羧甲基茯苓多糖對腸癌小鼠生命延長及對環(huán)磷酰胺的減毒作用

王燦紅，霍小位，何曉山，劉冬羽，李立勇，曹 麗,*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

羧甲基茯苓多糖對腸癌小鼠生命延長及對環(huán)磷酰胺的減毒作用

王燦紅1,2，霍小位1，何曉山2，劉冬羽1，李立勇1，曹 麗1,*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

目的：研究羧甲基茯苓多糖（carboxymethyl pachymaran，CMP）對結(jié)腸癌（CT26）小鼠的生命延長及對環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）的減毒作用。方法：建立小鼠CT26皮下移植瘤模型，減毒增效實驗分為：模型組、CTX組、CMP+CTX組；延長生命實驗分為：模型組、CMP低、中、高劑量組。檢測外周血白細胞（white blood cell，WBC）數(shù)、骨髓有核細胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）數(shù)、腫瘤抑制率、臟器指數(shù)以及腫瘤組織中信號調(diào)節(jié)蛋白-α（signal regulatory protein-α，SIRP-α）和巨噬細胞表面標志物（F4/80）的表達，統(tǒng)計生命延長率和中位生存期。結(jié)果：CMP抑制CTX化療所致的脾臟和胸腺指數(shù)的降低及WBC和BMNC數(shù)量的減少，拮抗肝臟指數(shù)升高，降低SIRP-α和F4/80的表達，并延長小鼠帶瘤生存時間。結(jié)論：CMP明顯減輕CTX的毒副作用，且具有調(diào)節(jié)腫瘤免疫相關(guān)蛋白表達和延長CT26小鼠帶瘤生存時間的作用。

羧甲基茯苓多糖；結(jié)腸癌；免疫調(diào)節(jié)；環(huán)磷酰胺；減毒作用；生命延長

植物多糖為一類天然生物大分子，其來源豐富、成本低廉、無毒且藥理作用廣泛，如杏鮑菇多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖等，它們在抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等方面均取得了良好療效[1-5]，其中抗腫瘤和增強免疫作用是其研究的熱點，尤其與化療藥物合用的減毒增效作用受到廣泛的關(guān)注[6-8]。

茯苓為多孔菌科真菌（Poria cocos (Schw.) Wolf）的干燥菌核，根據(jù)記載茯苓具有利水滲濕、健脾和胃、寧心安神之功效，為一種藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材[9]。茯苓多糖是茯苓的主要成分，其含量占茯苓質(zhì)量的80%以上[10]。未經(jīng)修飾的茯苓多糖幾乎無抗腫瘤活性，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾后的茯苓多糖抗腫瘤及免疫增強作用均明顯提高[11]。天然茯苓多糖先經(jīng)氫氧化鈉堿化、氯乙酸醚化，再加堿二次醚化，最后乙醇沉淀合成羧甲基茯苓多糖（carboxymethyl pachymaran，CMP）。經(jīng)過羧甲基化修飾后的茯苓多糖黏度降低、取代度增加、水溶性升高、抗腫瘤及免疫活性也隨之增強[12]。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）為臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，但其選擇性差，在殺傷腫瘤細胞的同時，對生長旺盛的正常組織也產(chǎn)生嚴重毒副作用，導(dǎo)致機體免疫功能低下，影響患者生活質(zhì)量[13]。目前，CMP已經(jīng)被用于臨床癌癥的輔助治療，能起到提高機體免疫功能、輔助抗腫瘤等作用，但其如何發(fā)揮對化療藥物的減毒增效作用值得深入探討。因此，本研究通過建立小鼠CT26皮下移植瘤模型，研究CMP對CTX的減毒增效作用及對皮下移植荷瘤小鼠帶瘤生存時間的影響，以期為CMP抗腫瘤作用的深入研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與瘤株

健康SPF級，雄性BALB/c小鼠，52 只，體質(zhì)量16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。按嚙齒類動物飼養(yǎng)方法和條件，飼養(yǎng)于SPF級動物房。小鼠保持在12 h明/暗周期，控制相對濕度50%～70%、溫度20～24 ℃，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，食物和水可自行使用。

