基于體外模擬消化的黑脈羊肚菌多酚細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性

鄭少杰，廖 霞，盧可可，劉 冬，吳素蕊，明 建,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055；3.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

基于體外模擬消化的黑脈羊肚菌多酚細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性

鄭少杰1，廖 霞1，盧可可1，劉 冬2，吳素蕊3，明 建1,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055；3.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

以黑脈羊肚菌多酚提取物為研究對(duì)象，通過(guò)體外模擬消化實(shí)驗(yàn)，研究消化過(guò)程中消化液多酚含量及氧自由基吸收能力的變化；研究體外模擬胃、腸消化對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）的毒性及抗增殖活性的影響；并以HepG2細(xì)胞為模型對(duì)細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：體外模擬消化后，黑脈羊肚菌多酚釋放及氧自由基吸收能力均有提高，模擬胃、腸消化過(guò)程中多酚釋放分別在1 h和0.5 h達(dá)到最高并保持穩(wěn)定。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的范圍內(nèi)，胃0 h、胃液1 h、腸液0.5 h對(duì)HepG2的抑制率分別為41%、45%、91%；對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制率分別為73%、96%、90%。CAA結(jié)果顯示，胃消化處理的樣品表現(xiàn)出促氧化的作用，腸消化處理的樣品表現(xiàn)出抗氧化的作用，腸液0.5 h的CAA值為（70.506±0.011）μmol QE/100 g（以干質(zhì)量計(jì)）。由此可見，體外模擬消化處理黑脈羊肚菌具有一定的抗氧化及抗增殖活性，為羊肚菌功能活性的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

黑脈羊肚菌；模擬消化；多酚；氧自由基吸收能力；細(xì)胞抗氧化活性

黑脈羊肚菌（Morchella angusticepes Peck）是我國(guó)常見羊肚菌品種之一，主要分布于四川、云南、甘肅等地。羊肚菌中蛋白質(zhì)含量豐富、種類齊全、氨基酸組成優(yōu)于大豆蛋白[1]，并且含有微量元素、抗氧化物質(zhì)等活性成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，有研究報(bào)道，黑脈羊肚菌多酚含量豐富，對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基（ABTS+·）有清除作用，具有一定的抗氧化、抗增殖作用[2-5]。

然而這些研究主要針對(duì)有機(jī)溶劑提取羊肚菌多酚的化學(xué)研究，并沒有考慮到羊肚菌在消化系統(tǒng)中酶對(duì)其抗氧化成分的影響，因此本研究以中國(guó)云南產(chǎn)的黑脈羊肚菌為原料，對(duì)其進(jìn)行體外模擬消化，分析消化過(guò)程中多酚及氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）的變化情況，以人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）和人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）為模型，對(duì)黑脈羊肚菌經(jīng)體外模擬消化處理后的細(xì)胞毒性及抗增殖活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用Wolfe等[6]建立的細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）方法，以HepG2細(xì)胞為模型，從細(xì)胞水平上對(duì)黑脈羊肚菌經(jīng)體外模擬消化處理后的CAA進(jìn)行評(píng)價(jià)，為羊肚菌功能活性及營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑脈羊肚菌（Morchella angusticepes Peck）產(chǎn)自云南，由中華全國(guó)供銷總社昆明食用菌研究所提供。人肝癌細(xì)胞HepG2、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2 美國(guó)菌種保藏中心。

沒食子酸、槲皮素、Folin-Ciocalteu、2,2’-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，ABAP）、熒光素鈉鹽、胃蛋白酶、胰酶、膽汁提取物、WME培養(yǎng)基等 美國(guó)Sigma公司；胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、平衡鹽溶液（hanks balanced salt solutions，HBSS）、DMEM培養(yǎng)基美國(guó)賽默飛世爾公司；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorofuorescin diacetate，DCFH-DA） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋 上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SpectraMaxM2型連續(xù)光譜密度熒光檢測(cè)儀 美國(guó)Molecular公司；HERA cell 240型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；BHC-BOOⅡA2型生物安全柜 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

