利用野生甘藍抗性遺傳資源獲得高抗菌核病甘藍型油菜的抗性與分子標(biāo)記初步分析

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利用野生甘藍抗性遺傳資源獲得高抗菌核病甘藍型油菜的抗性與分子標(biāo)記初步分析

王浩杰，牛顯飛，宋驗紅，王茂林
(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610064)

菌核病是甘藍型油菜最嚴(yán)重的病害之一，自身抗性低，而甘藍野生資源中存在高抗遺傳資源。以部分抗性的甘藍型油菜中雙9號和高抗性的甘藍野生資源為親本雜交得到F1(ACC)，F(xiàn)1連續(xù)用中雙9號回交6代，得到育性基本恢復(fù)正常植株自交，培育成了高抗菌核病材料，命名為F 6。染色體計數(shù)顯示，F(xiàn) 6有38條染色體，和甘藍型油菜(AACC，2 n=38)一致。菌核病抗性鑒定實驗結(jié)果說明F 6對菌核病的抗性高于中雙9號而弱于甘藍。通過在親本和子代間比較229個分布于甘藍型油菜19個遺傳連鎖群的SSR分子標(biāo)記以及16個與甘藍抗菌核病特異性位點有關(guān)的SSR分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)甘藍抗菌核病主要特異性區(qū)段9號連鎖群已滲入甘藍型油菜基因組中。

甘藍； 甘藍型油菜； 菌核病； SSR標(biāo)記

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)(AACC，2 n=38)是由蕓薹(BrassicarapaL.)(AA，2 n=20)與甘藍(Brassicaoleracea)(CC，2 n=18)通過自然種間雜交后雙二倍化進化而來的一個復(fù)合種，是僅次于大豆的世界第二油料作物[1]。核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)是一種非宿主特異性的寄生真菌，可以感染400多種植物并且造成感染部位的腐爛，其中宿主包括一些重要的農(nóng)作物，例如油菜、大豆等[2]。菌核病可造成巨大的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失[3]，甘藍型油菜一直以來受到核盤菌的嚴(yán)重危害，在中國每年核盤菌導(dǎo)致油菜減產(chǎn)達10%到80%[4]。因為甘藍型油菜對核盤菌高度敏感，目前只有少數(shù)部分抗性品種，如中雙9號，但是沒有完全抗性或高抗性的品種[5]。盡管目前市場上有幾種殺真菌劑可以用來預(yù)防和治愈菌核病，但這種藥物的有效性高度依賴于使用的時間、植物的生長時期和環(huán)境，并且化學(xué)藥物會造成環(huán)境污染以及高成本[6-7]。因此，培育自身對菌核病具有高抗性的新型甘藍型油菜是一種環(huán)保、高效、低成本的對抗核盤菌為害的方法。

圖1 F 6中期染色體

雖然甘藍型油菜中沒有高抗品種，但油菜的近緣物種甘藍中存在高抗性的資源[4]，可以通過甘藍型油菜與甘藍雜交從而將后者的高抗性基因轉(zhuǎn)移到甘藍型油菜中[8]。本實驗以部分抗性的甘藍型油菜中雙九號和一種高抗性野生甘藍為親本，通過遠緣雜交培育出具有更高抗性的甘藍型油菜育種新資源。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

以具有菌核病部分抗性的甘藍型油菜中雙9號(簡稱ZS 09)為母本和高抗性野生甘藍Olera 2(從瑞典Uppsala 遺傳中心引進，簡稱O)為父本雜交獲得少許子代F1，F(xiàn)1表現(xiàn)雄性不育，再以F1植株為母本用ZS 09為回交父本連續(xù)回交6代，得到1株有花粉的植株，可自交結(jié)實，自交獲得遺傳性狀穩(wěn)定的品系，命名為F 6。2年田間自然觀測及人工接種鑒定均表現(xiàn)為高抗菌核病。

1.1.2 核盤菌

核盤菌購買自北京豫鼎鑫捷科技有限公司，PDA培養(yǎng)基22 ℃接種4～5 d，待培養(yǎng)基表面布滿白色菌絲后，用9 mm打孔器打孔，獲取PDA菌絲塊。

1.2 方 法

1.2.1 提取DNA

提取DNA用的是天根Plant Genomic DNA Kit試劑盒，按照說明書進行操作，提取的DNA保存在4 ℃冰箱。

1.2.2 染色體計數(shù)

