離子束介導小麥變異材料貯藏蛋白及農藝品質性狀分析

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(鄭州大學河南省離子束生物工程重點實驗室， 河南 鄭州 450000)

離子束介導小麥變異材料貯藏蛋白及農藝品質性狀分析

韓利濤，谷運紅，焦湞

(鄭州大學河南省離子束生物工程重點實驗室， 河南 鄭州 450000)

離子束誘導技術是一項非常有效的致使植物突變的技術，為提高小麥的品質性狀，采用離子束介導外源全基因組的方法，轉化選育出一批有價值的小麥變異材料。本研究對這批小麥變異材料的農藝性狀、品質性狀、各貯藏蛋白組分進行分析。發(fā)現(xiàn)變異材料的株高、千粒重、葉面積、濕面筋、SDS沉淀值、蛋白含量與對照相比均有明顯的變化，并達到顯著差異水平，但有一些變異材料存在抗病性不好或蛋白含量高但是品質不好的問題，需進一步的改進。變異材料的各蛋白組分含量與對照相比均有明顯的差異且蛋白含量、濕面筋含量都有明顯增加的趨勢。研究結果表明，離子束介導技術產生豐富的變異，而且變異情況與基因受體密切相關，需要對這批變異材料進行進一步的特定培育，從而選育出種質資源良好、蛋白含量高且質量好的品種。

離子束介導； 農藝品質性狀； 貯藏蛋白

小麥是三大谷物之一,主要的糧食作物[1-2]，在世界各地廣泛種植。小麥生產與經濟發(fā)展、社會穩(wěn)定和國家安全息息相關[3]。我國的小麥產量雖然逐年上升，但是品質質量不容樂觀，其品質特性還有待進一步優(yōu)化[2]。離子束誘變技術是由中科院等離子體所余增亮[4-6]研究員發(fā)現(xiàn)的，是一種非常有效的致使植物突變的手段[7]，擁有較高的突變率和更寬的突變譜[8]，是選育作物新品種的重要途徑[9-11]。采用離子束介導的方法將N+注入受體溫六(溫麥六號)的種子，然后將受體種子浸泡在供體燕麥六倍體小黑麥的全基因組DNA中,經過多年選育，獲得一批非常有價值的變異材料。本試驗以其中的一批特殊的變異材料為研究對象，對其農藝性狀及品質性狀進行調查分析，并對對照、親本、變異材料的蛋白含量進行比對分析，以此來探討離子束介導轉化對變異材料的農藝品質性狀和蛋白影響問題，從而篩選出特定的抗自然災害性好、蛋白含量高的株系，也證明離子束介導轉化技術可以應用在植物遺傳育種上，為遺傳工作者提供新的思路。

圖1 離子束介導小麥變異材料收獲種子對比(從左至右依次為E 101～E 109)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為2004年用離子束介導的方法將N+注入受體溫麥六號(3×1017N+/cm2)，然后將受體種子浸泡在供體燕麥(150μg/mL)、六倍體小黑麥(200μg/mL)的全基因組DNA中，浸泡24 h后將試驗種子播種在試驗田中。按照常規(guī)育種方法，經過多年的選育獲得一批變異材料，為研究方便，選取其中一批材料，如表1，圖1。

1.2 試驗方法

1.2.1 變異材料農藝性狀調查

2014—2015年種植于鄭州大學新鄉(xiāng)小麥試驗田。播種規(guī)格為E 102與E 103兩個親本各種4行，其余材料各種8行，行長2.0 m，行距25.0 cm，株距3.0 cm。調查葉綠素(2015年4月21日，每個材料測5株，每株測3次)、葉面積(2015年4月25日，每個材料測5株，每株測3次)、株高、穗型、穗長、穗數(shù)、千粒重等指標，其中葉綠素含量指標采用SPAD值計算，采用的儀器為日本產SPAD-502 pIus型便攜式葉綠素儀，SPAD值可以預測籽粒成熟期蛋白質含量[9]。

1.2.2 變異材料品質性狀調查

蛋白含量(干基)、水分、容重、吸水率利用FOSS 公司的NIRS 5000 近紅外品質分析儀和WINISI軟件進行光譜的采集和測定。SDS沉淀值和濕面筋含量及濕面筋指數(shù)在周口市農科院測量。

1.2.3 變異材料貯藏蛋白含量測定

變異材料貯藏蛋白的提取分離參照Herbert Wieser[13]，Verbruggen I M[14]楊學舉[15]等的方法并有所改進，采用考馬斯亮藍G-250法按照清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白的順序[16]測定各蛋白組分的含量，并對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