羊肚菌用前至50 ℃烘箱中烘干，中草藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80 目篩后密封避光保存。

1.3.2 體外模擬消化

參考趙旭[7]的方法。體外模擬消化包括體外模擬胃、腸消化兩部分。體外模擬腸消化是在胃消化多酚最佳釋放時(shí)間點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。

1.3.2.1 體外模擬胃消化

稱取20 g干樣品，加入200 g生理鹽水，沸水浴糊化15 min（中心溫度達(dá)到80 ℃）；冷卻至室溫，去離子水恒質(zhì)量至220 g；1 mol/L HCl調(diào)pH值至2.0，加入2.5 mL胃蛋白酶溶液（0.2 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L HCl溶液）。空白對(duì)照組用等體積的生理鹽水替代鹽酸和胃蛋白酶，胃酸對(duì)照組用等體積0.01 mol/L HCl代替胃蛋白酶。避光，充分充入氮?dú)夂笤?37 ℃的恒溫水浴搖床消化4 h。

分別在消化0、0.5、1、2、3、4 h時(shí)取出一定質(zhì)量的懸濁液；4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 體外模擬腸消化

向達(dá)到最佳胃消化時(shí)間的消化液中加入1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至7.0；加入5 mL胰酶-膽汁提取物（4 g胰酶、25 g膽汁提取液溶于1 L 0.1 mol/L NaHCO3緩沖溶液），混勻?？瞻捉M用等體積NaHCO3緩沖溶液代替胰酶-膽汁提取物。避光，充分充入氮?dú)猓?7 ℃恒溫水浴搖床消化5 h 。

分別在消化0、0.5、1、2、3、4、5 h 時(shí)取出一定質(zhì)量的懸濁液；4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 多酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[8-9]，樣品解凍，離心后取上清液，進(jìn)行多酚含量測(cè)定。結(jié)果以每100 g干物質(zhì)相當(dāng)于沒食子酸（galic acid，GA）的含量表示（mg GAE/100 g），以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 ORAC值測(cè)定

參照Wolfe[10]、Kremer[11]等的方法，結(jié)果以每100 g干物質(zhì)相當(dāng)于水溶性VE（Trolox）的含量（μmol TE/100 g表示，以干質(zhì)量計(jì)。其工作原理是：熒光素鈉鹽作為熒光指示劑在485 nm光波激發(fā)下可發(fā)射538 nm的熒光。在有自由基或氧化劑時(shí)，熒光素鈉鹽的熒光逐漸減弱；當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，熒光素鈉鹽的熒光減弱被抑制。然后計(jì)算熒光衰退曲線下面積（area under the curve，AUC），有抗氧化劑的熒光衰退AUC與無(wú)抗氧化劑時(shí)熒光衰退AUC之差為抗氧化劑的保護(hù)面積，通過(guò)抗氧化劑的保護(hù)面積與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)的保護(hù)面積相比得出抗氧化劑的ORAC值。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞HepG2用含有體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的培養(yǎng)液，人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2用含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)傳代，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為第12～35代。

1.3.6 細(xì)胞毒性測(cè)定

細(xì)胞毒性測(cè)定參照Malta[8]、Huang Haizhi[12]等的方法，即取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞或Caco-2細(xì)胞接種于96 孔白板中，控制每孔細(xì)胞數(shù)約為4×104個(gè)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗一次，樣品孔加入100 μL含樣品的培養(yǎng)基，控制孔加入100 μL的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度梯度做3 個(gè)平行，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h后測(cè)定。測(cè)定方法：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，每孔加入50 μL亞甲基藍(lán)染色溶液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下孵育1 h，然后移去染液，在去離子水中洗板3 次或洗至去離子水無(wú)色，吸取多余的水分并放置2～3 min，每孔加入100 μL洗脫液，然后振蕩20 min，在波長(zhǎng)570 nm下讀板。與控制孔相比，處理孔減小的吸光度與控制孔吸光度的比值即可代表此樣品細(xì)胞毒性大小，吸光度減少大于等于10%時(shí)，即認(rèn)為樣品具有細(xì)胞毒性。

