不同因素對小麥根尖染色體制片的影響

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(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院， 河北 秦皇島 066004)

不同因素對小麥根尖染色體制片的影響

鄒景偉，郭振清，張志雯，任學(xué)軍，林小虎

(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院， 河北 秦皇島 066004)

以小麥根尖為材料，探討了低溫、秋水仙素、8-羥基喹啉和對二氯苯4種預(yù)處理對小麥根尖細(xì)胞有絲分裂積累中期分裂相的效果。結(jié)果表明，這4種預(yù)處理方法積累有絲分裂中期分裂相效果的明顯程度由大到小依次為秋水仙素、低溫、對二氯苯和8-羥基喹啉，前2種方法效果明顯且差異不大，后2種方法效果略差。在此基礎(chǔ)上，對低溫預(yù)處理后的根尖在制片過程中的一些因素進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)影響制片效果的主要因素是低溫預(yù)處理時間和HCl解離時間。最終得到以小麥根尖為取樣對象的體細(xì)胞染色體制片的最適方法。為小麥族物種的染色體加倍、異染色體系的鑒定、細(xì)胞遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域提供方法依據(jù)。

小麥； 根尖體細(xì)胞； 染色體制片； 影響因素

小麥(TriticumaestivumL.)是我國重要的糧食作物。隨著時間的推移和氣候條件的變化，對小麥的種質(zhì)資源創(chuàng)新與品種的改良提出了越來越多的要求[1-3]。利用小麥近緣屬種的優(yōu)良基因是改良普通小麥性狀的重要手段，其主要方法有染色體倍性化、異染色體系和遠(yuǎn)緣雜交等。其中，倍性鑒定和異染色體系鑒定是染色體工程育種及其應(yīng)用的重要鑒定手段[4]。準(zhǔn)確、有效地鑒定出倍性水平及異染色體數(shù)目的方法，對控制育種工作的盲目性、顯著降低工作量、降低成本、加速育種進(jìn)程具有重要意義[5]。

在眾多鑒定方法中，細(xì)胞學(xué)鑒定是檢驗外源染色體的基本手段，染色體制片則是細(xì)胞學(xué)鑒定的基本技術(shù)手段[6-7]。染色體制片法是進(jìn)行細(xì)胞倍性和異染色體系鑒定最直接、最可靠的方法。它不僅計數(shù)準(zhǔn)確，而且不需要復(fù)雜的儀器，是目前應(yīng)用最多的鑒定方法。由于普通小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，所以它可以與小麥的近緣屬種進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的代換系、易位系等眾多異染色體系等,都需要進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞學(xué)等鑒定工作。例如，普通小麥與八倍體小偃麥，普通小麥與長穗偃麥草，普通小麥與中間偃麥草等遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的后代都需要對其染色體水平上進(jìn)行鑒定[8-10]。染色體制片技術(shù)不僅在小麥屬的倍性鑒定和異染色體系鑒定上應(yīng)用廣泛，而且在其他植物中都應(yīng)用廣泛。在鷹嘴豆、天山雪蓮、菜用大黃等植物中也有關(guān)于染色體制片的報道，并以此為基礎(chǔ)，對其進(jìn)行深入的研究[11-13]。

長期以來,人們一直在探索和改進(jìn)觀察染色體方法，從最早的涂片法到經(jīng)典的常規(guī)壓片法，從20世紀(jì)60年代末建立的顯帶技術(shù)[14]到90年代發(fā)展起來的染色體原位雜交技術(shù)[15-16]。染色體制片技術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞遺傳學(xué)檢測技術(shù)的基礎(chǔ)。但是，影響染色體制片技術(shù)的因素很多。本研究對小麥根尖體細(xì)胞染色體的制片技術(shù)進(jìn)行了探討和適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，供業(yè)內(nèi)專家們參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

由河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院小麥育種課題組選育的種質(zhì)材料HB 20121023。HB 20121023是本課題組利用八倍體小黑麥勁松5號(2n=8 X=56)與普通小麥品種京冬8號(2n=6 X=42)雜交、回交、自交后獲得，具體世代為BC1F4代，且染色體數(shù)目為42條。

