• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    原桃膠中1 株芽孢桿菌的分離鑒定及其主要抗菌物質(zhì)

    2016-12-02 02:21:06陸兆新
    食品科學(xué) 2016年21期
    關(guān)鍵詞:桃膠抗菌肽芽孢

    賈 銳,陸兆新

    (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

    原桃膠中1 株芽孢桿菌的分離鑒定及其主要抗菌物質(zhì)

    賈 銳,陸兆新*

    (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

    從天然原桃膠分離到1 株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的芽孢桿菌TJ12。其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)和串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)有抑菌活性。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)、16S rRNA序列和gyrB序列將TJ12菌株鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。通過(guò)硫銨沉淀、有機(jī)溶劑萃取、羥丙基葡聚糖凝膠、高效液相色譜分離純化,得到其主要活性物質(zhì)。該物質(zhì)對(duì)pH值、溫度和3 種蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶)有較好的穩(wěn)定性。經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜分析,初步鑒定該株地衣芽孢桿菌TJ12的主要抗菌物質(zhì)為桿菌肽A。

    原桃膠;地衣芽孢桿菌;抗菌物質(zhì);分離純化;鑒定;桿菌肽A

    抗菌肽(antimicrobial peptide)是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì),它是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分??咕木哂歇?dú)特殺菌機(jī)制和抗菌廣譜性,不易造成病原菌的耐藥性。一些抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞有廣譜殺滅活性效果,為癌癥患者提供了一類新型的抗癌藥物[1-2],其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[3]、飼料添加劑[4]、食品防腐劑[5]等方面也具有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前抗菌肽已經(jīng)成功應(yīng)用在馬鈴薯、煙草、水稻等的病蟲害防治中[6]。由于其在醫(yī)藥、養(yǎng)殖、食品、生物防治等方面有很高的應(yīng)用價(jià)值,抗菌肽的研究備受人們關(guān)注和青睞。

    微生物來(lái)源的抗菌肽是抗菌肽家族中的重要一員,它能特異性殺死競(jìng)爭(zhēng)菌而對(duì)宿主本身無(wú)害,包括環(huán)形肽、糖肽和脂肽,如短桿菌肽、桿菌肽、多黏菌素和乳酸鏈球菌肽等[6]。其中芽孢桿菌(Bacillus spp.)是研究較多的抗菌肽產(chǎn)生菌,其在自然界分布非常廣泛,生理特性豐富多樣,是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)種群之一。目前研究較多的芽孢桿菌有:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、多黏芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)等[7-9]。

    桃樹膠是桃樹樹干受機(jī)械創(chuàng)傷(如蟲咬、切傷等)或病菌感染致病后分泌出來(lái)的膠質(zhì)半透明物質(zhì),有較好的保健功能[10-11]。原桃膠是在樹上自然風(fēng)干未經(jīng)除雜的桃膠。國(guó)內(nèi)外涉及桃膠的文獻(xiàn)多數(shù)是關(guān)于防治病蟲害、提高樹體抵抗力以減少桃膠分泌等方面[12],鮮見(jiàn)桃膠中相關(guān)微生物及抗菌肽等抑菌活性物質(zhì)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從原桃膠中分離出一株具抑菌活性的芽孢桿菌,并對(duì)這株芽孢桿菌主要抗菌物質(zhì)進(jìn)行研究,以期為人們更深入地開(kāi)發(fā)、利用相關(guān)資源提供一定的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種

    芽孢桿菌TJ12系從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桃樹林的原桃膠中分離得到。

    指示細(xì)菌:藤黃微球菌(Mirococcus luteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、大腸桿菌(Escherichia coli);指示真菌:串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)、黑曲霉(Aspergillus nige)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)。以上均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

    1.1.2 試劑

    LB培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[13-14]中的方法配制;糖發(fā)酵培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基等的配制均參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]。

    菌株DNA提取試劑 上海生物工程有限公司;酵母提取物和胰化蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司;革蘭氏染色試劑盒 杭州百思生物技術(shù)有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP 日本TaKaRa公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒美國(guó)Omega公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.3 儀器與設(shè)備

    Centrifuge 5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;PTC-100TM 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國(guó)MJ Research公司;全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;HT6029超凈工作臺(tái) 蘇州進(jìn)化設(shè)備有限公司;BL-220H電子精密天平 日本島津公司;Orion 3 STAR pH計(jì) 美國(guó)Thermo公司;Eclipse 80i光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司;UltiMate 3000反相高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 美國(guó)戴安公司;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 德國(guó)Bruker Daltonics公司;BS-100A自動(dòng)分布收集儀、HL-2B數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠。

    1.2 方法

    1.2.1 抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選

    初篩:取10 g天然刮取的原桃膠,放入裝有100 mL生理鹽水的錐形瓶中,37 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)液80 ℃水浴處理20 min,制成一定稀釋梯度的菌懸液,分別取0.1 mL于LB平板涂布,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。分別將得到的單菌落采用無(wú)菌牙簽分散轉(zhuǎn)接于另一無(wú)菌LB平板,37 ℃條件下培養(yǎng)36 h。用無(wú)菌打孔器于生長(zhǎng)菌落旁取出5 mm直徑的瓊脂塊,貼放于含有指示菌的平板表面,37 ℃條件下培養(yǎng)12 h,觀察抑菌圈大小。

    復(fù)篩:將經(jīng)初篩得到的抑菌圈較大的菌株劃線,將單菌落接種液體LB培養(yǎng)基,37 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液4 ℃、14 000 r/min離心15 min,上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌,將除菌后的發(fā)酵上清液通過(guò)平板打孔法檢測(cè)抗菌物質(zhì)活性。

    抑菌活性檢測(cè):各取50 μL過(guò)膜除菌后的不同樣品加到5 mm的抑菌平板孔徑中,37 ℃培養(yǎng)12 h以上,根據(jù)抑菌圈的大小判斷供試菌株的抑菌活性。每個(gè)供試菌株設(shè)3 次重復(fù)。將得到的抑菌活性最好的菌株保藏菌種。