1.3.7 細(xì)胞抗增殖活性測(cè)定

細(xì)胞抗增殖活性測(cè)定參照Boaventura等[13]的方法，即取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞或Caco-2細(xì)胞接種于96 孔白板中，控制孔細(xì)胞數(shù)約為2.5×104個(gè)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，使90%的細(xì)胞貼壁后，移去培養(yǎng)基，樣品孔加入100 μL含不同濃度樣品（根據(jù)加入的樣品體積換算出樣品的濃度）的培養(yǎng)基，控制孔加入100 μL的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度梯度做3 個(gè)平行，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)72 h后測(cè)定，測(cè)定方法同毒性測(cè)定方法。按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

處理孔OD值達(dá)到控制孔OD值50%時(shí)的樣品濃度為抗增殖活性的半有效抑制濃度（EC50），EC50值越低表示抗增殖活性越高。

1.3.8 CAA測(cè)定

采用Wolfe[6]、Boaventura[13]等方法，即細(xì)胞用抗氧化劑和本身無(wú)熒光的熒光探針（DCFH-DA）預(yù)處理，抗氧化劑結(jié)合在細(xì)胞膜上并通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞；DCFHDA穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被細(xì)胞酯酶水解形成極性更強(qiáng)的還原型二氯熒光素（dichlorofluoorescin，DCFH）。然后用ABAP處理細(xì)胞，ABAP在細(xì)胞內(nèi)形成過(guò)氧化自由基ROO·，過(guò)氧化自由基攻擊細(xì)胞膜產(chǎn)生更多自由基或活性氧（ROS·）。而細(xì)胞內(nèi)的DCFH極易被氧自由基或活性氧氧化成熒光物氧化型二氯熒光素（dichlorofluorescein，DCF），熒光物質(zhì)DCF可通過(guò)分光光度法測(cè)定?？寡趸瘎┛稍诩?xì)胞膜外部結(jié)合氧自由基而阻止其進(jìn)入細(xì)胞，或者在細(xì)胞膜內(nèi)部與ROS·和ROO·結(jié)合而阻斷DCFH氧化成DCF的過(guò)程，從而減少DCF的形成。CAA方法測(cè)定抗氧化劑阻止人體HepG2癌細(xì)胞中ABAP產(chǎn)生的氧自由基導(dǎo)致DCF形成的能力，與對(duì)照組相比，細(xì)胞熒光物質(zhì)的減少量能反映該化合物的抗氧化能力。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，接種至96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為6×104個(gè)，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h，移去培養(yǎng)基，PBS清洗后，用含不同濃度樣品的DCFH-DA工作液處理，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)1 h，移去處理培養(yǎng)基，用PBS清洗，棄去PBS并將氧化劑處理培養(yǎng)基加入空白孔中，含ABAP的氧化劑處理培養(yǎng)基工作液加入其他孔中，將96 孔板置于酶標(biāo)儀中讀板（發(fā)射波長(zhǎng)538 nm、激發(fā)波長(zhǎng)485 nm），保持溫度37 ℃恒定，測(cè)定60 min內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度的變化，換算出抗氧化物質(zhì)的CAA值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化對(duì)多酚釋放的影響