1.2 方 法

1.2.1 材料的前處理

選取飽滿的小麥種質(zhì)材料HB 20121023種子浸泡在培養(yǎng)皿中，在室溫或者恒溫箱(25 ℃)黑暗條件下，培養(yǎng)至種子露白。然后將種子擺放在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)在室溫或恒溫箱(25 ℃)黑暗條件下培養(yǎng)。待小麥根尖長至1.0～1.5 cm時，進(jìn)行取材。取材時間一般在09：00～11：00時(此時間段內(nèi)細(xì)胞分裂旺盛，容易得到良好的分裂相)。

將取好的根尖根據(jù)不同的預(yù)處理方法分為4個組別。由于試劑的不同，其預(yù)處理時間也不相同。根據(jù)前人研究和本研究的前期試驗，本試驗選取了4種比較適宜的預(yù)處理方法進(jìn)行前期的預(yù)處理。前3種方法的預(yù)處理時間為相應(yīng)預(yù)處理方法的最佳預(yù)處理時間。同時，針對預(yù)處理條件為低溫的組別，分別設(shè)置4個不同處理時間的組別(24，28，32，36 h)。然后將經(jīng)過預(yù)處理的根尖，用新配制的卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h，然后換入70%的酒精中，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同預(yù)處理方法與預(yù)處理時間

組別指標(biāo)預(yù)處理時間(h)秋水仙素[17]0．1%3對二氯苯[18]飽和水溶液48?羥基喹啉[19]0．002mol/L2低溫4℃24，28，32，36

1.2.2 小麥根尖臨時裝片制作與觀察統(tǒng)計

小麥臨時裝片的制作流程參照李丹丹等[20]的植物染色體裝片的制作流程，并對其進(jìn)行了部分改進(jìn)，以便更適合本次研究。每一試樣觀察6～8個根尖裝片，記錄每個視野中觀察的總細(xì)胞數(shù)、分裂的細(xì)胞數(shù)及分別處于前、中、后末期的細(xì)胞數(shù)，并對各組別的染色體形態(tài)特征進(jìn)行觀察和分析。

根據(jù)預(yù)處理的試驗結(jié)果，選取預(yù)處理條件為低溫處理28 h組別的根尖進(jìn)行臨時裝片的制作。方法：將固定好的幼根用蒸餾水清洗2～3 min，用濾紙吸干處理好的小麥幼根上的浮水，浸于在65 ℃的水浴鍋中預(yù)熱的1 mol/L HCl，解離時間分別設(shè)置為5，10，15 min和20 min。取出后，用蒸餾水清洗2～3 min；用刀片取根尖發(fā)白處2～3 mm，用卡寶品紅染色3～5 min，然后進(jìn)行壓片觀察。以此探索不同的解離時間對小麥中期染色體形態(tài)的影響，探究其最適解離時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種不同預(yù)處理方法對小麥根尖細(xì)胞染色體積累中期分裂相的影響

觀察4種不同預(yù)處理方法下小麥根尖細(xì)胞的分裂相和染色體的形態(tài)特征，對各種處理的前、中、后、末期的染色體形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行觀察與統(tǒng)計(表2)。秋水仙素能成功地使有絲分裂停滯在中期，并且有效積累中期細(xì)胞(58.82%)；低溫對其抑制作用(55.43%)僅次于秋水仙素；對二氯苯對紡錘體的抑制效果(37.29%)略優(yōu)于比8-羥基喹啉(26.39%)。

2.2 預(yù)處理條件為低溫，不同預(yù)處理時間對小麥根尖細(xì)胞中期染色體的影響

根據(jù)本試驗的前期試驗結(jié)果，將預(yù)處理時間設(shè)為4個時間梯度。試驗結(jié)果表明：在一定的預(yù)處理時間范圍內(nèi)，預(yù)處理時間越短，則染色體的濃縮程度不明顯，染色體越長且細(xì)(圖1 A和圖1 B)；低溫預(yù)處理時間越長，染色體的濃縮程度明顯，染色體縮短變粗；染色體的縊痕明顯(圖1 C和圖1 D)。