    1.2.2 菌株鑒定

    1.2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定

    參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]對(duì)菌株TJ12進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)性分析及生理生化實(shí)驗(yàn)(生長(zhǎng)溫度、耐酸堿度、運(yùn)動(dòng)性、耐鹽性、接觸酶、淀粉水解、V.P、甲基紅、硝酸鹽還原、碳源利用、硫化氫)[15-20]。

    1.2.2.2 基于16S rDNA和gyrB基因序列的分子生物學(xué)鑒定

    對(duì)抑菌活性較強(qiáng)、抗菌譜較廣的菌株進(jìn)行基因組DNA提取、16S rRNA基因及gyrB基因PCR擴(kuò)增,割膠回收,回收產(chǎn)物同pMD-19載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞DH5α,篩選得到的陽(yáng)性克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序所得16S rRNA序列及gyrB基因校對(duì)后,與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析,根據(jù)序列同源性,選取不同的模式菌株,采用MEGA(Ver. 5.0)軟件的Neighbor-Joining phylogenetic tree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的種屬關(guān)系[21-23]。

    1.2.3 抗菌物質(zhì)分離純化[24-28]

    1.2.3.1 硫酸銨分級(jí)沉淀[26,29]

    分別采用飽和度20%~90%的硫酸銨梯度對(duì)發(fā)酵上清液(1.2.1節(jié)復(fù)篩步驟得到的上清液)進(jìn)行分級(jí)沉淀處理,沉淀離心,超純水復(fù)溶,以藤黃微球菌為指示菌,瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性[19],確定最適硫酸銨分級(jí)沉淀?xiàng)l件。在合適條件下收集足量沉淀,超純水復(fù)溶,做進(jìn)一步純化處理。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

    1.2.3.2 有機(jī)溶劑萃取

    分別用2 倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)抗菌物質(zhì)水溶液進(jìn)行萃取,選取最適有機(jī)溶劑。將最適有機(jī)溶劑下萃取得到的有機(jī)相45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,沉淀甲醇溶解,做進(jìn)一步純化處理。每個(gè)處理重復(fù)3 次[30]。

    1.2.3.3 LH-20分離純化

    將Sephadex LH-20充分溶脹后裝柱(1.6 cm× 120 cm),80%甲醇平衡2 個(gè)柱體積后,取1 mL甲醇復(fù)溶樣品進(jìn)行SephadexLH-20柱分離,研究最適分離條件。餾分收集后,以藤黃微球菌為指示菌,瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)其抑菌活性[30]。

    1.2.4 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究

    將經(jīng)LH-20純化后收集到的足量活性物質(zhì)旋蒸干燥后,超純水復(fù)溶作為樣品,探究其穩(wěn)定性。所有穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以藤黃微球菌作指示菌,瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)其抑菌活性,方法同復(fù)篩[26,31]。

    1.2.4.1 pH值穩(wěn)定性

    取5 mL樣品6 份,分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)至2、4、6、8、10、12,室溫處理10 h,測(cè)活性前將pH值調(diào)回7,以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照(CK),測(cè)試抑菌活性,每個(gè)處理重復(fù)3 次。

    1.2.4.2 熱穩(wěn)定性

    處理1:取5 mL樣品5 份,分別于20、40、60、80、100 ℃水浴處理3 h,121 ℃條件下處理15 min,以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照(CK),測(cè)試抑菌活性,每個(gè)處理重復(fù)3 次。

    處理2:取5 mL樣品5 份,分別于20、40、60、80、100 ℃水浴處理6 h,121 ℃條件下處理35 min,以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照(CK),測(cè)試抑菌活性,每個(gè)處理重復(fù)3 次。

    1.2.4.3 蛋白酶穩(wěn)定性

    胰蛋白酶:首先用pH 8.0的磷酸緩沖液將胰蛋白酶配成質(zhì)量濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、2.80 mg/mL的酶液。取7 支刻度試管,每支試管中添加0.5 mL抗菌提取物,1~5號(hào)管中加入以上5 種不同質(zhì)量濃度酶液2 mL。6號(hào)管(CK1)不加酶液,僅加入2 mL磷酸緩沖液,作為抗菌物質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶處理后活性是否發(fā)生變化的參照。1~6號(hào)管置37 ℃水浴6 h,100 ℃條件下水浴3 min終止酶活。7號(hào)管(CK2)不加酶液和緩沖液pH值調(diào)到8.0。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    蛋白酶K:處理方法與胰蛋白酶相同,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    胃蛋白酶:胃蛋白酶用pH 2.0磷酸緩沖液配制,1~5號(hào)管中加入的胃蛋白酶質(zhì)量濃度依次為50、100、150、200、250 μg/mL,6號(hào)管(CK1)中僅加入緩沖液。1~6號(hào)管經(jīng)過(guò)水浴處理、終止酶活性后,需將pH值調(diào)回7.0。7號(hào)管(CK2)不進(jìn)行任何處理,其他處理方法與胰蛋白酶相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.2.5 活性物質(zhì)全波長(zhǎng)掃描、反相HPLC法檢測(cè)及電噴霧離子化質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectrometry ESI-MS)分析[32-34]

    將LH-20收集的活性組分用UV-2450分光光度計(jì)于190~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,以確定其特征吸收峰并作為反相HPLC法的檢測(cè)波長(zhǎng)。反相HPLC條件為:Agilent HC-C18柱(4.6 mm×250 mm,0.5 μm);進(jìn)樣量20 μL;柱溫35 ℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;流速0.8 mL/min;檢測(cè)時(shí)間50 min;流動(dòng)相A相為水-0.1%三氟乙酸,B相為乙腈-0.1%三氟乙酸(按10 min:15% A,85% B;30 min:30% A,70% B;50 min:50% A,50% B程序分離)。樣品和流動(dòng)相在上柱前都經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。收集經(jīng)反相HPLC分離得到的各個(gè)峰,于臺(tái)式快速離心濃縮干燥器上濃縮后以藤黃微球菌為指示菌測(cè)定各個(gè)峰的抑菌活性。收集主要活性物質(zhì),再次用反相HPLC檢測(cè)活性物質(zhì)純度,以確保樣品的純度適合進(jìn)行ESI-MS分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株的篩選