由圖1可知，與胃酸對(duì)照組、空白對(duì)照組相比，模擬胃液消化組在0～0.5 h釋放顯著增大，1 h后趨于平穩(wěn)，胃酸對(duì)照組和空白對(duì)照組的多酚釋放量幾乎沒有變化。這說(shuō)明模擬胃液消化組中胃蛋白酶對(duì)多酚釋放作用較胃酸和生理鹽水對(duì)多酚釋放作用大。模擬胃消化多酚釋放最大量為（1 254.1±28.7） mg GAE/100 g，是胃0 h多酚釋放量的1.21～1.26 倍。模擬腸液消化組的多酚釋放量略高于空白對(duì)照組，這說(shuō)明胰酶和膽汁混合物對(duì)多酚釋放量有影響，但是影響很小。模擬腸消化多酚釋放最大量為（1 347.48±54.5） mg GAE/100 g，是胃0 h多酚釋放量的1.26～1.28 倍；腸0 h多酚釋放量的1.04～1.06 倍。結(jié)果表明：體外模擬消化對(duì)食用真菌的影響與體外模擬消化谷物[7,14]、水果[15-18]之間存在一些差異，對(duì)于谷物而言，體外模擬胃酸和生理鹽水處理幾乎對(duì)多酚釋放沒有影響，而胃消化處理可以明顯提高多酚的釋放，谷物經(jīng)胃蛋白酶作用，多酚釋放量是胃0 h的3 倍左右；這主要是因?yàn)楹诿}羊肚菌中游離酚含量較結(jié)合酚高很多，而谷物的結(jié)合酚較游離酚高；結(jié)合酚一般以酯鍵、糖苷鍵的形式與其他物質(zhì)以結(jié)合狀態(tài)存在，在酶消化過(guò)程中，共價(jià)鍵被胃蛋白酶破壞而游離出來(lái)。而對(duì)于水果而言，胃酸處理對(duì)水果多酚的釋放也有一定的加強(qiáng)作用，主要是因?yàn)槎喾雍忘S酮在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定，并且在強(qiáng)酸性環(huán)境下，多酚氧化酶的活性被抑制[19-21]，胃空白組中的多酚氧化酶活性較胃酸組強(qiáng)，部分多酚發(fā)生降解，使得胃空白組的多酚釋放量低于胃酸組的多酚釋放量。胃消化階段和腸消化階段主要是pH值發(fā)生了改變，從強(qiáng)酸性環(huán)境變成中性或弱堿性環(huán)境，pH值的改變可能對(duì)水果及蔬菜樣品中的多酚含量及結(jié)構(gòu)有一定的影響，特別是花青素、兒茶素、槲皮素、黃烷-3-醇[22-25]等對(duì)pH值較為敏感，在堿性環(huán)境中損失比較嚴(yán)重，而槲皮素3-葡萄糖苷、根皮素在腸液中比較穩(wěn)定[17]。從研究結(jié)果看，胰蛋白酶對(duì)多酚釋放有微弱的增強(qiáng)作用，這主要是由于堿性環(huán)境中部分多酚降解，使得多酚含量增加的趨勢(shì)不那么明顯。

圖1 黑脈羊肚菌體外模擬胃消化（A）和腸消化（B）過(guò)程中多酚釋放量的變化Fig. 1 Changes in polyphenol content from Morchella angusticepes Peck during in vitro gastrointestinal digestion

2.2 體外模擬消化對(duì)ORAC值的影響

圖2 黑脈羊肚菌體外模擬胃消化（A）和腸消化（B）過(guò)程中ORAC值的變化Fig. 2 Changes in ORAC of Morchella angusticepes Peck during in vitro gastrointestinal digestion

體外模擬胃、腸消化過(guò)程中ORAC值如圖2所示，模擬消化過(guò)程中ORAC值的變化規(guī)律與多酚釋放的變化規(guī)律相似。模擬胃消化過(guò)程中，ORAC最大值為（20 067.26±343.7） μmol TE/100 g，是胃0 h ORAC值的1.45～1.6 倍。模擬腸消化過(guò)程中ORAC最大值為（22 615.85±3 641.1） μmol TE/100 g，是胃0 h ORAC值的1.47～1.78 倍，腸0 h ORAC值的1.18～1.43 倍。

2.3 體外模擬消化階段多酚釋放量與ORAC值之間的相關(guān)性分析

表1 體外模擬消化過(guò)程中多酚釋放量與ORAC值之間的Pearson系數(shù)Table 1 Pearson correlation between total polyphenol content and ORAC

