濃香型大曲中一株酵母菌的分離鑒定及其揮發(fā)性產(chǎn)物分析

祝云飛，黃治國，鄧 杰，鐘姝霞，李永博，汪文鵬

(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000)

?

濃香型大曲中一株酵母菌的分離鑒定及其揮發(fā)性產(chǎn)物分析

祝云飛，黃治國，鄧 杰，鐘姝霞，李永博，汪文鵬

(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000)

大曲是酒醅中酵母菌的重要來源，酵母菌對產(chǎn)酒、產(chǎn)酯、生香等都有相應(yīng)的影響。研究大曲中的酵母菌對指導(dǎo)大曲生產(chǎn)、穩(wěn)定大曲質(zhì)量、提升白酒品質(zhì)具有重要意義和價(jià)值。試驗(yàn)采用傳統(tǒng)平板分離法從濃香型大曲中分離得到一株酵母菌，先通過形態(tài)特征觀察并利用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，然后對其固態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果表明，該菌株為休哈塔假絲酵母(Candidashehatae)，其揮發(fā)性產(chǎn)物主要為乙醇、異戊醇和苯乙醇等醇類，并含有多種其他香味物質(zhì)如異戊酸、苯乙醛、辛酸乙酯等。揭示了濃香型大曲中存在休哈塔假絲酵母，其主要作用為發(fā)酵產(chǎn)酒和產(chǎn)香味物質(zhì)。

大曲；酵母菌；Biolog鑒定；揮發(fā)性產(chǎn)物；GC-MS

引 言

中國白酒在全球各類蒸餾酒中獨(dú)樹一幟，它的生產(chǎn)基于一種“多菌共酵”的體系，各種微生物之間相互影響共同代謝發(fā)酵。通過自然富集篩選環(huán)境中的微生物而制得的大曲是發(fā)酵酒醅中復(fù)雜微生物菌群的重要來源，為酒醅提供了多種數(shù)量豐富的酵母菌、細(xì)菌、霉菌和少量的放線菌，但在大曲酒發(fā)酵過程中起主要作用的是酵母菌和專性厭氧或兼性厭氧的細(xì)菌[1]，酵母菌對產(chǎn)酒、產(chǎn)酯、生香等方面都有重要影響。

眾多專家學(xué)者對大曲中的酵母菌進(jìn)行了廣泛而深入的研究，有在傳統(tǒng)工藝上進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新，如添加HH-AADY(耐高溫活性干酵母)強(qiáng)化發(fā)酵，提高出酒率[2-3]，但酵母菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單純添加菌種進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵對提升酒質(zhì)幫助較小。很多研究開始對酵母菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析[4-5]，然而對微生物資源的開發(fā)利用，應(yīng)從獲取純種開始，故有專家學(xué)者先分離獲取純種，再進(jìn)行鑒定和相關(guān)的研究[6-8]。鑒于樣品來源、分離培養(yǎng)方法、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)操作等的影響與限制，難以分離純化得到大曲中所有的酵母菌菌株。

本文嘗試采用平板劃線法從濃香型大曲中分離酵母菌，利用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對其進(jìn)行鑒定，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后利用頂空固相微萃取(HS-SPME)法提取其揮發(fā)性產(chǎn)物，隨后進(jìn)行GC-MS分析。旨在進(jìn)一步揭示濃香型大曲中酵母菌群落的組成，并分析所得菌株發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性產(chǎn)物，初探其在白酒釀造中的作用和應(yīng)用價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品

四川全興酒業(yè)有限公司生產(chǎn)的濃香型中高溫大曲。

1.2 試劑和設(shè)備

0.9%的生理鹽水；美藍(lán)試劑；BUY瓊脂培養(yǎng)基、YT鑒定板、GEN Ⅱ Microstation Biolog自動(dòng)微生物鑒定儀(美國Biolog公司)；50 μm/30 μmDVAB/CAR/PDMS 固相微萃取頭(美國Supelco 公司)；Agligent 6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；超凈工作臺(tái)，顯微鏡，高壓滅菌鍋等。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[9]：pH 5.0～6.0。

BUY培養(yǎng)基(Biolog專用)：BUY瓊脂培養(yǎng)基6 g，瓊脂粉2～3 g，100 mL蒸餾水，加熱溶解，冷卻后調(diào)節(jié)pH至5.0～6.0，121 ℃滅菌20 min。

液態(tài)種子培養(yǎng)基：20 g蔗糖，20 g蛋白胨，10 g酵母浸出粉，1 L蒸餾水，加熱溶解后分裝于150 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：30 g高粱粉加蒸餾水15 mL，加入250 mL三角瓶中攪拌均勻，121 ℃滅菌20 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 酵母菌分離與形態(tài)學(xué)鑒定