    經(jīng)過(guò)初篩與復(fù)篩,得到一株抑菌譜較廣的菌株TJ12,其發(fā)酵上清液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果較好,對(duì)部分真菌有一定的抑菌效果(表1)。

    表1 菌株TJ12發(fā)酵液對(duì)指示菌抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of the fermentation broth from strain TJ12

    由圖1可知,菌株TJ12發(fā)酵上清液對(duì)藤黃微球菌抑菌效果較好,對(duì)金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌有一定抑菌效果,但對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯抑菌效果。發(fā)酵上清300 倍濃縮液對(duì)串珠鐮刀菌有較好的抑菌活性,對(duì)黑曲霉和葡枝根霉抑菌效果不明顯,對(duì)釀酒酵母無(wú)明顯抑菌效果。說(shuō)明菌株TJ12對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果較明顯,對(duì)部分真菌有一定抑菌效果。

    圖1 菌株TJ12發(fā)酵液對(duì)指示菌抑菌作用Fig. 1 Photographs showing the antibacterial activity of the fermentation broth from strain TJ12

    2.2 菌株TJ12的分類鑒定

    2.2.1 形態(tài)特征

    菌體短桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性、芽孢中生、菌落米黃色(圖2未顯示)、飽滿凸起、表面濕潤(rùn)有光澤,菌落形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)變化,早期菌落邊緣光滑整齊,12 h后菌落四周邊沿逐漸出現(xiàn)凸起,含大量透明黏液,48 h后菌落中間皺起,邊緣仍存在光滑飽滿黏液泡(圖2)。

    圖2 菌株TJ12的培養(yǎng)特征Fig. 2 Cultural characteristics of strain TJ12

    2.2.2 生理生化特征

    表2 菌株TJ12生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain TJ12

    菌株TJ12具有運(yùn)動(dòng)性;接觸酶反應(yīng)、V.P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、甲基紅實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性;菌株能分解利用大部分碳源,其中α-乳糖、山梨醇、肌醇利用速率較慢(大于5 d觀察到陽(yáng)性結(jié)果),但不能利用鼠李糖、棉子糖;其耐鹽性為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0~10% NaCl范圍,但質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)菌體生長(zhǎng)很緩慢;其生長(zhǎng)pH值范圍為5~9;生長(zhǎng)適應(yīng)溫度范圍為28~50 ℃(表2)。

    綜合以上培養(yǎng)特征及生理生化特征,并根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,初步將TJ12菌株鑒定為芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)[15-16]。

    2.2.3 16S rRNA、gyrB序列分析

    圖3 以16S rRNA(A)和gyrB(B)序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic relationship based on 16SrRNA (A) and gyrB (B) sequences

    16S rRNA序列測(cè)序后采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)BLAST比對(duì),菌株TJ12的16S rRNA序列與GenBank中的空氣芽孢桿菌(Bacillus aerius)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillus sonorensis)及地衣芽孢桿菌16S rRNA序列相似性均達(dá)99%。再通過(guò)gyrB序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),菌株TJ12的gyrB基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中地衣芽孢桿菌相似度達(dá)到100%(圖3)。

    綜合TJ12菌株的生理生化特征、形態(tài)學(xué)特征、16S rRNA和gyrB基因序列同源性分析結(jié)果,將菌株TJ12鑒定為地衣芽孢桿菌[15-16,35-39]。

    2.3 抑菌活性物質(zhì)分離純化及鑒定

    2.3.1 硫酸銨分級(jí)鹽析

    當(dāng)硫酸銨飽和度在20%~90%之間時(shí),沉淀溶解液均存在抑菌活性;飽和度達(dá)到70%時(shí),沉淀溶解液的活性達(dá)到最大,但上清液中仍含有較多活性物質(zhì);當(dāng)飽和度達(dá)到80%~90%時(shí),上清液中殘留的活性物質(zhì)已較少且降低幅度變緩。硫酸銨飽和度小于20%時(shí)沉淀中存在較多雜蛋白,鹽濃度過(guò)高對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不便,參照文獻(xiàn)[28]選擇在20%~80%硫酸銨飽和度下沉淀析出的抑菌活性物質(zhì)作進(jìn)一步純化處理(圖4)。

    圖4 不同飽和度硫酸銨沉淀抑菌活性Fig. 4 Antimicrobial activity of precipitates with different saturation degrees of ammonium sulfate

    2.3.2 有機(jī)溶劑萃取

    表3 不同有機(jī)溶劑萃取相抑菌效果Table 3 Antimicrobial activity of extraction phases of different organic solvents

    3 種有機(jī)溶劑極性依次為石油醚<乙酸乙酯<正丁醇,石油醚、乙酸乙酯均不能有效地提取抗菌物質(zhì),而正丁醇能將活性物質(zhì)完全萃取,說(shuō)明該活性物質(zhì)為極性物質(zhì)(表3)。故選取正丁醇作為有效的萃取試劑。

    2.3.3 Sephadex LH-20分離純化

    圖5 Sephadex LH-20分離抗菌物質(zhì)Fig. 5 Purification of the antimicrobial substance by Sephadex LH-20 column chromatography

    65 份組分中,第22~25管組分有抑菌活性,24管組分的抑菌活性最高(圖5)。收集足量22~25管組分濃縮。以超純水復(fù)溶樣品探究物質(zhì)穩(wěn)定性;甲醇復(fù)溶樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,并在最大吸收波長(zhǎng)下研究反相HPLC分析條件以進(jìn)行純度檢測(cè)。

    2.4 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性

    圖6 菌株TJ12抗菌物質(zhì)的pH值(A)、溫度(B)和蛋白酶(C)穩(wěn)定性Fig. 6 Stability of the antimicrobial substance produced by TJ12