2.3 預(yù)處理條件為低溫(預(yù)處理時間為28 h)，不同解離時間對小麥根尖細(xì)胞染色體制片效果的影響

表2 4種不同預(yù)處理方法對有絲分裂的影響

組別細(xì)胞總數(shù) 分裂相 前期 中期 后末期 數(shù)目指數(shù)(%)數(shù)目比例(%)數(shù)目比例(%)數(shù)目比例(%) 秋水仙素1354685．021522．064058．821319．12 對二氯苯1312594．502745．762237．291016．95 8?羥基喹啉1296725．564156．941926．391216．67 低溫(28h)1309927．031920．655155．432223．91

圖1 不同預(yù)處理時間對小麥根尖細(xì)胞中期染色體的影響

注：A為20 min,B為15 min,C為15 min,D為10 min,E為10 min。圖2 不同解離時間對小麥根尖細(xì)胞中期染色體的影響

試驗中發(fā)現(xiàn)，由于材料解離不充分，使得制片時細(xì)胞不易分散，染色體集中成團，分散效果不好，不能得到良好的分裂相；同樣，用解離過度的材料進(jìn)行壓片時發(fā)現(xiàn)，染色體易斷裂，制片效果模糊，也得不到效果好的分裂相(圖2 A)。解離時間為10 min時，可以得到較好的分裂相(圖2 D和圖2 E)。

3 討 論

在染色體制片技術(shù)中，前期預(yù)處理試驗是整個染色體制片試驗過程中最為重要的一個環(huán)節(jié)。不同植物不僅在取材、預(yù)處理上存在較大差異，而且在預(yù)處理試劑與預(yù)處理時間的選擇上，也會關(guān)系到染色體制片的質(zhì)量[21]。有絲分裂染色體的運動與紡錘體的牽引具有密切關(guān)系。因此，只有成功地抑制或者破壞紡錘體的形成，才能夠更多地積累有絲分裂中期的細(xì)胞。在細(xì)胞分裂過程中，紡錘體是由微管組成的，而微管管壁的主要成分為微管蛋白，有α微管蛋白和β微管蛋白2種。目前，在不同植物的根尖預(yù)處理試驗中，一般采取0.1%的秋水仙素水溶液、對二氯苯飽和水溶液、0.002 mol/L 8-羥基喹啉水溶液和低溫處理等方法。其中秋水仙素會與微管中β微管蛋白肽鏈中的第201位半胱氨酸結(jié)合，結(jié)合后不僅會阻斷微管的繼續(xù)聚合，而且會導(dǎo)致先前裝配好的微管發(fā)生解聚。因此秋水仙素能夠干擾微管裝配、破壞紡錘體形成和終止細(xì)胞分裂。低溫(4 ℃)則影響了微管的裝配，不能進(jìn)一步形成紡錘體，使得染色體失去了向細(xì)胞兩極移動的動力，所以進(jìn)行低溫預(yù)處理的細(xì)胞的有絲分裂會停留在中期階段，從而大量積累處于分裂中期的細(xì)胞[22]。本研究采用4種不同的預(yù)處理方法對小麥根尖進(jìn)行了預(yù)處理，得出如下結(jié)論：在本研究中，這4種預(yù)處理方法積累有絲分裂中期分裂相效果的明顯程度依次是：秋水仙素、低溫、對二氯苯和8-羥基喹啉。因此，秋水仙素和低溫是良好的預(yù)處理方法，8-羥基喹啉和對二氯苯則不是很理想，而且8-羥基喹啉不易溶于水，配制水溶液較為困難。試驗應(yīng)運用秋水仙素和低溫的方法對材料進(jìn)行前期的預(yù)處理試驗，結(jié)合經(jīng)濟角度和試驗安全性方面考慮，低溫則是最佳的預(yù)處理試驗方法。由于前人并沒有針對低溫預(yù)處理的不同時間對小麥染色體形態(tài)的影響進(jìn)行過研究，因此本研究又針對低溫預(yù)處理的時間長度進(jìn)行了探究，不同的低溫預(yù)處理時間與小麥根尖染色體的濃縮程度具有一定的相關(guān)性。在一定的低溫預(yù)處理時間內(nèi)，處理的時間越長，染色體濃縮程度越大，且縊痕明顯(圖1 D)。

