高抗煙草花葉病毒的煙草種質(zhì)資源篩選

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(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國(guó)家煙草基因工程研究中心， 昆明 650021)

·資源與利用·

高抗煙草花葉病毒的煙草種質(zhì)資源篩選

劉勇，許美玲，黃昌軍，李梅云，李永平

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國(guó)家煙草基因工程研究中心， 昆明 650021)

為了解我國(guó)煙草種質(zhì)資源對(duì)煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)的抗性狀況，為煙草抗病育種的親本選擇提供信息，本試驗(yàn)通過(guò)苗期TMV汁液摩擦接種，對(duì)1 191份煙草種質(zhì)資源進(jìn)行了TMV抗性鑒定。篩選出的對(duì)TMV表現(xiàn)為枯斑反應(yīng)的高抗資源有：白肋煙40份、國(guó)內(nèi)烤煙20份、國(guó)外烤煙28份、曬煙1份，合計(jì)89份。接種后21 d表現(xiàn)為花葉的資源有：白肋煙29份、國(guó)內(nèi)烤煙430份、國(guó)外烤煙270份、國(guó)內(nèi)曬煙352份、國(guó)外曬煙(雪茄煙)21份，合計(jì)1 102份?？莅哔Y源的比例白肋煙gt;烤煙gt;曬煙。云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院2006年保存白肋煙、烤煙和曬煙資源合計(jì)1 652份，本試驗(yàn)較系統(tǒng)的鑒定了72%種質(zhì)資源的TMV抗性狀況，可為種質(zhì)資源的育種利用提供參考。

煙草； 種質(zhì)資源； 煙草花葉病毒； 抗性

煙草花葉病毒病(Tobaccomosaicvirus,TMV)是我國(guó)煙草上的重要病害，每年造成的損失位列十大煙草侵染性病害名單前列[1-2]。種植抗病品種是防控TMV最根本和最經(jīng)濟(jì)有效的手段，但我國(guó)主栽品種云煙87、云煙97、K 326、中煙100和紅花大金元等均不抗TMV。我國(guó)選育高抗TMV的系列品種，如：CV 85、CV 87、遼煙8號(hào)、遼煙13號(hào)、遼煙14號(hào)和龍江912等常規(guī)種[3-4]；如：云煙201，云煙202，云煙203和云煙205和遼煙15號(hào)等雜種1代[5-8]，并引進(jìn)了美國(guó)和巴西高抗TMV的雜種1代，如：NC 297、NC 102、PVH 09等[9]。但因?yàn)檫B鎖累贅或品種適用性等原因，這些高抗TMV品種的推廣面積不大。在TMV病害持續(xù)高壓的態(tài)勢(shì)下，選育高抗TMV且無(wú)產(chǎn)量劣勢(shì)和缺點(diǎn)(如：落黃慢和難烘烤)的品種具有重大意義。優(yōu)良抗源是選育高抗且豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的關(guān)鍵之一?？緹熎贩NTMV抗性主要來(lái)源于煙草野生種心葉煙(Nicotianaglutiosa)，其抗性由1個(gè)顯性單基因(N)控制[10]。通過(guò)一系列的常規(guī)雜交和回交轉(zhuǎn)育，N基因的抗性從心葉煙轉(zhuǎn)育至香料煙中，然后轉(zhuǎn)育至白肋煙和烤煙品種中[11-14]。