    菌株TJ12抗菌物質(zhì)在經(jīng)過(guò)pH 2~12處理10 h都有抑菌活性,說(shuō)明該抗菌物質(zhì)的pH值穩(wěn)定性較好。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pH 2~4的條件下溶液會(huì)出現(xiàn)少量沉淀,而pH 6~10環(huán)境下,物質(zhì)能完全溶解,說(shuō)明該物質(zhì)pH值穩(wěn)定性較好,但偏中性或堿性環(huán)境下溶解性更好(圖6A)。該物質(zhì)在低于100 ℃條件下處理6 h,抑菌活性都比較穩(wěn)定,沸水浴中處理6 h后活性僅略有降低,121 ℃處理35 min后才能徹底失活。說(shuō)明該物質(zhì)具有較好的溫度穩(wěn)定性(圖6B)??咕镔|(zhì)隨著胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶質(zhì)量濃度的增加,處理6 h后的抗菌物質(zhì)活性基本沒(méi)有變化,說(shuō)明該物質(zhì)有較好的蛋白酶穩(wěn)定性(圖6C)。綜上,菌株TJ12主要抗菌物質(zhì)具有較好的穩(wěn)定性,為其實(shí)際應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

    2.5 活性物質(zhì)全波長(zhǎng)掃描

    抑菌活性物質(zhì)在約210 nm和255 nm波長(zhǎng)處都有吸收波長(zhǎng),其中210 nm為最大吸收波長(zhǎng)(圖7),選擇以210 nm作為反相HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)。

    圖7 TJ12抗菌物質(zhì)全波長(zhǎng)掃描圖譜Fig. 7 Full-wavelength scanning spectrum of the antimicrobial substance from TJ12

    2.6 反相HPLC檢測(cè)與分離

    經(jīng)Sephadex LH-20分離后,在210 nm波長(zhǎng)處按1.2.5節(jié)方法進(jìn)行反相HPLC分離檢測(cè)。經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其主要活性峰為峰1(圖8),通過(guò)反相HPLC分離收集足量活性單峰1,濃縮后用于質(zhì)譜分析。

    圖8 反相HPLC檢測(cè)抗菌物質(zhì)Fig. 8 RT-HPLC separation of the antifungal substance produced by TJ12

    2.7 活性物質(zhì)ESI-MS鑒定

    多數(shù)多肽類化合物帶有多電荷,電荷數(shù)和豐度常不穩(wěn)定,質(zhì)譜將其碎裂后得到的可能是帶有2 個(gè)或者更多電荷的離子。圖9為TJ12主要抑菌活性物質(zhì)ESI-MS圖,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),將TJ12主要抑菌活性物質(zhì)鑒定為桿菌肽A(相對(duì)分子質(zhì)量1 422)[40-42],圖譜中還可以看到出自于桿菌肽A帶3 個(gè)正電荷的分子離子峰m/z 475和帶2 個(gè)正電荷的分子離子峰m/z 712,其中帶兩個(gè)正電荷的分子離子峰豐度較強(qiáng)[43-44]。桿菌肽屬多肽類抗生素,由地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生,是由12 個(gè)氨基酸組成含有噻唑環(huán)的多肽復(fù)合體,它是多種氨基酸結(jié)合而成的多肽,桿菌肽A是其最主要的成分[42]。桿菌肽由于其高效、無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、不產(chǎn)生交叉耐藥性及抗藥性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè),其在飼料添加劑方面也有廣泛的應(yīng)用前景[45-46]。

    圖9 菌株TJ12抗菌物質(zhì)的ESI-MS 圖Fig. 9 ESI mass spectra of the antimicrobial substance produced by TJ12

    3 討 論

    利用細(xì)菌、真菌分泌的抗菌物質(zhì),尤其是肽類物質(zhì),研制的抗菌藥物,為醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供無(wú)殘留、無(wú)環(huán)境污染、不產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題的新一代抗菌藥物,是現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。但目前人們對(duì)其原材料尤其是相關(guān)微生物的抑菌活性成分沒(méi)有研究。

    本研究從天然桃樹上刮取原桃膠作為研究對(duì)象,篩選分離得到菌株TJ12,其發(fā)酵上清液對(duì)藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌,以及串珠鐮刀菌等真菌具有抑菌效果,但對(duì)革蘭氏陰性菌幾乎沒(méi)有抑菌效果。用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分類方法對(duì)菌株TJ12的特性進(jìn)行鑒別,結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列和gyrB基因序列分析,菌株TJ12被鑒定為地衣芽孢桿菌。該株菌培養(yǎng)過(guò)程中,固體平板上形態(tài)特別,菌落四周產(chǎn)生大量黏稠泡狀突起,液體發(fā)酵液極度黏稠,推測(cè)其生長(zhǎng)過(guò)程中分泌大量糖類物質(zhì),不確定此生理特征與其所生長(zhǎng)的桃樹膠環(huán)境是否相關(guān)。對(duì)地衣芽孢桿菌胞外多糖功能有過(guò)初步報(bào)道,但研究尚不成熟,鑒于多糖具有抗氧化、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、抵抗有害菌、促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的作用,從而使機(jī)體增強(qiáng)抗腫瘤、抗衰老等能力,該株桃樹膠來(lái)源的地衣芽孢桿菌TJ12具備多糖方向的研究潛力[47-48]。

    TJ12菌株在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,能夠分泌抗菌物質(zhì)。硫酸銨分級(jí)沉淀研究表明,20%~80%硫酸銨飽和度下析出的活性物質(zhì)可用作進(jìn)一步萃取處理。通過(guò)有機(jī)溶劑萃取實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),極性較大的正丁醇萃取效果較好。用Sephadex LH-20進(jìn)一步分離純化出抑菌活性物質(zhì),檢測(cè)其在210 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)。

    抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究中,所設(shè)置的pH值和溫度范圍較廣,在pH 2~10范圍內(nèi)仍保持較好的穩(wěn)定性,120 ℃條件下處理35 min才能徹底失活。同時(shí)對(duì)蛋白酶設(shè)置較寬的作用濃度范圍,分別通過(guò)3 種不同蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶)的處理,抗菌物質(zhì)活性幾乎沒(méi)有變化。說(shuō)明該物質(zhì)具備較好的穩(wěn)定性。

    最終通過(guò)反相HPLC分離純化、ESI-MS分析,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),推測(cè)其主要活性物質(zhì)為桿菌肽A,其相對(duì)分子質(zhì)量為1 422,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果較好。研究表明,桿菌肽為一種多肽類抗生素,可特異地抑制細(xì)菌胞壁合成階段的脫磷酸化作用,影響磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)和向細(xì)胞壁支架輸送黏肽,抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成,并損傷細(xì)胞膜,導(dǎo)致離子和氨基酸外流而使細(xì)菌死亡[42]。桿菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有強(qiáng)大的抑菌活性,對(duì)某些革蘭氏陰性球菌、放線菌和真菌有一定的活性[42,49-50]。

    本研究為進(jìn)一步利用原桃膠這種資源奠定了一定理論基礎(chǔ)。該菌株的代謝產(chǎn)物及其抗菌物質(zhì)有望在疾病治療、生物防治、飼料防腐等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用,是一株有應(yīng)用價(jià)值的抗菌物質(zhì)產(chǎn)生菌。同時(shí)該菌株的篩選、鑒定、物質(zhì)分離方法也為相關(guān)物質(zhì)的研究提供一定的參考。

    [1] 夏麗潔, 張富春. 抗菌肽抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2014, 26(8): 809-813. DOI:10.13376/j.cbls/2014115.