采用平板劃線法分離菌株[9]。28 ℃培養(yǎng)3～5天，觀察菌落形態(tài)，并結(jié)合美藍(lán)染色、鏡檢。挑取具有酵母菌形態(tài)特征的單菌落，1～2次純化后接于斜面，4 ℃保藏。

1.4.2 Biolog鑒定[10-13]

菌株活化：將分離所得菌株用PDA培養(yǎng)基活化。

BUY瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)：將活化菌株十字交叉劃線接種，接種面積應(yīng)適當(dāng)加寬，以獲得足夠的菌量。28 ℃培養(yǎng)48～72 h，培養(yǎng)2代，若菌株長勢較差可增加接種平板數(shù)。

濁度調(diào)整與菌懸液制備：先以裝有空白無菌水的玻璃管調(diào)100 %透光率，并用YT濁度標(biāo)準(zhǔn)管將讀數(shù)調(diào)整至47%，再在無菌條件下，用滅菌棉簽挑取BUY培養(yǎng)基上的菌落，接種于無菌水中，使菌體均勻分散，最后通過添加菌體或無菌水調(diào)整菌懸液的濁度至47±3%。

微平板接種、培養(yǎng)與讀數(shù)：將制備好的菌懸液加入鑒定板孔內(nèi)，每孔100 μL，然后用塑料袋密封，以保證其濕度；30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，分別用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，讀取并記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3 液體培養(yǎng)與固態(tài)發(fā)酵

液體培養(yǎng)：菌株經(jīng)平板活化后，挑取少量菌體接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 rpm，搖床培養(yǎng)2～3天。

在城市經(jīng)濟(jì)學(xué)課程中應(yīng)用翻轉(zhuǎn)課堂的教學(xué)模式，改變了傳統(tǒng)的教學(xué)模式，課程資源通過交互式多媒體方式被推送到電腦、手機(jī)、智能終端等各種設(shè)備上，學(xué)生借助于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)就可以比較方便地去訪問在線的教育資源，學(xué)生自主學(xué)習(xí)課程內(nèi)容，滿足個(gè)性化學(xué)習(xí)需要。翻轉(zhuǎn)課堂自主學(xué)習(xí)的模式，使知識(shí)講授不再受到課時(shí)的影響，通過視頻能更系統(tǒng)的講授相關(guān)的經(jīng)濟(jì)學(xué)知識(shí)。同時(shí)，翻轉(zhuǎn)課堂的教學(xué)模式使學(xué)生、將課外主動(dòng)學(xué)習(xí)中的疑惑或不解帶到課堂上，通過提問、討論等方式完成對新知識(shí)的建構(gòu)和掌握，提高了學(xué)習(xí)效果。最后，在翻轉(zhuǎn)課堂的教學(xué)中，通過設(shè)計(jì)課堂討論題目，在課堂討論中促使學(xué)生在理解和掌握知識(shí)的基礎(chǔ)上，綜合分析實(shí)際的問題，強(qiáng)化知識(shí)的吸收與運(yùn)用。

固態(tài)發(fā)酵：無菌條件下，吸取10 mL液體培養(yǎng)的種子液，加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，密閉瓶口，28 ℃恒溫發(fā)酵7天。

1.4.4 頂空固相微萃取(HS-SPME)

稱取8 g固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基加入頂空瓶中，在60 ℃恒溫條件下，先平衡10 min，再頂空萃取30 min，隨后于GC-MS進(jìn)樣口以200 ℃解吸3 min。

1.4.5 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析條件

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱為J&W 122-7062，規(guī)格為60.0 m×250 μm×0.25 μm；手動(dòng)分流進(jìn)樣，分流比為15﹕1；進(jìn)樣口溫度200 ℃；起始溫度：40 ℃，維持1 min，然后以5 ℃/min升溫至150 ℃，維持1 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，維持3 min；以He為載氣，流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度100 ℃，恒壓10 Pa，全掃描。

2 試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 酵母菌的分離與初步鑒定結(jié)果

從全興濃香型中高溫大曲中成功分離純化出一株酵母菌，編號為J-01，其菌落圖及其美藍(lán)染色的鏡檢結(jié)果如圖1所示。其菌落呈圓形，隆起，乳白色，邊緣較整齊，易挑取，粘稠，長時(shí)間培養(yǎng)將呈暗黃色，具有酵母菌菌落典型的形態(tài)特征，其菌體特征為橢圓形，可見出芽繁殖形成的芽體。