目前我國(guó)用于選育抗TMV烤煙品種的抗病親本(攜帶N基因)數(shù)量少，主要有9501、8022、Coker 176、Ky 56、Coker 86、CV 58、CV 87、KX 13等[6-8,15]。我國(guó)收集保存了4 000多份煙草種質(zhì)資源，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，對(duì)約1 000份種質(zhì)資源(包含重復(fù)鑒定資源)開(kāi)展過(guò)TMV抗性鑒定，已鑒定出76份高抗TMV的種質(zhì)資源[16-23]，仍有大量資源的TMV抗性不明。已育種利用的TMV抗源數(shù)量少、大量種質(zhì)資源抗性不明成為煙草抗TMV育種的制約因素之一。不同的種質(zhì)資源與N基因連鎖的累贅大小不同。在種質(zhì)資源庫(kù)中篩選新的連鎖累贅相對(duì)較小的高抗資源，可為選育出抗性和農(nóng)藝性狀兼優(yōu)的新品種提供新抗性供體親本。本文通過(guò)苗期摩擦接種，對(duì)云南省保存的1 182份煙草種質(zhì)資源進(jìn)行了TMV苗期接種抗性鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院收集保存的煙草種質(zhì)資源1 191份(見(jiàn)表1)。TMV毒源為T(mén)MV普通株系。

1.2 試驗(yàn)方法

在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和試驗(yàn)基地防蟲(chóng)塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。按常規(guī)方法漂浮育苗，在162孔漂浮盤(pán)中每份定植18株，苗齡60 d左右，采用高壓噴槍摩擦接種TMV。采集經(jīng)免疫檢測(cè)試紙條檢測(cè)為T(mén)MV的新鮮病葉，在無(wú)菌研缽中，用接種緩沖液(0.01 mol/L pH=7.0磷酸鹽緩沖液)研磨，用雙層紗布過(guò)濾，調(diào)整接種液的濃度為1∶1 000 重量體積比，在病毒汁液中加入1%過(guò)孔徑0.075 mm篩孔的化學(xué)純二氧化硅。高壓噴槍噴射壓力為1 kg/cm2，噴槍口距離接種物 20 cm，每株噴射接種時(shí)間約為0.5 s。接種后立即用噴壺噴少量自來(lái)水，提高接種效率。

表1 高抗TMV枯斑資源名錄

類 型 名 稱數(shù)量(份)國(guó)內(nèi)近10年文獻(xiàn)未報(bào)道的枯斑資源(份) 白肋煙B21(不育系)，B21(葉形橢)，B21(皺葉)，B22，B49，B64，Banket?A?1，BG4，BYS，Ergo，K10，K14，KY10，KY12，KY41A，KY14，KY15，KY17，KY171，KY56，Ky8959，Ky8959(BC4)，KY9，Ky907(BC4)，Ky908，MSB21，MSKY10，MSKY14ΧL8，NC3，TN90，TN97，Va1048，WB68，引巴1，Msky17，MSTN90，MBN2，MSBurley21×KY14，NC7，EMH144036 國(guó)內(nèi)烤煙大白筋2518，遼煙9號(hào)，遼煙13號(hào)，遼煙14號(hào)，牡單80?7，牡單81?56，臺(tái)煙5號(hào)，臺(tái)煙6號(hào)，中衛(wèi)一號(hào)，6349，7915，8100，8211，8212，78?3013，8902?42，9501，B09，CV85，CV87207 國(guó)外烤煙RT32，Coker86，巴引一號(hào)，Echague，ETWM10，H423，MRS?3，NC567，NC628，NC86，PVH01，PVH02，PVH05，PVH06，PVH07，PVH08，RGH04，RGH12，SC71，SC72，Vamorr48，Virginia3160，Virginia645，Virginia770，Virginia80，Virginia(1)，WE?12，朝鮮抗赤2811 曬煙Va87811 合計(jì)8955

注：加下畫(huà)線的為國(guó)內(nèi)近10年文獻(xiàn)報(bào)道的高抗TMV資源。

1.3 病情調(diào)查與抗性劃分

接種后第5天、第7天調(diào)查接種葉是否有枯斑；接種后10，14，21 d調(diào)查花葉癥狀發(fā)生情況，以株為單位，計(jì)算枯斑率和花葉發(fā)病率。為分析個(gè)別材料因?yàn)榻臃N效率、死亡等原因造成的數(shù)據(jù)缺失，根據(jù)枯斑率和花葉發(fā)病率劃分抗性，高抗(枯斑)：枯斑率大于90%；感病：花葉發(fā)病率大于90%?？莅呗驶蚧ㄈ~率小于90%的資源，不作抗性劃分，有待于重復(fù)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型資源中抗TMV的枯斑資源