    [2] LU Jie, CHEN Zhengwang. Isolation, characterization and anti-cancer activity of SK84, a novel glycine-rich antimicrobial peptide from Drosophila virilis[J]. Peptides, 2010, 31(1): 44-50. DOI:10.1016/ j.peptides.2009.09.028

    [3] 陳奕彬, 胡娟, 楊憲寬, 等. 抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè), 2015, 36(12): 36-39. DOI:10.13302/j.cnki.fi.2015.12.008.

    [4] 褚永康, 林英庭. 抗菌肽在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 45(6): 97-98.

    [5] 王玲. 抗菌肽的研究現(xiàn)狀及在食品防腐保鮮中的應(yīng)用前景[J]. 食品工業(yè), 2011, 32(8): 97-98.

    [6] 張煜, 劉瑋, 丁漢鳳, 等. 抗菌肽的研究進(jìn)展及在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(3): 433-434. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2006.03.014.

    [7] 尹昆侖, 王嘉榕, 孫紅賓. 抗菌肽的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2015, 35(5): 181-185.

    [8] 高兆建, 樊陳, 鞠民友, 等. 枯草芽孢桿菌抗菌肽在食品防腐中的應(yīng)用性研究[J]. 徐州工程學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 28(2): 67-72. DOI:10.3969/j.issn.1674-358X.2013.02.013.

    [9] 張淑梅, 沙長(zhǎng)青, 趙曉宇, 等. 一株抗真菌內(nèi)生多粘芽孢桿菌的分離鑒定及對(duì)水稻惡苗病菌的抑制作用[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2010, 30(2): 84-88.

    [10] 金光, 何明忠, 廖汝玉. 桃流膠病的發(fā)生及防治[J]. 福建果樹, 2000(4): 59. DOI:10.3969/j.issn.1004-6089.2000.04.031.

    [11] 張璇. 桃樹膠研究進(jìn)展[J]. 糧食與食品工業(yè), 2011, 18(1): 29-31.

    DOI:10.3969/j.issn.1672-5026.2011.01.009.

    [12] 黃雪松. 桃膠的性質(zhì)、加工及其開(kāi)發(fā)利用[J]. 特產(chǎn)研究, 2004, 26(1): 47-51. DOI:10.3969/j.issn.1001-4721.2004.01.015.

    [13] 李順鵬. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 58-68.

    [14] 陳聲明. 微生物學(xué)研究技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006: 77-100.

    [15] 布坎南. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 729-736.

    [16] 東秀珠, 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 349-386.

    [17] ZHANG Xiaohui, GAO Jie, ZHAO Fangbo, et al. Characterization of a salt-tolerant bacterium Bacillus sp. from a membrane bioreactor for saline wastewater treatment[J]. Journal of Environmental Sciences, 2014, 26(6): 1369-1374. DOI:10.1016/S1001-0742(13)60613-0.

    [18] 段春華, 劉幸紅, 牛贍光, 等. 一株拮抗細(xì)菌的鑒定及對(duì)植物炭疽病菌作用效果測(cè)定[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 26(3): 94-97. DOI:10.3969/j.issn.1001-8581.2014.03.025.

    [19] 楊勝遠(yuǎn), 韋錦, 李云, 等. 一株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(21): 208-212.

    [20] 應(yīng)璐, 周慧杰, 蔣慧. 駱駝刺源產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌分離鑒定和菌株特性研究[J]. 中國(guó)釀造, 2014, 33(10): 14-17. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2014.10.004.

    [21] 喻國(guó)輝, 牛春艷, 陳遠(yuǎn)鳳, 等. 利用16S rDNA結(jié)合gyrA和gyrB基因?qū)ι姥挎邨U菌R31的快速鑒定[J]. 中國(guó)生物防治, 2010, 26(2): 160-166. DOI:1005-9261(2010)02-0160-07.

    [22] 郝云婕, 韓素貞. gyrB基因在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2008(2): 39-41.

    [23] 李天芝, 于新友, 李書光, 等. 基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌PCR快速檢測(cè)方法的建立[J]. 飼料博覽, 2015(3): 29-31. DOI:10.3969/ j.issn.1004-1729.2013.03.007.

    [24] 劉靜, 王軍, 姚建銘, 等. 枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2004, 44(4): 511-514. DOI:10.3321/ j.issn:0001-6209.2004.04.023.

    [25] 樊陳, 高兆建, 張桂英, 等. 地衣芽孢桿菌抗菌肽的純化及抗菌特性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29(33): 313-318.

    [26] 紀(jì)明山, 張俊龍, 趙鉑錘, 等. 地衣芽孢桿菌SDYT-79抗病物質(zhì)分離純化及理化性質(zhì)分析[J]. 農(nóng)藥, 2014, 53(6): 411-413. DOI:1006-0413(2014)06-0411-03.

    [27] 別小妹, 陸兆新, 呂鳳霞, 等. Bacillus subtilis fmbR抗菌物質(zhì)的分離和鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 39(11): 2327-2334. DOI:10.3321/ j.issn:0578-1752.2006.11.024.

    [28] 鄧陽(yáng). Paenibacillus polymyxa JSa-9抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定及小麥生防應(yīng)用研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012: 65-87.

    [29] 邵雪玲. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 武漢: 武漢大學(xué)出版社, 2003: 22-35.