體外模擬消化過(guò)程中多酚釋放量與ORAC值之間的Pearson系數(shù)如表1所示。在胃消化過(guò)程胃液消化組、胃酸對(duì)照組、空白對(duì)照組的多酚釋放量和ORAC值之間Pearson系數(shù)分別為0.902、-0.369、-0.137，說(shuō)明胃液消化組抗氧化活性主要是由多酚類化合物引起的，胃酸對(duì)照組、空白對(duì)照組多酚釋放量和ORAC值之間相關(guān)性較低，甚至呈負(fù)相關(guān)性。在腸消化過(guò)程中腸液消化組、空白對(duì)照組的多酚釋放量和ORAC值之間Pearson系數(shù)分別為0.849、0.817。由此可見多酚含量與抗氧化能力呈一定的正相關(guān)關(guān)系，腸消化對(duì)黑脈羊肚菌多酚釋放及ORAC值的影響并不明顯，多酚化合物中某些單體的結(jié)構(gòu)可能會(huì)相互影響，從而產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用[26-28]。

2.4 體外模擬胃腸消化對(duì)細(xì)胞抗增殖活性

圖3 黑脈羊肚菌模擬消化后對(duì)HepG2細(xì)胞（A）和Caco-2細(xì)胞（B）抗增殖及毒性的影響Fig. 3 Anti-proliferation activity and cytotoxicity of Morchella angusticepes Peck in HepG2 and Caco-2 cells during gastrointestinal digestion

體外模擬胃、腸消化對(duì)HepG2細(xì)胞增殖作用的影響如圖3A所示。在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的范圍內(nèi)（細(xì)胞毒性質(zhì)量濃度見表2），胃0 h、胃液1 h、胃酸1 h、空白1 h對(duì)HepG2的抑制率分別為41%、45%、33%、30%，抑制作用都比較弱，胃蛋白酶雖然對(duì)多酚釋放有一定的增強(qiáng)作用，但是對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用并不明顯。腸消化的毒性質(zhì)量濃度分別為腸0 h（胃液1 h）、腸液0.5 h、腸空白0.5 h，對(duì)HepG2的抑制率分別為45%、91%、87%；除腸0 h（胃液1 h）對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用較弱外，腸液0.5 h、腸空白0.5 h都較強(qiáng)的抑制HepG2細(xì)胞增殖活性。

圖3B為體外模擬胃、腸消化對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖作用的影響，胃腸消化的毒性質(zhì)量濃度分別為：胃0 h、胃液1 h、胃酸1 h、胃空白、腸0 h（胃液1 h）、腸液0.5 h、腸空白0.5 h，在毒性范圍內(nèi)（細(xì)胞毒性質(zhì)量濃度見表2）對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制率分別為73%、96%、31%、26%、96%、90%、90%。胃0 h、胃液組、腸液組和腸空白組對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，胃空白組和胃酸組對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制作用較弱。研究結(jié)果與趙旭[7]、熊云霞[16]等對(duì)谷物和水果的研究存在差異，趙旭[7]報(bào)道，對(duì)谷物進(jìn)行體外模擬消化處理幾乎完全不能抑制Caco-2細(xì)胞的增殖；熊云霞[16]研究報(bào)道，體外模擬胃消化處理蘋果全果，對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖幾乎不表現(xiàn)出抑制作用，而腸消化處理，對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，但是作用不強(qiáng)。而本研究表明，體外模擬胃、腸消化處理黑脈羊肚菌均能較強(qiáng)抑制Caco-2細(xì)胞的增殖作用。

表2 黑脈羊肚菌模擬消化后對(duì)HepG2和Caco-2細(xì)胞的抗增殖活性（EC50）和毒性的影響Table 2 Anti-proliferation activity (EC50) and cytotoxicity of Morchella angusticepes Peck in HepG2 and Caco-2 cells during gastrointestinal digestion