對(duì)1 182份煙草種質(zhì)資源苗期人工接種TMV，篩選出高抗TMV枯斑資源89份，分別為白肋煙40份，國(guó)內(nèi)烤煙20份，國(guó)外烤煙28份，曬煙1份(表1)。與國(guó)內(nèi)近10年文獻(xiàn)報(bào)道相比，新鑒定出高抗TMV枯斑資源55份，分別為白肋煙36份，國(guó)內(nèi)烤煙資源7份，國(guó)外烤煙資源11份，曬煙資源1份(表1)。接種TMV后表現(xiàn)為花葉的資源(感病)共1 102份，分別為白肋煙29份，國(guó)內(nèi)烤煙430份，國(guó)外烤煙270份，國(guó)內(nèi)曬煙352份，國(guó)外曬煙(雪茄煙)21份(未列出數(shù)據(jù))。

2.2 不同類型資源中抗TMV枯斑資源的分布

在鑒定的1182份資源中，根據(jù)地理來(lái)源和工業(yè)使用類型劃分的國(guó)內(nèi)烤煙、國(guó)外烤煙、國(guó)內(nèi)曬煙、國(guó)外曬煙和白肋煙等五大類型中，枯斑資源的比例存在明顯差異?？莅哔Y源的比例白肋煙gt;烤煙gt;曬煙(表2)。根據(jù)2006年統(tǒng)計(jì)[24]云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存白肋煙95份，國(guó)內(nèi)烤煙648份、國(guó)外烤煙483份，國(guó)內(nèi)曬煙395份，國(guó)外曬煙31份，合計(jì)1 652份。本試驗(yàn)鑒定了1 191份，占保存資源的72%。

表2 5種類型資源中抗TMV枯斑資源的比例

資源類型云南院保存資源數(shù)量(個(gè))鑒定資源數(shù)量(個(gè))枯斑資源數(shù)量(個(gè))枯斑資源比例(%)平均枯斑資源比例(%)白肋煙95694057．9757．97國(guó)內(nèi)烤煙648450204．44國(guó)外烤煙483298289．406．42國(guó)內(nèi)曬煙39535200．00國(guó)外曬煙312214．550．27合計(jì)/平均16521191897．47

3 討 論

為減少工作量，本試驗(yàn)將抗性劃分簡(jiǎn)化為高抗(枯斑資源)、感病(接種后21 d表現(xiàn)為花葉)兩大類?！稛煵萜贩N抗病性鑒定》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[25]，根據(jù)苗期人工接種TMV的病情指數(shù)，將鑒定材料的抗性劃分為6個(gè)檔次，其中抗性最高的檔次為高抗或免疫(表現(xiàn)枯斑)，其他5個(gè)檔次為抗病至高感。本試驗(yàn)在漂浮苗盤(pán)中煙苗4～5片葉時(shí)，高壓噴槍接種TMV病葉汁液1 000倍稀釋液后，無(wú)枯斑的資源發(fā)病迅速，生長(zhǎng)緩慢。接種后14 d或21 d調(diào)查時(shí)，煙株總?cè)~片數(shù)較少，幾乎全部葉片表現(xiàn)花葉。因此，根據(jù)病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查，資源間的病級(jí)和病情指數(shù)差異較小。目前國(guó)內(nèi)外煙草抗TMV育種主要利用N基因。本試驗(yàn)簡(jiǎn)化的抗性劃分方法，能高效鑒定出攜帶N基因的枯斑資源。