CT26結(jié)腸癌瘤株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心常規(guī)傳代保存。

1.2 材料與試劑

CMP 湖南補天藥業(yè)股份有限公司。

注射用CTX 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；山羊抗鼠抗體信號調(diào)節(jié)蛋白-α（signal regulatory protein-α，SIRP-α）、巨噬細胞表面標志物F4/80 美國Santa Cruz公司；山羊抗鼠二抗 北京康為世紀生物技術(shù)有限公司；冰醋酸、甲醛及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

BCN-1360生物潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；5410二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Napco公司；MQX 200酶標儀 美國Bio-Tek公司；CKX 41熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Labofuge 400R離心機 德國Heraeus公司；TT快速細胞分析儀 德國Casy Innovatis公司。

1.4 方法

1.4.1 小鼠CT26皮下移植瘤模型的建立、分組及給藥[14]

CT26移植瘤模型制備：將凍存的CT26瘤株復(fù)蘇，用無菌生理鹽水洗3 次計數(shù)并調(diào)整濃度為9.0×107個/mL，小鼠腹腔注射0.1 mL/只，連續(xù)傳2 代。無菌條件下剝離對數(shù)生長期的CT26瘤塊，無菌勻漿器研磨，200目篩網(wǎng)過篩，細胞分析儀計數(shù)活細胞數(shù)≥95%。無菌生理鹽水調(diào)整細胞濃度為6.0×107個/mL，于小鼠右側(cè)腋窩皮下接種，0.1 mL/只，制備CT26皮下移植瘤小鼠模型。

CT26腫瘤模型小鼠分組、給藥：接種24 h后，其中24 只CT26小鼠，隨機分為模型組、CTX組和CMP+CTX組，每組8 只。模型組小鼠腹腔注射生理鹽水；CTX組腹腔注射CTX 20 mg/（kg·2 d）（以小鼠體質(zhì)量計，腹腔注射體積0.1 mL/10 g，灌胃體積0.2 mL/10 g，下同）；CMP+CTX組，灌胃給予CMP 200 mg/（kg·d），腹腔注射CTX 20 mg/（kg·2 d），以上各組均連續(xù)給藥14 d；用于CMP對CTX減毒增效實驗。

另外28 只CT26小鼠，又隨機分為模型組、CMP低劑量組、CMP中劑量組、CMP高劑量組，每組7 只。模型組灌胃給予蒸餾水；CMP低、中、高劑量組，分別灌胃給藥50、100、200 mg/（kg·d），以上各組均連續(xù)給藥21 d；用于觀察CMP對CT26腫瘤小鼠的生命延長實驗。

1.4.2 CMP對CTX減毒增效實驗指標檢測

1.4.2.1 CT26模型小鼠體質(zhì)量、腫瘤抑瘤率及臟器指數(shù)的測定

末次給藥后，稱體質(zhì)量，摘眼球取血并頸椎脫臼處死小鼠，剝離皮下瘤塊、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟，用電子天平精密稱質(zhì)量，分別按式（1）和（2）計算抑瘤率和臟器指數(shù)。

1.4.2.2 CT26模型小鼠外周血白細胞（white blood cell，WBC）數(shù)的測定

末次給藥1 h后，剪小鼠尾尖，取血10 μL，加入190 μL 3%的稀醋酸，稀釋20 倍，輕彈EP管使紅細胞充分裂解，采用血細胞計數(shù)板法在顯微鏡下計數(shù)。

1.4.2.3 CT26模型小鼠骨髓有核細胞的測定

脫臼處死動物，剝離右側(cè)股骨，用1 mL注射器吸取0.5 mL Hank’s液通過針頭反復(fù)沖洗骨髓，用3%稀醋酸稀釋10 倍后，于血細胞計數(shù)板上計數(shù)骨髓有核細胞數(shù)。