參照蘭澤蘧等[9]的方法：發(fā)芽的油菜根部達到15 cm左右后剪下，0.2%秋水仙素處理4 h后用蒸餾水沖洗干凈，卡諾氏固定液4 ℃固定24 h再用蒸餾水沖洗干凈，分別在95%、85%的乙醇中放置30 min，轉(zhuǎn)到70%乙醇4 ℃保存。 將保存的材料洗滌后轉(zhuǎn)入1 mol/L HCl中，60 ℃解離10 min左右，蒸餾水沖洗干凈，用卡寶品紅染液染色10～15 min，壓片后放在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 SSR分析

實驗所用的SSR(simple sequence repeat，微衛(wèi)星DNA)標(biāo)記中有229個是由Piquemal等[10]所開發(fā)，這些引物均勻地分布在甘藍型油菜的19個連鎖群上；另有16個是從Mei et al[11]中篩選的甘藍抗菌核病特異性位點SSR標(biāo)記。實驗步驟參照史慧娟等[12]的方法：PCR加樣體系和反應(yīng)體系不變，擴增產(chǎn)物用10%非變性PAGE凝膠電泳分離，0.2% AgNO3染色，顯色后照相并保存。

1.2.4 葉片菌核病抗性鑒定

實驗參照王漢中等[5]的方法進行設(shè)計，待樣品植株成長到10葉期左右，采摘新鮮葉片放入墊有濕毛巾和濾紙的白瓷盤，每組5片葉，葉柄用濕紗布包裹。核盤菌PDA菌絲塊倒置接種于葉片表面。接種后用透明保鮮膜密封，保持空氣濕度大于80%，于22 ℃下接種4 d后記錄菌斑面積，計算公式為：面積 = (長軸 × 短軸)π/4。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

使用軟件SPSS 21.0和Excel來進行離體葉片菌斑面積數(shù)據(jù)的方差分析(ANOVA)與t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 F 6染色體數(shù)目分析

通過壓片法可以清晰地觀察中期染色體(圖1)。經(jīng)統(tǒng)計，F(xiàn) 6個體擁有38條染色體，與甘藍型油菜(AACC，2 n=38)染色體數(shù)目一致，表明F 6確實是一種甘藍型油菜。

注：從左到右：ZS 09、Olera 2、F 6。圖2 接種核盤菌96 h后的葉片

2.2 離體葉片菌核病抗性鑒定實驗

在ZS 09、O及F 6葉片上接種核盤菌96 h后，三者葉片上呈現(xiàn)不同大小的菌斑(圖2)。菌斑面積大小如表1，結(jié)果顯示ZS 09的菌斑面積最大，F(xiàn) 6次之，甘藍最小，表明甘藍對菌核病的抗性最強，F(xiàn) 6次之，ZS 09抗性最低。該實驗證明了F 6是比ZS 09菌核病抗性更高的油菜資源。

2.3 親本和子代SSR分子標(biāo)記分析

229個位于甘藍型油菜連鎖群上的SSR標(biāo)記在ZS 09、O、F 6基因組中分別有181、148、168個標(biāo)記擴增出條帶(圖3)。其中，F(xiàn) 6擴增出與ZS 09相同條帶的標(biāo)記有67個，與O相同的標(biāo)記38個，與ZS 09、O都不相同的特異性標(biāo)記有52個。與親本Olera 2擴增出相同條帶而ZS 09沒有的38個SSR分子標(biāo)記分布在甘藍型油菜的18個遺傳連鎖群上(N 8號連鎖群無)，其中主要的連鎖群為N 1、N 13、N 14，證明了F 6的確含有甘藍Olera 2部分遺傳物質(zhì)且較為均勻穩(wěn)定地分布在F 6的基因組中。

16個甘藍抗菌核病特異性位點SSR標(biāo)記結(jié)果顯示(圖4)，有10個SSR標(biāo)記在Olera 2和F 6中擴增出來的條帶一致，占62.5%，其中有1個標(biāo)記位于甘藍1號連鎖群，2個位于6號連鎖群，7個位于9號連鎖群。該結(jié)果說明F 6遺傳了約三分之二甘藍抗菌核病特異性位點。