表2為胃腸消化階段抗氧化物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的抗增殖活性（EC50）和細(xì)胞毒性的影響。胃0 h、胃液1 h、胃酸1 h、胃空白1 h對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性質(zhì)量濃度均小于EC50值，這可能是因?yàn)槲赶A段胃0 h、胃液1 h、胃酸1 h、胃空白1 h均不能明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖導(dǎo)致的。腸消化階段，除腸0 h（胃液1 h）毒性質(zhì)量濃度小于EC50值外，腸液0.5 h、腸空白0.5 h的毒性質(zhì)量濃度均大于EC50值，這說(shuō)明腸消化階段腸液0.5 h、腸空白0.5 h對(duì)HepG2細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。

體外模擬消化對(duì)Caco-2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制作用有所不同，除胃酸1 h和胃空1 h對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性質(zhì)量濃度小于EC50值外，胃0 h、腸0 h（胃液1 h）、腸液0.5 h、腸空白0.5 h對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性質(zhì)量濃度大于EC50值，并且腸消化階段的毒性及抗增殖作用明顯低于胃消化階段，這也進(jìn)一步說(shuō)明pH值的改變可能對(duì)多酚含量和結(jié)構(gòu)的影響都比較大。

2.5 體外模擬消化對(duì)CAA的影響

圖4 HepG2細(xì)胞中ABAP產(chǎn)生的過(guò)氧自由基氧化探針DCFH生成熒光物質(zhì)DCF的動(dòng)力曲線Fig. 4 Kinetic curves of peroxyl radical-induced oxidation of DCFH to DCF in HepG2 cells

圖4顯示了HepG2細(xì)胞中ABAP產(chǎn)生的過(guò)氧自由基氧化探針DCFH生成熒光物質(zhì)DCF的動(dòng)力曲線。由于抗氧化劑能夠猝滅過(guò)氧自由基，因此抗氧化劑處理的孔熒光強(qiáng)度低于未處理的孔，并且抗氧化劑濃度越高或抗氧化能力越強(qiáng)，熒光強(qiáng)度越低。

對(duì)比圖4中A～E可發(fā)現(xiàn)槲皮素的熒光強(qiáng)度隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而減小，而胃0 h、胃液1 h、胃酸1 h、胃空1 h的熒光強(qiáng)度隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大，這說(shuō)明槲皮素的細(xì)胞抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，而胃消化處理的樣品表現(xiàn)出促氧化的作用。對(duì)比圖4中A、C、F、G可發(fā)現(xiàn)，除腸0 h表現(xiàn)出促氧化的作用外，槲皮素、腸空0.5 h、腸液0.5 h表現(xiàn)出抗氧化的作用，并且抗氧化作用隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。由此可見不同的處理方式對(duì)樣品的抗氧化能力有所影響，酶處理及pH值的改變對(duì)抗氧化劑的成分及結(jié)構(gòu)可能會(huì)產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力的改變。

表3 黑脈羊肚菌體外模擬消化后CAA值及EC50值Table 3 CAA values and EC50values of Morchella angusticepesPeck during gastrointestinal digestion