1.4.2.4 免疫組化法檢測CT26模型小鼠腫瘤組織中SIRP-α和F4/80表達

剝離腫瘤組織稱質(zhì)量后，剪取部分組織置于10%的甲醛溶液中固定，將固定好的組織進行流水沖洗、梯度酒精脫水，然后浸蠟、包埋，切取6 μm薄片，烤干、脫蠟、蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，封閉一抗、二抗，中性樹脂封片。免疫組化鏡檢觀察，腫瘤組織中SIRP-α和F4/80的表達情況，然后，對于蛋白陽性表達部分用Image Pro-Plus 6.0軟件進行量化分析，用平均積分光密度（integral optical density，IOD）值反應(yīng)表達狀況。

1.4.3 CMP對CT26皮下移植瘤小鼠生命延長情況的影響

連續(xù)給藥21 d期間，觀察動物狀態(tài)、死亡時間，并記錄，按照公式（3）～（5）分別計算CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠的生命延長率、中位生存期（median survival time，MST）及相對生存時間（T/C）。

式中：t1為給藥組平均存活時間/d；t2為對照組平均存活時間/d。

式中：t為中間生存時間/d；n1為中間生存時間死亡的小鼠只數(shù)；n2為每組小鼠數(shù)的中間數(shù)。

式中：TMST為治療組中位生存期/d；CMST為對照組中位生存期/d。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計學(xué)處理軟件SPSS 17.0，對實驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分析，Sig.值大于0.05，具有正態(tài)性的進行單因素方差分析、t檢驗，比較組間差異性，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)統(tǒng)計的χ2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠臟器指數(shù)的影響

表1 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠臟器指數(shù)的影響（，n=8）Table 1 Effect of CMP on visceral organ indexes of CT26-bearing mice (n= 8)

表1 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠臟器指數(shù)的影響（，n=8）Table 1 Effect of CMP on visceral organ indexes of CT26-bearing mice (n= 8)

注：*. 與模型組相比差異顯著（P＜0.05）；#. 與CTX組相比差異顯著（P＜0.05）；##. 與CTX組相比差異極顯著（P＜0.01）。

脾臟指數(shù)/（mg/g）組別劑量/（mg/kg）胸腺指數(shù)/（mg/g）肝臟指數(shù)/（mg/g）腎臟指數(shù)/（mg/g）模型組8.94±2.260.90±0.1143.56±4.2315.38±1.67 CTX組20 3.98±0.46*0.69±0.05*50.33±2.07*16.49±1.55 CMP+CTX組200+205.66±1.33*#0.96±0.10##45.90±3.90#16.87±1.40

由表1可知，與模型組相比，CTX導(dǎo)致CT26荷瘤小鼠的臟器指數(shù)發(fā)生明顯改變，脾臟和胸腺指數(shù)分別下降了55.48%（P＜0.05）和23.33%（P＜0.05），肝臟指數(shù)明顯升高了13.45% （P＜0.05）；而相比CTX組，CMP與CTX合用后，可部分恢復(fù)CTX改變的臟器指數(shù)，其中脾臟和胸腺指數(shù)分別升高42.21%（P＜0.05）和39.13%（P＜0.01），肝臟指數(shù)則顯著降低了8.80%（P＜0.05）。另外，CTX對CT26模型小鼠的腎臟指數(shù)有一定程度的提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，給予CMP對腎臟指數(shù)也無明顯影響。

2.2 CMP對CTX抗腫瘤作用的影響

表2 CMP對CTX抗腫瘤作用的影響（，n=8）Table 2 Influence of CMP on the antitumor effect of CTX in CT26-bearing mice (n= 8)

表2 CMP對CTX抗腫瘤作用的影響（，n=8）Table 2 Influence of CMP on the antitumor effect of CTX in CT26-bearing mice (n= 8)

注：**. 與模型組相比差異極顯著（P＜0.01）。

組別劑量/（mg/kg）瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組1.90±0.15 CTX組20 1.25±0.12**34.34 CMP+CTX組200+201.17±0.1338.12

由表2可知，與模型組相比，CTX和CMP+CTX組瘤質(zhì)量均明顯減輕（P＜0.01）。但與CTX組相比，給予CMP后瘤質(zhì)量無明顯減輕；表明CMP無明顯增強CTX抗CT26的作用。