圖1 酵母菌J-01菌落與鏡檢圖(40×)

2.2 Biolog 鑒定結(jié)果

對分離得到的酵母菌J-01采用BUY培養(yǎng)基十字交叉劃線接種，酵母菌J-01在BUY培養(yǎng)基上，生長十分旺盛，代謝較高，沒有其他雜菌存在，滿足下一步微平板接種所需要的純度以及所需的生物量。對J-01進(jìn)行微平板接種并在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，對微平板進(jìn)行Biolog讀數(shù)，培養(yǎng)48 h后的鑒定結(jié)果見表1。

表1 酵母菌J-01的鑒定結(jié)果

由表1可知，系統(tǒng)[14]給出的最大可能結(jié)果是Candidashehatae(休哈塔假絲酵母)，其PROB(可能性)、SIM(相似性)和DIST(位距)分別為0.960、0.853、1.807，基本確定J-01為休哈塔假絲酵母。

2.3 揮發(fā)性產(chǎn)物分析

圖2 酵母菌J-01揮發(fā)性產(chǎn)物總離子流圖譜

表2 酵母菌J-01主要揮發(fā)性產(chǎn)物

由表2可知，J-01固態(tài)發(fā)酵的主要揮發(fā)性產(chǎn)物為乙醇、異戊醇和苯乙醇，相對含量分別為54.71%、21.10%和10.16%。乙醇是白酒的主體成分，乙醇相對含量高表明酵母菌J-01具有較好的酒精發(fā)酵能力，可提高原料利用率。苯乙醇是我國規(guī)定允許使用的食用香精，是白酒重要的風(fēng)味成分，是米香型白酒的主體香味成分之一。異戊醇可以用作香精、分析試劑、制藥等，在白酒中可以增加酒體的醇甜感，讓酒體更豐滿。

酵母菌J-01代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物中還有其他多種香味物質(zhì)，如異戊酸(相對含量4.55%)，可用于制備香料，高度稀釋后則有甜潤的果香以及篤斯越橘的香味；苯乙醛(相對含量0.81%)具有類似風(fēng)信子的香味，稀釋后具有水果的甜香氣；1-辛烯-3-醇(相對含量1.36%)，又名蘑菇醇，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香味；辛酸乙酯(相對含量0.45%)，具有白蘭地酒香味；3-辛醇(相對含量0.18%)，其具有強(qiáng)烈的油脂、果仁和草藥香味，稀釋后呈蘑菇香氣和干酪香味，在白酒中作為香味物質(zhì)。

3 討論

本文利用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，對分離得到的酵母菌J-01進(jìn)行鑒定，首次報(bào)道濃香型大曲酵母菌群落中存在休哈塔假絲酵母(Candidashehatae)。相比于傳統(tǒng)基于形態(tài)和生理生化特征的微生物鑒定方法，Biolog鑒定法在鑒定速度和準(zhǔn)確性方面有一定的優(yōu)勢，后續(xù)可以進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以相互驗(yàn)證，并分析該菌種的進(jìn)化關(guān)系。

在分離篩選的過程中，發(fā)現(xiàn)在pH為5.0～6.0時(shí)篩選效果最好，酵母菌可以正?？焖俚厣L，霉菌和細(xì)菌得到了一定程度的抑制，表明該菌株對酸性環(huán)境具有一定的耐受性，能夠適應(yīng)固態(tài)發(fā)酵酒醅中低pH條件而在酒醅中有更長的存活和發(fā)酵代謝時(shí)間，可進(jìn)一步的研究。

GC-MS分析結(jié)果表明，休哈塔假絲酵母除最主要的揮發(fā)性產(chǎn)物為乙醇外，還有其他醇類、醛類、酸類等香味成分，因而休哈塔假絲酵母在白酒釀造中的作用可能體現(xiàn)在產(chǎn)酒和生香兩方面。休哈塔假絲酵母是能夠直接利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的少數(shù)天然菌種之一，在利用休哈塔假絲酵母發(fā)酵農(nóng)作物廢棄物生產(chǎn)乙醇方面已有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，而釀酒酵母不能利用木糖進(jìn)行發(fā)酵，因此在酒醅添加休哈塔假絲酵母強(qiáng)化發(fā)酵對提高出酒率和提升酒質(zhì)可能都有一定的幫助。

大曲中酵母菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且受不同地區(qū)地域環(huán)境的影響，其群落結(jié)構(gòu)也將呈現(xiàn)出一定的差異，對大曲酵母菌菌群進(jìn)行研究，保障大曲質(zhì)量，提升白酒品質(zhì)，仍需大量的研究工作。

[1] 肖光冬.白酒生產(chǎn)技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 戴森,樊林,陳周平,等.TH-AADY在瀘型酒中生產(chǎn)名優(yōu)酒的研究[J].釀酒科技,1998(2):32-35.