    [30] 喻昕. 生物藥物分離技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 17-179.

    [31] 別小妹, 呂鳳霞, 陸兆新, 等. 枯草芽孢桿菌fmbR抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(6): 104-108. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2006.06.020.

    [32] 杜斌. 現(xiàn)代色譜技術(shù)[M]. 鄭州: 河南醫(yī)科大學(xué)出版社, 2001: 69-107.

    [33] 張艷華, 李影, 巨芳, 等. 高效液相色譜分離純化多肽的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2009, 17(5): 34-36. DOI:10.3969/ j.issn.1006-9577.2009.09.011.

    [34] 帕拉馬尼克. 電噴霧質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 29-271.

    [35] 戈登. 芽孢桿菌屬[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1983: 6-41.

    [36] SHIVAJI S, CHATURVEDI P, SURESH K, et al. Bacillus aerius sp. nov., Bacillus aerophilus sp. nov., Bacillus stratosphericus sp. nov. and Bacillus altitudinis sp. nov., isolated from cryogenic tubes used for collecting air samples from high altitudes[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2006, 56(7): 1465-1473. DOI:10.1099/ijs.0.64029-0.

    [37] 劉桂君, 朱婷婷, 劉紅霞, 等. 清香大曲及酒醅中地衣芽孢桿菌的分離鑒定[J]. 釀酒科技, 2010(1): 31-35. DOI:10.13746/ j.njkj.2010.01.010.

    [38] REY M W, RAMAIYA P, NELSON B A, et al. Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species[J]. Genome Biology, 2004, 5(10): R77. DOI:10.1186/gb-2004-5-10-r77.

    [39] 黃福祥, 馬建彬, 朱西儒, 等. 地衣芽孢桿菌菌株鑒定和生化特征的研究[C]//第三屆全國(guó)綠色環(huán)保農(nóng)藥新技術(shù)、新產(chǎn)品交流會(huì)暨第二屆全國(guó)生物農(nóng)藥研討會(huì)論文集. 北京: 第三屆全國(guó)綠色環(huán)保農(nóng)藥新技術(shù)、新產(chǎn)品交流會(huì)暨第二屆全國(guó)生物農(nóng)藥研討會(huì), 2004: 111-113.

    [40] HUSSEIN A A, AL-JANABI S. Identification of Bacitracin produced by local isolate of Bacillus licheniformis[J]. African Journal of Biotechnology, 2006, 5(18): 1600-1601. DOI:10.5897/ AJB2006.000-5068.

    [41] SIEGEL M M, HUANG Jinfan, LIN Baiwei, et al. Structures of bacitracin A and isolated congeners: sequencing of cyclic peptides with blocked linear side chains by electrospray ionization mass spectrometry[J]. Biological Mass Spectrometry, 1994, 23(4): 186-204. DOI:10.1002/bms.1200230403.

    [42] National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database; CID=65281[DB/OL]. (2016-07-11)[2015-12-25]. https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/65281.

    [43] 林維宣, 孫興權(quán), 田苗, 等. 動(dòng)物組織中粘桿菌素、桿菌肽及維吉尼霉素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2009, 28(2): 212-215. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2009.02.018.

    [44] 劉琪, 孫雷, 張?bào)P. 牛奶中粘菌素和桿菌肽殘留的固相萃取超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2011, 45(7): 17-20. DOI:10.3969/j.issn.1002-1280.2011.07.006.

    [45] 周欣, 李寶庫(kù). 桿菌肽的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J]. 科技信息, 2010(14): 92-93. DOI:10.3969/j.issn.1001-9960.2010.14.079.

    [46] 何晶晶, 朱倩倩, 許藝珊, 等. 桿菌肽研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2015, 36(3): 36-37. DOI:10.3969/j.issn.1672-5190.2015.03.016.

    [47] 彭愛(ài)銘, 佟建明, 崔建云, 等. 地衣芽孢桿菌TS-01胞外多糖功能的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(增刊1): 158-162. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2004.z1.038.

    [48] 楊陽(yáng), 張付云, 蒼桂璐, 等. 地衣芽孢桿菌生物活性物質(zhì)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2013, 3(1): 22-26. DOI:10.3969/ j.issn.2095-2341.2013.01.05.

    [49] 余清梅, 王明茲, 林清強(qiáng), 等. 桿菌肽合成分子機(jī)制及高產(chǎn)策略[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2013(3): 28-33. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646(X).2013.03.008.

    [50] MING L J, EPPERSON J D. Metal binding and structure-activity relationship of the metalloantibiotic peptide bacitracin[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2002, 91(1): 46-58. DOI:10.1016/S0162-0134(02)00464-6.

    Isolation and Identification of a Bacillus from Peach Tree Gum and Its Main Antimicrobial Substance

    JIA Rui, LU Zhaoxin*
    (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

    A strain of Bacillus named as TJ12 was isolated from peach tree gum, which could produce antibacterial substances. Its fermentation products had antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus cereus and Fusarium moniliforme. Through colony morphology, physiological and biochemical characterization and 16S rRNA and gyrB sequence analysis, the strain was identified as Bacillus licheniformis. The major bioactive substance was separated from its fermentation supernatant and purified by ammonium sulfate precipitation, organic solvent extraction, Sephadex LH-20 column chromatography and high performance liquid chromatography. The major bioactive substance had strong resistance to pH, temperature, and three proteases (trypsin, proteinase K, and pepsin). By electrospray ionization-mass spectrometry analysis, we preliminarily identified this substance as bacitracin A.

    peach tree gum; Bacillus licheniformis; antimicrobial substances; separation and purification; identification; bacitracin A

    10.7506/spkx1002-6630-201621024

    TS201.3

    A

    1002-6630(2016)21-0136-08

    賈銳, 陸兆新. 原桃膠中1 株芽孢桿菌的分離鑒定及其主要抗菌物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 136-143. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621024. http://www.spkx.net.cn

    JIA Rui, LU Zhaoxin. Isolation and identification of a Bacillus from peach tree gum and its main antimicrobial substance[J]. Food Science, 2016, 37(21): 136-143. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621024. http://www.spkx.net.cn

    2016-01-02

    國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31271936)