表1 離子束介導小麥變異材料

編號組合E101(受體)溫六E102(供體)燕麥E103(供體)六倍體小黑麥E104溫六/燕麥E105溫六/燕麥E106溫六/燕麥E107溫六/六倍體小黑麥E108溫六/燕麥E109溫六/燕麥

取0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 mL標準牛血清溶液分別加入試管中，各加重蒸水1 mL和考馬斯亮藍G-250試劑5 mL，蓋上塞子搖勻，放置3 min，于595 nm波長下測量吸光度，并繪制標準曲線(圖2)。

圖3 對照與部分變異材料穗型對比(從左至右依次為E 101～E 109)

表2 離子束介導小麥變異材料的農藝性狀差異性分析(Mean±SD)

編號株高(cm)穗長(cm)芒長(cm)千粒重(g)葉綠素含量(%)E10170．33±1．128．87±0．476．67±0．8148．13±0．1355．30±1．04E102159．00±3．1312．10±0．264．83±1．1427．71±0．0344．80±0．98E103111．33±1．1513．47±0．909．43±0．4732．13±0．1763．37±0．47E10499．33±2．89??11．63±0．87?5．10±0．2654．25±2．84??53．60±2．36E10550．33±1．15??9．53±0．255．00±0．3544．02±1．7166．40±0．50??E10688．00±1．52??11．40±0．46?4．47±0．5544．57±0．81?56．50±0．75E10765．33±1．009．40±0．877．33±0．3152．66±0．11??57．10±0．66?E10868．67±1．7313．43±1．08??6．57±1．2347．7±2．6562．60±1．66??E10961．00±2．31?7．33±0．964．83±0．38??50．25±0．96?56．53±2．00

注：“*”和“**”分別表示0.05和0.01顯著水平。下同。

圖2 考馬斯亮藍G-250法測定貯藏蛋白含量標準曲線

2 結果與分析

2.1 變異材料主要農藝性狀分析

對種植于鄭州大學新鄉(xiāng)小麥試驗田的變異材料進行農藝及品質性狀測量分析，發(fā)現(xiàn)部分變異材料的葉面積與穗型與對照相比發(fā)生了明顯變化(圖3、圖4)。隨機選取變異材料株系5株，測量葉綠素、葉面積、株高、穗長等性狀，每株測3次，記錄數(shù)據(jù)(表2)。

用SPSS軟件對變異材料的株高、穗長、千粒重等指標進行比對分析，發(fā)現(xiàn)這一批變異材料與對照相比發(fā)生了顯著的變化。E 105和E 108的SPAD值與對照相比極顯著增加。在株高方面，變異材料E 104、E 106與對照相比極顯著增加，其中E 104高達99.33 cm，而E 105極顯著降低，只有50.33 cm， E 109與對照相比顯著降低；在穗長方面，材料E 104、E 106、E 108與對照相比均有一個極顯著增加的水平，分別增長了31.12%、28.52%和51.41%，有一個增加的趨勢；材料E 104、E 105、E 106和E 109在芒長方面與對照相比極顯著降低；材料E 109在千粒重方面與對照相比顯著增加，材料E 104和E 107極顯著增加，分別達到54.25 g和52.66 g。

由表3可知，對照組E 101的穗數(shù)均值為12.50，材料E 109有一個最大的穗數(shù)值，高達22.00，最小值為18，比對照組的最大值大。所以變異材料E 109在穗數(shù)方面較對照組有一定的優(yōu)勢，可用于下一步的遺傳改進。

表3 離子束介導小麥變異材料的穗數(shù)分析

編號最大值最小值極值均值標準差變異系數(shù)(%)E101158712．502．4317．74E1022418621．332．4210．36E1032317619．832．5611．79E1042011915．333．1418．70E1052112915．143．4419．47E10620101014．432．4819．20E107149510．860．8213．42E108159610．571．3320．13E1092518722．002．5310．50

圖4 對照與部分變異材料葉面積對比(從左至右依次為E 101、E 103、E 109)

2.2 變異材料主要品質性狀分析

變異材料的主要品質性狀見表4。由表4可知，材料的干基蛋白質含量最小值和最大值分別為13.8%和19.0%，變異材料E 109的蛋白質含量達到最大，與對照相比極顯著增加，除材料E 106外，其余變異材料與對照相比均有明顯的增加。

在吸水率方面，所有變異材料與對照相比均有增加。在濕面筋方面，所有的變異材料均高于對照，其中材料E 109高達40.4%，明顯高于對照，達到極顯著水平。說明變異材料在蛋白含量、濕面筋含量、吸水率方面均有明顯的增加趨勢。