2.3 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠WBC數(shù)和骨髓有核細胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）數(shù)的影響

表3 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠WBC和BMNC數(shù)的影響（x±s，n=8）Table 3 Effect of CMP on?peripheral?white blood cells and?bone marrow nucleated cells of CT26 mice (x± s, n= 8)

由表3可知，與模型組相比，CTX顯著降低CT26模型小鼠WBC和BMNC水平，分別降低了57.98%（P＜0.01）和74.38%（P＜0.01）。而相比CTX組，給予CMP后WBC和BMNC水平分別升高26.74%（P＜0.05）和141.94%（P＜0.05）。

2.4 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠腫瘤組織中SIRP-α和F4/80表達的影響

SIRP-α和F4/80參與腫瘤的免疫逃逸、侵襲和轉(zhuǎn)移等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖1、2。SIRP-α和F4/80的陽性表達見圖中被染成棕褐色的細胞。與模型組相比，CTX和CMP+CTX組SIRP-α和F4/80的表達均明顯減少（P＜0.001），并且CMP+CTX組中SIRP-α和F4/80的表達量明顯少于CTX組（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 CMP對腫瘤組織中SIRP-α表達的影響（×40）Fig. 1 Effect of CMP on the expression of SIRP-α in tumor tissues of CT26-bearing mice (× 40)

圖2 CMP對腫瘤組織中F4/80表達的影響（×40）Fig. 2 Effect of CMP on the expression of F4/80 in tumor tissue of CT26-bearing mice (× 40)

2.5 CMP給藥對CT26結(jié)腸癌小鼠生命延長的影響

表4 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠生存時間的影響（n=7）Table 4 Effect of CMP on the life cycle of CT26 mice (n= 7)

圖3 CMP對CT26結(jié)腸癌小鼠生存曲線的影響（n=7）Fig. 3 Survival curve of CT26-bearing mice subjected to CMP treatment (n = 7)

由表4和圖3可知，與模型組相比，CMP低、中、高劑量組均延長結(jié)腸癌小鼠的生存期，其生命延長率分別為3.69%、16.8%和24.59%；中位生存期分別為35.00、36.00 d和48.75 d，明顯高于模型組的29.75 d。相對生存時間 （T/C）用來表示實驗治療的效果，T/C＞120%認為藥物有效，結(jié)果顯示CMP中和CMP高劑量組T/C值均＞120%，表明即使單用CMP對延長CT26腸癌小鼠的生存期就有較顯著效果。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，CT26荷瘤小鼠給予CTX（20 mg/kg），引起臟器指數(shù)異常、WBC和BMNC水平下降等非特異性免疫功能低下，與文獻[15-16]報道一致。而CMP則明顯拮抗CTX引起的免疫及造血功能異常，顯示其對CTX有較好的減毒作用。

但在協(xié)同CTX對腸癌CT26的抑瘤作用上CMP增效作用不明顯。本課題組前期在體外應(yīng)用小鼠S180肉瘤、人白血病K562、人宮頸癌HeLa和人胃癌AGS等細胞觀察到CMP均未顯示體外抗癌活性。同時考察CMP體內(nèi)對S180、小鼠Lewis肺癌等腫瘤的抑制作用，最高抑瘤率僅為30%，表明其體內(nèi)抑瘤活性也不顯著（本實驗未顯示結(jié)果）。這與文獻報道的CMP體內(nèi)對小鼠S180肉瘤抑制率達35.27%[17]相似。因此，認為CMP在腫瘤治療中主要起到減低化療藥物毒性、改善腫瘤微環(huán)境及增強免疫功能等。

信號調(diào)節(jié)蛋白SIRP-α和表皮生長因子跨膜家族糖蛋白F4/80，均是腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞等的表面標志物，主要參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸及炎癥等過程，在腫瘤組織中高度表達，促進腫瘤生長和炎癥發(fā)生[18-21]。本研究顯示，與模型組相比，CTX和CMP+CTX組SIRP-α和F4/80的表達均明顯減少，且CMP+CTX組中SIRP-α和F4/80的表達明顯少于單用CTX組，提示CMP可能具有增強巨噬細胞的吞噬作用、改善腫瘤的炎性微環(huán)境，阻礙腫瘤相關(guān)巨噬細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