    賈銳(1990—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail:13776618980@163.com

    *通信作者:陸兆新(1957—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:fmb@njau.edu.cn

    猜你喜歡
    桃膠抗菌肽芽孢
    抗菌肽的生物學(xué)特性及在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用
    解淀粉芽孢桿菌Lx-11
    解淀粉芽孢桿菌的作用及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)
    側(cè)孢短芽孢桿菌A60
    廣西恭城桃膠現(xiàn)“朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”端倪
    桃膠能否成為“新美容圣品”
    堪比燕窩的美容佳品:桃膠
    新型抗菌肽菌絲霉素純化工藝研究
    廣東飼料(2016年5期)2016-12-01 03:43:21
    抗菌肽修飾方法與抗菌機(jī)制的研究進(jìn)展
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    亚洲精华国产精华精| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 91在线精品国自产拍蜜月| av女优亚洲男人天堂| 免费黄网站久久成人精品 | 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品日韩av在线免费观看| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲人与动物交配视频| 窝窝影院91人妻| 日本黄色视频三级网站网址| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久色成人| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一进一出好大好爽视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 波多野结衣高清无吗| 深夜精品福利| av女优亚洲男人天堂| 淫妇啪啪啪对白视频| 在线a可以看的网站| 精品久久久久久,| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 直男gayav资源| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲最大成人中文| 国产真实乱freesex| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜影院日韩av| 亚洲精品成人久久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久久久久久久黄片| 长腿黑丝高跟| 最近视频中文字幕2019在线8| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲精华国产精华精| 久99久视频精品免费| 免费在线观看亚洲国产| 午夜福利成人在线免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 全区人妻精品视频| 丰满的人妻完整版| 成年人黄色毛片网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日本黄色视频三级网站网址| 国产成年人精品一区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产av麻豆久久久久久久| 我的老师免费观看完整版| 亚洲18禁久久av| 禁无遮挡网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费看a级黄色片| 18禁在线播放成人免费| 欧美丝袜亚洲另类 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产不卡一卡二| 亚洲黑人精品在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久香蕉精品热| 国产精品,欧美在线| 午夜免费激情av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲精品亚洲一区二区| av在线天堂中文字幕| 欧美3d第一页| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本在线视频免费播放| 亚洲电影在线观看av| 亚洲综合色惰| 亚洲国产色片| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品人妻视频免费看| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲av成人av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 无遮挡黄片免费观看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲五月天丁香| 又爽又黄a免费视频| 国产精品久久久久久久电影| 成年女人永久免费观看视频| 一级黄片播放器| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人午夜高清在线视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美黄色片欧美黄色片| or卡值多少钱| 99riav亚洲国产免费| 国产亚洲欧美98| 一本精品99久久精品77| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲av五月六月丁香网| 91字幕亚洲| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美最新免费一区二区三区 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 少妇的逼水好多| 国产精品影院久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产激情偷乱视频一区二区| 搡老岳熟女国产| 久久亚洲真实| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品一区av在线观看| 免费大片18禁| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲av一区综合| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲av免费在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚州av有码| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一区福利在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99精品在免费线老司机午夜| 五月伊人婷婷丁香| 在现免费观看毛片| 欧美日本视频| 亚洲综合色惰| 久久99热6这里只有精品| 日韩国内少妇激情av| 日本 av在线| 青草久久国产| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久久成人免费电影| 欧美乱妇无乱码| 久久久久久久久中文| 久久国产乱子免费精品| a在线观看视频网站| 可以在线观看毛片的网站| 国产男靠女视频免费网站| 欧美激情在线99| 中文在线观看免费www的网站| 国产一区二区三区视频了| 国产黄a三级三级三级人| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产黄色小视频在线观看| 日韩高清综合在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费观看精品视频网站| 在线观看66精品国产| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 露出奶头的视频| 日本一二三区视频观看| 欧美3d第一页| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲经典国产精华液单 | 99久国产av精品| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲国产精品999在线| 午夜福利在线观看吧| 九色国产91popny在线| 成人国产一区最新在线观看| 日韩高清综合在线| 18+在线观看网站| 亚洲精品日韩av片在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 人妻久久中文字幕网| 动漫黄色视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久久久久久久久| 国产高潮美女av| 免费看美女性在线毛片视频| 中文字幕久久专区| 日本 av在线| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲专区国产一区二区| 欧美性感艳星| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品国产三级普通话版| 可以在线观看的亚洲视频| 国内精品久久久久精免费| 亚洲美女黄片视频| 免费观看的影片在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产成人欧美在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 一区二区三区四区激情视频 | 日日干狠狠操夜夜爽| 成人美女网站在线观看视频| 久久这里只有精品中国| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久精品综合一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产欧美日韩精品亚洲av| 91麻豆av在线| 嫩草影视91久久| 夜夜爽天天搞| 久久久久久久久久成人| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 搞女人的毛片| 床上黄色一级片| 欧美极品一区二区三区四区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人精品一区二区免费| 十八禁网站免费在线| 国产成人欧美在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 禁无遮挡网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜福利在线在线| 午夜福利18| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产三级在线视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 少妇高潮的动态图| 国产精品女同一区二区软件 | 国内精品美女久久久久久| 两个人视频免费观看高清| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 少妇丰满av| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品1区2区在线观看.| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲片人在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 一级黄色大片毛片| 国产高清有码在线观看视频| 欧美日本视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| av在线老鸭窝| 一进一出好大好爽视频| 亚洲avbb在线观看| 精品久久久久久,| av女优亚洲男人天堂| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲性夜色夜夜综合| 真实男女啪啪啪动态图| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 一区二区三区免费毛片| 欧美不卡视频在线免费观看| 日本免费a在线| 成人欧美大片| 一二三四社区在线视频社区8| 91麻豆av在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 乱码一卡2卡4卡精品| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 熟女电影av网| 一区二区三区免费毛片| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产91精品成人一区二区三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精华一区二区三区| 全区人妻精品视频| 性色avwww在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 免费大片18禁| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 有码 亚洲区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 黄色女人牲交| 内地一区二区视频在线| 精品久久久久久久久亚洲 | 国产精品99久久久久久久久| av在线天堂中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩中字成人| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 给我免费播放毛片高清在线观看| 中文字幕高清在线视频| 精品国产三级普通话版| 一级黄片播放器| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 特大巨黑吊av在线直播| h日本视频在线播放| 亚洲av美国av| 久99久视频精品免费| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产成人影院久久av| 一个人看的www免费观看视频| 性色av乱码一区二区三区2| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 窝窝影院91人妻| 天堂动漫精品| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av成人av| 国产欧美日韩精品一区二区| 成年女人永久免费观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 亚州av有码| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品亚洲av一区麻豆| 男人舔奶头视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 日韩免费av在线播放| 真人一进一出gif抽搐免费| 一区二区三区激情视频| 久久久色成人| 国产免费av片在线观看野外av| 国产亚洲欧美98| 午夜福利在线在线| 最新在线观看一区二区三区| 色在线成人网| 亚洲一区高清亚洲精品| 搡老岳熟女国产| 欧美3d第一页| www日本黄色视频网| 亚洲一区高清亚洲精品| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美bdsm另类| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲第一电影网av| 我的女老师完整版在线观看| 九色国产91popny在线| 国产精品一及| 欧美一级a爱片免费观看看| 美女黄网站色视频| 免费观看精品视频网站| 久久精品综合一区二区三区| 丁香六月欧美| 国产黄a三级三级三级人| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费在线观看日本一区| 丰满乱子伦码专区| 国产精品不卡视频一区二区 | 十八禁国产超污无遮挡网站| av国产免费在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产私拍福利视频在线观看| 99riav亚洲国产免费| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国模一区二区三区四区视频| 国产探花极品一区二区| 色综合站精品国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美成人性av电影在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲av美国av| 桃色一区二区三区在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费人成在线观看视频色| av在线观看视频网站免费| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人精品一区二区免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成人av在线播放网站| 少妇的逼水好多| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久国产成人精品二区| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美激情国产日韩精品一区| 嫩草影院精品99| 别揉我奶头 嗯啊视频| 无遮挡黄片免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲一区二区三区色噜噜| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 久久久久久久午夜电影| 精品久久久久久久久久久久久| 国产男靠女视频免费网站| 精品一区二区三区视频在线| 色5月婷婷丁香| 欧美一区二区国产精品久久精品| 九色国产91popny在线| 亚洲片人在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av五月六月丁香网| 午夜福利免费观看在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产美女午夜福利| 女同久久另类99精品国产91| a级毛片免费高清观看在线播放| a级一级毛片免费在线观看| 香蕉av资源在线| 中出人妻视频一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲五月婷婷丁香| 天天一区二区日本电影三级| 日韩欧美免费精品| 亚洲午夜理论影院| 88av欧美| 直男gayav资源| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 99久久精品一区二区三区| 热99在线观看视频| 99热这里只有是精品在线观看 | 亚洲最大成人av| 色综合欧美亚洲国产小说| 好男人电影高清在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 国产乱人伦免费视频| 偷拍熟女少妇极品色| 国产综合懂色| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲人成网站在线播| av在线观看视频网站免费| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲性夜色夜夜综合| 免费人成在线观看视频色| 久久久久久久久大av| 成人亚洲精品av一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 美女免费视频网站| 最近在线观看免费完整版| ponron亚洲| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品电影一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 青草久久国产| 精品国产亚洲在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 18禁在线播放成人免费| 久久久久久久久中文| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 在线观看舔阴道视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩中字成人| 国产精品久久电影中文字幕| 精品人妻视频免费看| 日本黄色片子视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美最新免费一区二区三区 | 99久久成人亚洲精品观看| 午夜a级毛片| 人妻久久中文字幕网| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜激情福利司机影院| 久久精品人妻少妇| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国内精品美女久久久久久| 亚洲人与动物交配视频| av中文乱码字幕在线| 美女高潮的动态| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 久久精品国产自在天天线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久精品国产清高在天天线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲中文日韩欧美视频| 成年女人永久免费观看视频| 午夜视频国产福利| 久久久久久大精品| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美日韩乱码在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| a级毛片a级免费在线| 成人精品一区二区免费| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 中文字幕av在线有码专区| 我的女老师完整版在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 美女大奶头视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 中文字幕av在线有码专区| 精品久久国产蜜桃| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美性感艳星| 欧美日韩国产亚洲二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 亚洲无线在线观看| 赤兔流量卡办理| 欧美日韩乱码在线| h日本视频在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 男人和女人高潮做爰伦理| 日本黄大片高清| 午夜激情福利司机影院| 国产三级在线视频| 99久国产av精品| 黄色女人牲交| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av免费在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 亚州av有码| 看免费av毛片| 成年女人永久免费观看视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲内射少妇av| 色综合婷婷激情| 嫩草影院精品99| 91狼人影院| 久久久久久久精品吃奶| 国产乱人伦免费视频| 久久午夜福利片| 网址你懂的国产日韩在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 一个人看的www免费观看视频| 久久午夜亚洲精品久久| ponron亚洲| 国产麻豆成人av免费视频| 成人国产一区最新在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲18禁久久av| 国产精品电影一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 最近中文字幕高清免费大全6 | 精品久久久久久久久久免费视频| 国产av不卡久久| 一本综合久久免费| 岛国在线免费视频观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久亚洲真实| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99久久精品国产亚洲精品| 国产三级中文精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲最大成人av| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产高清有码在线观看视频| 小说图片视频综合网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美在线黄色| www.熟女人妻精品国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费av观看视频| 免费观看人在逋| 伦理电影大哥的女人| 欧美成狂野欧美在线观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲不卡免费看| 变态另类丝袜制服| 中文资源天堂在线| 日本a在线网址| 一区二区三区激情视频| 国内精品久久久久久久电影| 日本与韩国留学比较| 欧美另类亚洲清纯唯美| 宅男免费午夜| 人人妻人人看人人澡| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久精品91蜜桃| 成年免费大片在线观看| 久久久久久久久大av| 国内精品久久久久精免费| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲五月天丁香| 国内精品美女久久久久久| 久久99热6这里只有精品| 国产一区二区在线观看日韩| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品久久久久久久久av| 特级一级黄色大片| 日本一二三区视频观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 |