定方法[M].北京:農業(yè)出版社,1992.

[16]Painter R H.Resistance of Plants to Insects[J].Ann Rev Entomol,1958,3:267-290.

[17]Sharppj,Kreis M,Sheway P R,et al.Location of β-amylase Sequence in Wheat and Its Relatives[J].Theor Appl Genet,1988,75:286-290.

[18]Chun-ping Wang,Zheng-hong Wang,Hui-yan Zhao,et al.Expression of Resistance Genes to the Grain Aphid,Sitobionavenaein Wheat,Triticumaestivum.Journal of insect science.2013,13:90-100.

[19]Marion S Roder,Victor Korzum, katia wendehake,et al.Ganal.Amicrosa Tellite Map of Wheat[J].Genetic s,1998,149(4):2 007-2 023.

[20]Somers D,Isaac P,Edwards K.A high-density Microsatellite Consensus Map for Bread Wheat (TriticumaestivumL.)[J].Theoretical and Applied Genetics,2004,109(6):1 105-1 114.

[21]Yeh F,Rong Cai Y,Boyle T.Popgene Version 1.31 Microsoft Window Based Freeware for Population Genetic Analysis.Quick user guide university of alberta[M].Center for International Forestry Research,1998.

Identification and Analysis of Genetic Diversity of Resistant to Sitobion Avenae of 36 Wheat Germplasm

KONGXinxin,WANGChunping,WANGLiming,DONGPuhui,PANGYuhui,ZHANGPengfei

2016-06-19

人才基金(編號：09001595);國家自然基金(編號：U 1304320和U 1304318)。

孔欣欣(1991—)，女，碩士研究生，主要從事小麥遺傳育種；E-mail：434379563@qq.com。

王春平(1969—)，女，碩士生導師，主要從事小麥遺傳育種和種子工程的研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.062

S 512.1

A

1001-4705(2016)11-0062-05