胃、腸消化對(duì)樣品的CAA值及EC50值如表3所示。腸空白0.5 h、腸液0.5 h的CAA值分別為（41.583±0.039）、（70.506±0.011）μmol QE/100 g；腸空白0.5 h、腸液0.5 h的EC50值分別為（13.810±2.352）、（8.872±0.811）mg/mL，腸液0.5 h的CAA值明顯高于腸空白0.5 h的CAA值，而腸液0.5 h的EC50值顯著低于腸空白0.5 h的EC50值（P＜0.01）。由腸液0.5 h的CAA值高于腸空白0.5 h的CAA值，進(jìn)一步說(shuō)明腸消化階段中，胰酶對(duì)抗氧化物質(zhì)的釋放有增強(qiáng)的作用。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)黑脈羊肚菌進(jìn)行體外模擬消化，測(cè)定消化過(guò)程中多酚的釋放及ORAC值的變化發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)多酚的釋放及ORAC值有一定的影響，其中胃蛋白酶的作用較胰蛋白酶明顯；抗增殖結(jié)果表明體外模擬胃、腸消化對(duì)HepG2細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的抗增殖活性存在明顯的差異，其中體外模擬胃消化處理不能明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖，腸消化處理對(duì)HepG2細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用；對(duì)Caco-2細(xì)胞而言，除胃酸組、胃空白組外，胃0 h、胃液組、腸液組和腸空白組對(duì)Caco-2細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用。CAA結(jié)果顯示，體外模擬胃消化處理的樣品表現(xiàn)出促氧化作用，體外模擬腸消化處理的樣品表現(xiàn)出抗氧化作用，抗氧化作用隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增大；并且腸液0.5 h的CAA值（（70.506±0.011）μmol QE/100 g）高于腸空白0.5 h的CAA值（（41.583±0.039）μmol QE/100 g）。比較體外模擬胃、腸消化階段ORAC值及CAA值發(fā)現(xiàn)，兩者之間并不嚴(yán)格一致，這主要是因?yàn)镺RAC主要是對(duì)抗氧化物質(zhì)體外抗氧化活性的研究，而CAA主要是從細(xì)胞水平上對(duì)抗氧化物質(zhì)的吸收、代謝、分布等進(jìn)行的研究。

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Antioxidant and Antiproliferative Activity in Human Cancer Cells of Polyphenols Extracted from Morchella angusticepes Peck Based on in Vitro Simulated Digestion

ZHENG Shaojie1, LIAO Xia1, LU Keke1, LIU Dong2, WU Surui3, MING Jian1,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China; 3. Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives, Kunming 650223, China)

Morchella angusticepes Peck was subjected to in vitro simulated gastrointestinal digestion. Changes in polyphenol content and antioxidant activity in terms of oxygen radical absorption capacity (ORAC) were determined during the digestion process. The anti-proliferative activity and cytotoxicity of digests were measured in HepG2 cells and Caco-2 cells as a function of digestion time. Antioxidant activity was evaluated as well by cellular antioxidant activity (CAA) assay in HepG2 cells. The results showed that after the gastrointestinal digestion, polyphenol content and ORAC were increased significantly. Polyphenol release reached the maximum level and then remained stable after 1 h gastric digestion and 0.5 h intestinal digestion, respectively. The percentage inhibition of HepG2 cells by Morchella angusticepes Peck and its 1 h gastric and 0.5 h intestinal digests were 41%, 45% and 91%, respectively, and the percentage inhibition of Caco-2 cells were 73%, 96% and 90%, respectively. The gastric digests showed pro-oxidant effect, whereas the intestinal digests showed antioxidant capacity. The CAA value of the 0.5 h intestinal digest was (70.506 ± 0.011) μmol QE/100 g md. In conclusion, in vitro digestion of Morchella angusticepes Peck showed anti-proliferation and cellular antioxidant activity, which could provide a theoretical basis for further development and utilization of Morchella angusticepes Peck.

Morchella angusticepes Peck; simulated digestion; polyphenols; oxygen radical absorbance capacity; cellular antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201621040

R151.2

A

1002-6630（2016）21-0234-07

鄭少杰, 廖霞, 盧可可, 等. 基于體外模擬消化的黑脈羊肚菌多酚細(xì)胞抗氧化及抗增殖活性[J]. 食品科學(xué), 37(21): 234-240. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621040. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Shaojie, LIAO Xia, LU Keke, et al. Antioxidant and antiproliferative activity in human cancer cells of polyphenols extracted from Morchella angusticepes Peck based on in vitro simulated digestion[J]. Food Science, 2016, 37(21): 234-240. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621040. http://www.spkx.net.cn

2016-04-14

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2015D035；XDJK2016E113）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471576）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD16B01）

鄭少杰（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：1654633013@qq.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：mingjian1972@163.com