以新麥26和鄭麥366為參考，測得所有樣品的SDS沉淀值(表5)。表5中d值為10 min和5 min讀數(shù)的差值，其中d值越小，說明該樣品蛋白質量、結構越好，穩(wěn)定時間越長。當dlt;0.5時，蛋白質量最好，d值在0.5～0.8之間的次之，dgt;0.8的為最差。由此可知，變異材料E 104、E 105和E 106的蛋白質量最好，材料E 109的蛋白質量較差。

表4 離子束介導小麥變異材料主要品質性狀

樣品編號蛋白含量(%)吸水率(%)濕面筋(%)E10113．854．226．4E10214．761．229．7E10315．061．333．0E10414．961．731．7E10514．862．6??31．2E10613．660．027．9E10715．659．332．0?E10814．858．230．1E10919．0??59．040．4??

表5 離子束介導小麥變異材料SDS沉淀值

樣品編號 5min10min差值d E10197．91．1 E10296．22．8 E1035．85．30．5 E1046．86．20．6 E10576．50．5 E1066．76．20．5 E1078．98．10．8 E1086．35．50．8 E1097．56．41．1 鄭麥366(ck)8．47．11．3 新麥26(ck)7．47．10．3

2.3 變異材料貯藏蛋白分析

變異材料貯藏蛋白含量見表6。由表6可知，變異材料E 106和E 107的清蛋白與對照相比明顯增多(圖5 a)，達到極顯著水平，E 108和E 109顯著增加；在球蛋白和醇溶蛋白方面，變異材料的蛋白含量均比對照多(圖5 b，c)，所以其面筋的延展性比對照好；在麥谷蛋白方面，受體E 103蛋白含量最低(圖4 d)，為23.23μg，變異材料E 105、E 106、E 107和E 109的蛋白含量與對照相比極顯著增加，其中，E 105的蛋白含量最高(圖5 d)，達到3.274 1μg/mL。小麥籽粒麥谷蛋白組分越高，小麥的面筋彈性越好，所以變異材料E 105的面筋彈性最好。

表6 離子束介導小麥變異材料貯藏蛋白含量(μg)

樣品編號清蛋白球蛋白醇溶蛋白麥谷蛋白E101195．28127．86186．11230．87E102298．83161．30131．64138．11E103220．09218．47219．55023．23E104194．74238．96??212．54288．58E105279．41?234．65??284．80??327．41??E106327．41??213．07??207．68310．15??E107322．02??202．29??235．19?307．46??E108275．10?234．65??206．60268．62E109268．09?229．25??208．22309．61??

3 總 結

圖5 離子束介導小麥變異材料貯藏蛋白含量分析

通過對離子束介導小麥變異材料的農藝性狀和品質性狀的調查分析，發(fā)現(xiàn)變異材料的農藝性狀和品質性狀與對照相比存在非常明顯的差異變化。在變異材料中E 109株系最高，株高達99.33 cm，E 105最低，僅為50.33 cm。材料E 104、E 106、E 108在穗長方面與對照相比均有一個極顯著增加的水平，分別增長了31.12%、28.52%和51.41%。在芒長方面，材料E 104、E 105、E 106和E 109與對照相比極顯著降低，其中材料E 109最短，僅為4.83 cm。材料E 109在千粒重方面與對照相比顯著增加，材料E 104和E 107極顯著增加。

在品質性狀方面，變異材料與對照相比也具有明顯的區(qū)別，其中材料E 109的蛋白質含量最大，達到19.0%，與對照相比極顯著增加，所有變異材料的濕面筋含量均高于對照。由表5可以看出，變異材料E 104、E 105和E 106的蛋白質量最好，材料E 109的蛋白質量較差。

通過變異材料農藝性狀和品質性狀及蛋白分析，發(fā)現(xiàn)離子束介導小麥之后的變異材料均發(fā)生顯著的變化，在培育的過程中發(fā)現(xiàn)變異材料E 109的穗偏短，抗病性和抗蟲性很弱，但是其穗數(shù)多且蛋白含量高;E 108的穗較其它材料來說要大很多， 且E 105的抗銹病能力弱，但是其蛋白品質好。下一步需要對這批變異材料作進一步的特定培育，從而選育出種質資源良好、蛋白含量高且質量好的品種。

[1]劉雅輝,閆紅飛,楊文香,等.23個小麥抗葉銹病近等基因系SRAP多態(tài)性[J].中國農業(yè)科學,2008,41(5):1 333-1 340.