[3] 徐希望,蘇循亮,張彬.TH-AADY在濃香型大曲酒秋季轉(zhuǎn)排生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].釀酒科技,2005(9):95-100.

[4] 惠豐立,柯濤,褚學(xué)英,等.大曲中酵母菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(1):107-111.

[5] 徐占成,唐清蘭,劉孟華,等.劍南春大曲曲藥真菌群落結(jié)構(gòu)的分析[J].釀酒,2015,42(4):19-22.

[6] 賴穎,趙錦慧,胡炳義,等.中高溫大曲中耐高溫酵母菌的篩選及其發(fā)酵特性的研究[J].釀酒科技,2014(11):42-45.

[7] 明紅梅,董瑞麗,許德富,等.濃香型大曲中優(yōu)勢菌的分離及初步鑒定[J].釀酒科技,2013(12):63-66.

[8] 張磊,施思,張文學(xué),等.濃香型白酒大曲中酵母菌的分離和鑒定[J].釀酒科技,2010(5):30-32.

[9] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].2版.北京:高等教育出版社,2006.

[10] 孫瑩,季方,周維軍,等.Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對2株大曲菌種的鑒定[J].釀酒,2013,40(3):73-75.

[11] 衛(wèi)春會(huì),楊曉東,黃治國,等.濃香型大曲中兩株酵母菌的分離及其Biolog微生物鑒定[J].釀酒科技,2013(4):31-32,36.

[12] 劉宏媛,李光輝,羅惠波,等.大曲中酵母菌的分離及Biolog微生物系統(tǒng)分析鑒定[J].食品與發(fā)酵科技,2011,47(1):1-3,22.

[13] 聶凌鴻,樊璐,季方.大曲中細(xì)菌和酵母菌的分離及其Biolog微生物系統(tǒng)分析鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(2):1036-1038,1122.

[14] 姚粟,程池,李金霞,等.Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)_酵母菌鑒定操作規(guī)程的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(7):67-71.

[15] 夏黎明,余世袁,丁紅衛(wèi).固定化休哈塔假絲酵母細(xì)胞發(fā)酵玉米稈水解液的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),1994(14):51-55.

[16] 葛薔萍,劉國明,楊曉峰,等.休哈塔假絲酵母HDYXHT-01利用木糖生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].生物工程學(xué)報(bào),2011,27(3):404-411.

Isolation and Identification of One Yeast Strain from Nong-flavor Daqu and Analysis of Its Volatile Products

ZHUYunfei,HUANGZhiguo,DENGJie,ZHONGShuxia,LIYongbo,WANGWenpeng

(Liquor-making Biotechnology & Application key Laboratory of Sichuan Province, Zigong 643000, China)

Daqu is an important source of yeast in fermented grains, and the yeast has a corresponding effect on the produce of alcohol, esters and flavor component. Research of yeast in Daqu has an important meaning and value to guide Daqu production and stable the quality of Daqu, and improve the quality of liquor. The test of a yeast strain was isolated form Nong-flavor Daqu through traditional plate separation method. Firstly through the observation of morphological characteristics, and using Biolog microbial identification system to identify, then the volatile products of solid-state fermentation was analysised by GC-MS. The results showed that the strain wasCandidashehatae, the main component of its volatile products were ethanol, isoamyl alcohol and phenethyl alcohol, and it also contained other kinds of flavor substances such as isovaleric acid, hyacinthin and ethyl caprylate. The study revealed the existence of Candida shehatae in nong-flavor Daqu, and its main function is to produce alcohol and flavor component.

Daqu; yeast strain; Biolog identification; volatile products; GC-MS

2015-12-24

固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(2015GTY004)；四川省教育廳科技成果轉(zhuǎn)化重大培育項(xiàng)目(15CZ0023)；自貢市重點(diǎn)科技計(jì)劃(2014ZC03)；四川理工學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(2014RC28; 2015RC12)

祝云飛(1990-)，男，江西撫州人，碩士生，主要從事釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用方面的研究，(E-mail)1148733530@qq.com;

黃治國(1978-)，男，四川廣安人，教授，博士，主要從事生物技術(shù)方面的研究，(E-mail)hzgwww@126.com

1673-1549(2016)01-0007-05

10.11863/j.suse.2016.01.02

TS261.1+1

A