與國(guó)內(nèi)近10年文獻(xiàn)報(bào)道[16-23]比較，本試驗(yàn)新鑒定出枯斑資源55份，55份枯斑資源中包含少數(shù)被報(bào)道為抗病的資源。有文獻(xiàn)將病情指數(shù)為0的資源劃分為免疫(枯斑)、病情指數(shù)小于10的資源劃分為抗病。少數(shù)被其他文獻(xiàn)鑒定為抗病(病情指數(shù)小于5)的資源，本試驗(yàn)鑒定為高抗TMV的枯斑資源?？赡茉?yàn)椋哼@些文獻(xiàn)在田間或盆栽接種鑒定時(shí)，個(gè)別植株自然感染了其他引起花葉的病毒病，肉眼調(diào)查難以剔除其他病毒的污染。在防蟲(chóng)塑料大棚苗期接種，降低了其他病毒的污染。本試驗(yàn)同時(shí)調(diào)查了同一資源的枯斑率和花葉發(fā)病率，相互驗(yàn)證結(jié)果。對(duì)枯斑率或花葉率小于90%的資源、有枯斑且有花葉病株的個(gè)別資源、非N基因介導(dǎo)的抗TMV資源(如：無(wú)癥狀資源)，未作定性評(píng)價(jià)，需要另行鑒定。如需要精細(xì)區(qū)分接種后21 d表現(xiàn)為花葉資源的抗性差異，則需要移栽后接種鑒定。由于部分文獻(xiàn)僅列出抗病的資源名稱，未列出全部供試的資源名稱。因此，難以準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)新鑒定的資源數(shù)量，保守估算新鑒定的資源數(shù)量不少于500份。云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院2006年保存白肋煙、烤煙和曬煙合計(jì)1 652份(許美玲，2006)，本文較系統(tǒng)地鑒定了1 191份，占保存資源的72%。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，白肋煙、烤煙和曬煙3種類型煙草中枯斑資源的比例白肋煙gt;烤煙gt;曬煙，抗TMV種質(zhì)資源篩選，宜以烤煙和白肋煙為重點(diǎn)?？莅哔Y源的比例與抗TMV育種歷史相吻合。N基因來(lái)源于野生種心葉煙[10]，通過(guò)一系列的常規(guī)雜交和回交轉(zhuǎn)育，N基因的抗性從心葉煙轉(zhuǎn)育至香料煙中，然后轉(zhuǎn)育至白肋煙和烤煙品種中[11-14]。由于產(chǎn)量較低、上部葉落黃較慢等連鎖累贅，NN基因型的品種，推廣種植面積較小。目前主要采用Nn基因型的雜種一代。Nn基因型品種比NN基因型的產(chǎn)量和產(chǎn)值高，接近于nn基因型品種[26]。白肋煙中N導(dǎo)入片段引起的連鎖累贅較小[27]，歷史上選育與推廣的抗TMV白肋煙品種較多，烤煙N導(dǎo)入片段引起的連鎖累贅較大[28]，選育與推廣的抗TMV烤煙品種相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)曬晾煙主要為地方性的農(nóng)家品種，收集保存的資源數(shù)量較多。我國(guó)歷史上很少開(kāi)展系統(tǒng)性的曬煙育種，因此，國(guó)內(nèi)抗TMV曬晾煙數(shù)量稀少。

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Identification of Tobacco Germplasm with Resistance toTobaccomosaicvirus(TMV)

LIUYong，XUMeiling，HUANGChangjun，LIMeiyun，LIYongping

2016-07-17

中國(guó)煙草總公司云南省公司科技項(xiàng)目(編號(hào)：2014 YN 02)；中國(guó)煙草總公司科技項(xiàng)目(編號(hào)：110201401001)。

劉 勇(1970—)，男，湖南益陽(yáng)人；博士，副研究員，主要從事煙草病害防治與抗病育種研究；E-mail:yliu@yntsti.com。

李永平(1966—)，碩士，研究員，主要從事煙草育種研究；E-mail:liyongping@yntsti.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.051

S 432.4+1； S 572

A

1001-4705(2016)12-0051-04