[2]鄭青煥,李曉萍,郭超,等.21份印度小麥高分子谷蛋白亞基、醇溶蛋白及品質分析[J].麥類作物學報,2015,35(12):1 009-1 041.

[3]蘇張磊,戚艷磊,谷運紅,等.離子束介導外源DNA導入小麥后代變異系有關分析[J].核技術,2009,32(10):779-782.

[4]Yu Z L,Deng J,He J.Mutation breeding by ion implantation[J].Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B:Beam Interactions with Materials and Atoms 1991,59:705-708.

[5]Yu Zengliang.Ion Beam Application in Genetic Modification[J].IEEE transaction on plasma science,2000,28:128-132.

[6]Yu Z L,Wang X D,Deng J G.Primary studies of mutational mechanism for rice induced by ion implantation[J].Anhui Agric Sci,1989,28:12-16.

[7]劉志芳,邵俊明,唐掌雄,等.不同能量重離子注入農作物的誘變效應[J].核農學報,2006,20(1):1-5.

[8]Wanguang Chen,Yanzhao Zhang,Yanwei Cheng.Analysis of coexpression genes inOryzasativaL. treated with low-energy ion-beam[J].Environmental Technology and Resource Utilization II 2014,675(677):1 129-1 132.

[9]余澤高,顧正清,蔡金.60Co-γ射線輻射小麥種子貯藏效應的研究[J].核農學報,2005,19(2):92-94.

[10]張躍強,樊哲儒,李劍峰,等.60Co-γ 射線誘變選育早熟、優(yōu)質、高產小麥新品種新春30號[J].核農學報,2010,24(5):978-981.

[11]周柱華,許立華,王麗麗,等. 玉米自交系魯原92 的選育及應用[J].核農學報,2009,23(6):986-989.

[12]高飛,肖靖,谷運紅,等.利用小麥葉片SPAD值預測成熟期籽粒蛋白質含量的研究[J].光譜學與光譜分析,2012,32(5):1 350-1 354.

[13]Herbert Wieser Susanne Antes , Werner Seilmeier.Quantitative determination of gluten protein types inwheat flour by reversed-phase high performance liquid chromatography[J].Cereal Chem,1998,75(5):644-650.

[14]Verbruggen I M,Veraverbeke W S,Vandamme A,Delcour J A.Simultaneous isolation of wheat high molecular weight and low molecular weight glutenin subunits[J].Cereal Sci,1998,28:25-32.

[15]楊學舉,盧少源,張榮芝.小麥籽粒組分蛋白質組分與面包烘焙品質形狀關系的研究[J].中國糧油學報,1999,14(1):1-5.

[16]鄧志英,田紀春,劉現(xiàn)鵬.不同高分子量谷蛋白亞基組合的小麥籽粒蛋白組分及其谷蛋白大聚合體的積累規(guī)律[J].作物學報,2004,30(5):481-486.

Analysis of Storage Protein and Agronomic Traits of Mutanted Wheat by Ion-beam

HANLitao，GUYunhong，JIAOZhen

(Henan Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering,Zhengzhou University，Zhengzhou Hen’an 45000，China)

The technology of ion-beam mediation is a very effective method resulting in plant mutation.In order to improve the quality characters of wheat, we adopt the method of ion beam mediated exogenous total DNA,transformed and bred a number of valuable wheat variation materials.Then we analyzed the agronomic traits,quality traits and storage protein of variants,found obvious changes on height,thousand grain weight,leaf area,wet gluten content,SDS sedimentation value and protein content compared the control,and these changes had reached significant difference level.However,there are still some problems on the material whose disease resistance were not well or protein content was high but had not better quality.So these materials need further improvement.The content of storage protein of the variant materials had obvious difference with the control,and the content of protein and wet gluten had obvious increase.These results show that the ion beam mediated process help to produce rich variation,and the variation has a close relation to the receptor gene.we need to cultivate this batch of variation materials,and then breed some variety with good germplasm resources,high protein content and better quality.

ion-beam; agronomic and quality traits; storage protein

2016-07-17

國家自然科學基金(編號：11375154)；國家自然科學基金(編號：11405147)；2014年度河南省高等學校青年骨干教師資助計劃(編號：2014 GGJS-009)；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(編號：142300413204)。

韓利濤 (1990—)，男，河南中牟人；碩士研究生，主要從事作物遺傳育種及生物物理學研究；E-mail：hanlitao@gs.zzu.edu.cn。

谷運紅(1976—)，女，河南新密人；教授，主要從事作物遺傳育種及生物物理學研究；E-mail：guyunhong@zzu.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.012

S 512.1

A

1001-4705(2016)12-0012-06