研究報道，CMP（300 mg/kg）使白血病p388小鼠生命延長35.88%，與化療藥物CTX合用后生存期延長到70.05%[22]。本實驗結(jié)果也顯示，單用CMP能明顯延長CT26小鼠帶瘤生存周期，生命延長率最高可達24.59%，且有量效關(guān)系，提示CMP單用能明顯改善腸癌荷瘤小鼠的生存質(zhì)量，延長帶瘤生存周期，而與化療藥物合用可能有更好的生命延長效果，這值得進一步探討。

綜上所述，CMP在小鼠腸癌化療輔助用藥中可減輕化療藥物毒副作用，調(diào)節(jié)免疫功能，改善腫瘤微環(huán)境、提高生活質(zhì)量及延長帶瘤生存時間。但其聯(lián)合化療藥物是否延長生命周期，其減毒、調(diào)節(jié)腸癌免疫炎癥微環(huán)境的具體分子機制還有待進一步探究。

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Effect of Carboxymethyl Pachymaran on Life Extension and Attenuation of Cyclophosphamide-Induced Toxicity in CT26 Tumor-Bearing Mice

WANG Canhong1,2, HUO Xiaowei1, HE Xiaoshan2, LIU Dongyu1, LI Liyong1, CAO Li1,*
(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China; 2. Department of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China)

Objective: To investigate the effect of carboxymethyl pachymaran (CMP) on life extension of colon tumor 26 (CT26)-bearing mice and mitigating the side effects caused by chemotherapy with cyclophosphamide (CTX). Methods: CT26 tumor-bearing mouse models were established by subcutaneous transplantation into mice, and they were randomly divided into model, CTX and CTX + CMP groups for toxicity test. The model, and low-, medium- and high-dose CMP, groups were used for life extension test. Peripheral white blood cells (WBC), bone marrow nucleated cells (BMNC), percentage tumor inhibition, and visceral organ indexes were tested by biochemical assays. The expression of signal regulating protein alpha (SIRP-α) and macrophage surface marker (F4/80) in tumor tissues were detected through immunohistochemistry. Meanwhile, life extension rate and median survival period were observed. Results: CMP could increase the lower spleen index and thymus index, and the decreased levels of WBC and BMNC induced by CTX, antagonize the increase in liver index, and reduce the expression of SIRP-α and F4/80 in tumor tissues. In addition, CMP also could extend the survival time of CT26 tumor-bearing mice. Conclusion: CMP can obviously reduce the side effects of CTX, regulate the expression of tumor immune-related proteins, and prolong the survival time of CT26 tumor -bearing mice.

carboxymethyl pachymaran (CMP); colon cancer; immune regulation; cyclophosphamide (CTX); reducing toxicity; life extending

10.7506/spkx1002-6630-201621039

R285.5

A

1002-6630（2016）21-0229-05

王燦紅, 霍小位, 何曉山, 等. 羧甲基茯苓多糖對腸癌小鼠生命延長及對環(huán)磷酰胺的減毒作用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 229-233. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621039. http://www.spkx.net.cn

WANG Canhong, HUO Xiaowei, HE Xiaoshan, et al. Effect of carboxymethyl pachymaran on life extension and attenuation of cyclophosphamide-induced toxicity in CT26 tumor-bearing mice[J]. Food Science, 2016, 37(21): 229-233. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621039. http://www.spkx.net.cn

2015-12-22

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2012ZX09501001-004；2012ZX09301-002-001-026）

王燦紅（1986—），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥理與應(yīng)用。E-mail：xinzhuangjianpo@163.com

*通信作者：曹麗（1966—），女，研究員，博士，研究方向為天然藥物抗腫瘤藥理學(xué)。E-mail：lcao@implad.ac.cn