3 討 論

由于起源和馴化的時間短加上育種方法效率不高，導(dǎo)致甘藍型油菜品種少，遺傳學(xué)基礎(chǔ)薄弱。相反，其親本之一的甘藍包含許多遺傳資源，并且擁有許多優(yōu)異的品質(zhì)，例如對核盤菌的高抗性[13]。常用的油菜育種方法有2種：一種是用甘藍型油菜與其親緣物種雜交來培育新品種[14]；另一種則是模仿自然狀態(tài)下甘藍型油菜的產(chǎn)生，即用蕓薹與甘藍雜交，通過胚胎挽救和染色體加倍的方法得到異源四倍體油菜[15]。本實驗以具有部分抗性的甘藍型油菜中雙9號和具有高抗性的甘藍為親本，進行雜交將甘藍中的抗性遺傳物質(zhì)遺傳給子代F1，子代F1與ZS 09連續(xù)回交6代克服了雄性不育得到一株有花粉的植株，并通過自交來穩(wěn)定和累加自身遺傳性狀。F 6的染色體數(shù)目為整倍體并和甘藍型油菜(2 n=38)一致，這是F 6自交可育性的基礎(chǔ)并證明了F 6是一種甘藍型油菜。229個甘藍型油菜遺傳連鎖群SSR分子標(biāo)記實驗中，F(xiàn) 6有52個親本不具有的條帶，可能是因為在育種過程部分染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，甘藍型油菜和甘藍基因組部分同源導(dǎo)致染色體互換。菌核病抗性鑒定實驗證明了F 6的抗性顯著性高于中雙9號，但低于甘藍，這是由于核盤菌抗抗性位點是數(shù)量性狀位點(QTL)，分布在多條染色體上，未能全部遺傳到F 6基因組中，SSR標(biāo)記方法證明F 6只繼承了約2/3的抗性位點，另外本研究中標(biāo)記的這些位點并不能包含甘藍全部的抗性基因，這促使著我們接下來要找出更多的抗性位點，提高這些位點從甘藍轉(zhuǎn)移到甘藍型油菜中的成功率。需要注意的是抗性鑒定實驗是在實驗室操作的，需進行田間抗性鑒定實驗進一步檢驗F 6在自然狀態(tài)下的抗性大小。本次研究目的是培育菌核病高抗性甘藍型油菜，重點是其菌核病抗性，而和田間產(chǎn)量相關(guān)的其他油菜品質(zhì)如油菜籽重量、含油量高低、開花時間、抗(耐)性等等則需要未來進一步探索。

表1 離體葉片接種核盤菌96 h后菌斑面積

樣品名稱 菌斑面積(cm2) ZS09 2．52±0．41 O 1．03±0．20?? F6 1．88±0．22?

注：“**”代表p=0.01水平上對ZS 09的顯著性差異，“*”代表p=0.05水平上對ZS 09的顯著性差異。

注：M為DL 500 DNA Maker；F為F 6；O為Olera 2；RA-E 04、SWUC 731、RA2-F 11、SWUC 679、SWUC 81、SWUC 177、SWUC 205、SWUC 59、SWUC 455、NA 1-C 08、SWUC 227為SSR標(biāo)記名稱。圖4 甘藍抗菌核病特異性位點SSR標(biāo)記部分擴增圖譜

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BreedingSclerotiniasclerotiorumResistantBrassicanapusL.by Using WildBrassicaoleraceawith the Analysis of Resistance and Molecular Marks

WANGHaojie,NIUXianfei,SONGYanhong,WANGMaolin
(College of Life Science,Sichuan University,Chengdu 610064,China)

Sclerotiniastem rot is one of most serious diseases inBrassicanapusL.because of its low resistance,but high resistant varieties are found in wildBrassicaoleracea.Hybridizing partially resistantBrassicanapusL.Zhongshuang No.9 and highly resistantBrassicaoleraceaOlera 2 to obtain F1(ACC).F 6 was generated by continuously backcrossing Zhongshuang No.9 to F16 times followed by selfing.The chromosomal number of F1was 38,it was according withBrassicanapusL.Resistance assessment indicating that the resistance of F1was higher than Zhongshuang No.9 but lower than Olera 2.Lastly,through comparing the amplified maps of 229 pairs of SSR marks distributed on the genetic linkage groups ofBrassicanapusL.as well as 16 pairs of SSR mark represented peculiar resistant loci ofBrassicaoleraceagainstSclerotiniasclerotiorumbetween parents and progeny,we found that the No.9 linkage group of Olera 2 had permeated into the the genome of F 6.

Brassicaoleracea;BrassicanapusL.;SclerotiniaSclerotiorum; SSR maker

2016-05-13

國家科技支撐計劃( 編號: 2013 FBAD 01 B 03)；國家“863” 計劃( 編號:2011 AA 10 A 10401) ；四川省“十二五” 油菜育種攻關(guān)項目( 編號:2011 yz gg 05) 。

王浩杰(1991—)，男，安徽六安人；碩士研究生，研究方向：植物遺傳；E-mail: wanghoajie@sina.cn。

王茂林，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物分子生物學(xué)研究和油菜遺傳育種研究；E-mail: mlwang@scu.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.009

S 565.4

A

1001-4705(2016)11-0009-04