HCl能夠解離細(xì)胞壁之間的果膠物質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)，使細(xì)胞變得分散。HCl可以使染色體中DNA與蛋白質(zhì)的聯(lián)系削弱使之分開。由于HCl直接作用于根尖分生區(qū)細(xì)胞的細(xì)胞壁，解離程度是否合適直接影響到制片的好壞[23]。因此，本研究針對低溫預(yù)處理條件下，不同解離時間對小麥根尖細(xì)胞制片的影響情況進(jìn)行了探索性研究。結(jié)果表明，本試驗材料的染色體數(shù)目為2n=42條，解離時間為10 min，解離效果最好；解離5 min左右的材料制片效果不是很好(未能取得較好的照片)，可能是細(xì)胞質(zhì)解離不夠的原因；解離時間超過10 min的細(xì)胞，染色體形態(tài)比較模糊，極個別細(xì)胞染色體發(fā)生斷裂，分析可能是因為解離過度，導(dǎo)致染色體形態(tài)發(fā)生變形。這說明，細(xì)胞的染色體容易受到高溫，強酸，強堿，輻射等因素的影響，并非是穩(wěn)定不變的。所以長時間解離會導(dǎo)致鹽酸解離液與染色體接觸時間過長，對染色體的結(jié)構(gòu)造成物理傷害，使其發(fā)生斷裂。

通過對本材料的試驗證明：在前期預(yù)處理過程中，秋水仙素與低溫對小麥根尖細(xì)胞有絲分裂中期的細(xì)胞積累效果較好；低溫條件下，不同預(yù)處理時間和不同解離時間的研究結(jié)果表明，小麥根尖前期低溫預(yù)處理的最佳預(yù)處理時間為28 h，最佳解離時間為10 min，能夠得到染色體的形態(tài)、大小較適宜的裝片。在低溫預(yù)處理的條件下，影響小麥細(xì)胞學(xué)制片的主要因素是對材料的預(yù)處理時間和解離時間。此外個人的制片技術(shù)熟練程度以及供試材料的差異也影響制片的質(zhì)量。

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Influences of Different Factors on Chromosome Preparation of Root-tip Tissue in Wheat

ZOUJingwei，GUOZhenqing，ZHANGZhiwen，RENXuejun，LINXiaohu

(College of Life Science and Technology,Hebei Normal University of Science amp; Technology,Qinhuangdao Hebei 066004,China)

Based on the root tips of wheat,this experiment studied four pretreatment factors,which are low temperature,colchicine,8-hydroxyquinoline and p-dichlorobenzene,affecting the effect of chromosomes in the metaphase of mitosis.The results indicated that the influencing effects of chromosomes in the metaphase of mitosis were significantly obvious.It was colchicine,low temperature,8-hydroxyquinoline and p-dichlorobenzene in turns.The influence degree of the first two factors was more significantly obvious than another two factors.Then based on the previous achievements of the study,it was also groped for other factors in the process of chromosome preparation under low temperature.It found that the major influencing factors were time for preliminary treatment under low temperature and times for disaggregation with HCl.In the end,It was determined that the most suitable method about chromosome preparation with the root tips of wheat,which is expected to provide the basic method for chromosome doubling,identification of heterochromosome system and cytogenetics for Triticeae Dumort.

wheat； root tip cell； chromosome preparation； influencing factors

2016-07-27

“十二五”國家重大科技支撐計劃項目(編號：2011 BAD 16 B 08 S 10)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(編號：Q 2012005)；河北省自然科學(xué)基金項目(編號：C 2015407038)。

鄒景偉(1990—)，男，河北滄州人；在讀研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail:zoujingwei2013@qq.com。

林小虎(1972—)，男，內(nèi)蒙古赤峰人；教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事作物遺傳育種學(xué)教學(xué)及科研工作；E-mail:xiaohulin2008@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.008

S 512.1

A

1001-4705(2016)12-0008-04